包合技術增強抗菌藥物抗菌療效研究進展

洪 冕，黃佳敏，陳冬梅,2，謝書宇*

(1.國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)，華中農業大學，武漢 430070；2.國家獸藥安全評價實驗室(HZAU)，華中農業大學，武漢 430070)

1 研究背景

細菌性感染是危害動物健康的重要因素，通常根據感染部位的不同而呈現出不同癥狀，嚴重者亦可發展成敗血癥或膿毒血癥，最終導致動物死亡。抗菌藥是指能夠有效抑制或殺滅細菌，用于預防和治療細菌性感染的藥物。其可大致分為人工合成抗菌藥以及天然抗生素兩類。人工合成抗菌藥主要包括有磺胺類、喹諾酮類、呋喃類等，其中磺胺類是抗生素開始應用于抗菌治療前的細菌性感染主治藥物[1]。第一種抗生素——青霉素則由亞歷山大·弗萊明于1928年發現，并在19世紀40年代開始應用于臨床治療，對二戰期間士兵細菌性感染的控制發揮重要作用[2]。此后近百年間，抗生素被廣泛研究并大規模使用。

抗菌藥物的使用降低了細菌性感染所致的高發病率及死亡率，有效維護人與動物生命建康，同時也提高了畜禽生產效率，實現動物性食品的穩定供應，有效避免畜牧業經濟損失。然而，其過度使用亦引起了嚴重的耐藥性問題。細菌通過表達滅活酶、酶促修飾、降低細胞膜通透性、改變作用靶位、改變代謝途徑、形成生物被膜以及主動外排等方式抵抗藥物殺傷作用[3]。研究表明，早在青霉素被發現并使用之前，便已有了耐青霉素葡萄球菌菌株的存在[4]。細菌不斷增強的耐藥性，導致抗菌藥物治療效果減弱。而若加大抗菌藥物劑量以期增強療效，則又會給機體帶來過重負擔，提高毒副作用發生幾率。大劑量的抗菌藥物還極可能在動物體內形成殘留，降低動物性產品質量。同時，由于耐藥菌的耐藥基因可傳遞至子代或其他種屬細菌，因此耐藥菌能不斷擴散及污染周邊區域。動物性食品中的耐藥菌更是可借助食物鏈直接感染人甚至將耐藥基因轉移至人體內病原菌中，進一步危害人體健康。此外，細菌適應性的突變進化必將導致新型耐藥菌不斷出現，不斷降低已有抗菌藥物療效。據報道，世界衛生組織(WHO)已于2015年將抗微生物藥物耐藥性列為全球十大健康威脅之一[5]。面對日益嚴峻的細菌耐藥性威脅，人們迫切需要尋找新方法來提高傳統抗菌藥物治療效果。

包合技術是指在一定條件下，將一種分子完全或部分嵌入另一種空穴結構分子內部的技術[6]。包合物，即通過包合技術形成的絡合物。其不僅能有效提高抗菌藥物穩定性及溶解度，促進藥物體內吸收，增加生物利用度，亦可協助藥物穿越細菌生物膜及細胞膜，提高藥物的抗菌效率。因此，將抗菌藥物制備成包合物，可作為解決細菌耐藥性問題的新方案。本文將簡要概述包合技術的發展歷史、增強抗菌藥物活性應用現狀以及提高抗菌藥物藥效學機制，以期為獸藥研究者提供些許思路和借鑒。

2 包合技術發展歷程

1886年，Mylius觀察到某些揮發性化合物可以與對苯二酚形成包合物，他通過X-射線衍射發現三分子的對苯二酚可以形成籠狀結構，而某些氣體或液體分子則被包裹于籠中[7]。

1916年，德國化學家Wieland通過X-射線分析觀察到膽酸與其親脂且水不溶性伴侶之間會形成水溶性包合物(如絡合膽酸便是由去氧膽酸和脂肪酸形成的包合物)，并得出“膽汁酸原理”[8]。該發現使其獲得1927年諾貝爾化學獎[9]。

1940年，Bengen在測量牛奶中脂肪含量時發現正辛醇和尿素在水相與脂相間形成了一種結晶(即尿素-辛醇包合物)，在去除牛奶后這種結晶依然可以形成[10]。后經研究發現，尿素可與含4個碳原子以上的直鏈化合物形成結晶型尿素包合物[11]。這種特性開始被應用于分離純化脂肪族化合物，即尿素包合法[12]。

Freudenberg、Cramer和Plieninger等人在20世紀30年代開始對環糊精進行研究并于1953年獲得專利，他們證明環糊精包合物可以保護易氧化物質不被氧化、提高難溶藥物溶解度以及減少高揮發性物質損失等[13]。在早期，人們針對小分子物質的環糊精包合技術進行研究。隨著環糊精在溶液中可與高分子物質產生包合反應這一性能被發現，對高分子物質的環糊精包合技術研究也開始增多[6]。

20世紀50年代Higuchi和Zuck闡明了包合現象的固有特性，自此包合技術開始應用于藥學領域[6]。1967年，Pedersen合成了冠醚并發現了其與堿性金屬陽離子的選擇性絡合特性[14]。基于Pedersen的工作，Cram開展了一系列關于主——客體化學的研究，認為高度結構化的配合物是合成有機化合物的中心[15]。1968年，Lehn合成了能與多種金屬離子形成包合物的籠狀分子，并首次提出“超分子化學”概念[16]。1987年，Pedersen、Cram同Lehn一起獲得諾貝爾化學獎。在超分子化學引起人們注意的同時，與超分子主體分子有關的包合技術也開始受到關注[6]。

時至今日，以包合物為基礎的藥物，尤其是以β-環糊精(β-CD)為主體、其他藥物為客體所制成的包合物已經被廣泛研究。

3 包合技術增強抗菌藥物活性應用現狀

目前，包合技術在抗菌藥物制劑研制方面的應用主要集中于增強療效及提高生物利用度，以期實現減抗，避免耐藥性問題的進一步發展。例如，Hsiung等人通過靜電紡絲技術將支鏈淀粉/四環素-環糊精包合物轉化成抗菌納米纖維，其在唾液中易崩解，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌的抑菌圈均寬于游離四環素，這可能是包合物形式增加了四環素溶解度所致[17]。甲硝唑作為一種溶解性差的抗生素，其臨床應用受到一定限制。Celebioglu等人將其同羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)制備成包合物以提高溶解性，外溶出曲線結果顯示該包合物前30 s藥物溶解量是甲硝唑粉末的4.2～5.1倍[18]。萬古霉素是目前治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染最有效的抗生素。Salih等人用β-CD和油酰胺構成的兩親性衍生物包合萬古霉素以增強其遞送，同游離萬古霉素相比，該包合物對金黃色葡萄球菌以及MRSA的最小抑菌濃度(MIC)分別降低了2倍和4倍，并具有更強的胞內細菌清除能力[19]。

4 包合技術提高抗菌藥物藥效學機制

4.1 提高抗菌藥物的穩定性 包合物結構能將抗菌藥物同外部惡劣環境隔開，進而提高藥物穩定性。美羅培南作為一種治療耐藥性細菌感染的常用抗菌藥物，其化學不穩定性影響了臨床療效[20]。美羅培南結構中的羰基即是親核攻擊重要位點，也是導致其化學不穩定性的關鍵所在。Paczkowska等人利用β-CD制備美羅培南包合物，通過封閉羰基提高了其穩定性[21]。恩諾沙星同HP-β-CD制備而成的包合物在擁有較好穩定性的同時也具有較高溶解度，其于4 ℃環境中密封儲存6個月，內載恩諾沙星含量并無明顯變化[22]。利福平對結核病的治療功效因其溶解性差以及穩定性低而被限制。通過捏合法制備利福平的無環葫蘆脲包合物可有效提高其光穩定性，試驗表明，暴露于強光10 d后，該包合物中利福平含量仍高達97.93±0.52%，而在相同條件下普通利福平含量則降低至95.19±0.46%[23]。納他霉素在極端pH值和光照條件下易被破壞從而喪失抗真菌能力，將納他霉素封裝于甲基-β-環糊精中絡合成包合物，可保留抗真菌活性同時有效緩解極端pH條件下的降解，此外包合物內納他霉素在紫外光照射下的保留率也比游離納他霉素高出1倍以上[24]。

4.2 提高抗菌藥物溶解度 某些抗菌藥物由于溶解度偏低而無法最大程度發揮其抗菌作用。包合物空腔內部具有疏水特性，可避免藥物與外部水環境直接接觸，間接增加疏水性抗菌藥物溶解性，減少藥物使用劑量[25]。研究表明，用HP-β-CD制備的恩諾沙星包合物，可使恩諾沙星溶解度提高916倍[22]。Anjum等人通過共蒸發法制備了漆樹酸(AnAc)與HP-β-CD的包合物，AnAc水溶性提高了2009倍，同時對金黃色葡萄球菌展示出更高的抗菌及抗生物膜活性[26]。Siva等人采用超聲技術制備了分別含枯茗醛(CA)和異丁香酚(ISOE)的甲基-β-環糊精包合物，它們使得CA和ISOE溶解度提高10倍及12倍，同時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有更強抑制作用[27]。

4.3 提高抗菌藥物的吸收及生物利用度 環糊精可通過細胞旁途徑和跨細胞途徑促進機體對抗菌藥物的吸收。一方面，其降低了刷狀緣膜囊泡中緊密連接相關蛋白claudin-4的表達，通過暫時性破壞緊密連接從而協助藥物分子進入細胞間隙及血液[28]。另一方面，其能提取質膜結構成分，破壞脂質雙分子層剛性并增加膜流動性，促進藥物分子的跨細胞轉運[28]。因此，將抗菌藥物同環糊精制備成包合物，可改善機體對藥物的吸收，提高抗菌藥物生物利用度。例如，姜黃素作為一種具有強大抗菌效果的光敏劑，因水溶性低和腸膜滲透性差導致生物利用度偏低，這在一定程度上限制了其臨床治療效果。Li等人將姜黃素同環糊精絡合以形成包合物，有效促進了機體對姜黃素的吸收，其AUC0-∞增加了2.6～2.8倍[28]。Ding等人運用HP-β-CD制備的恩諾沙星包合物，AUC0-∞高達25.97 μg·h/mL，是游離恩諾沙星的2.08倍，這顯著提高了恩諾沙星生物利用度[22]。阿昔洛韋因飽和吸收機制而存在一定的吸收問題，口服生物利用度僅有15～30%，若將其包封進HP-β-CD中，該包合物的AUC0-∞則提升為游離阿昔洛韋的1.5倍[29]。Fan等人通過攪拌法制備了氟苯尼考與HP-β-CD的包合物，其凍干粉末注射液比氟苯尼考商業注射液吸收速度更快、吸收量更高且消除半衰期延長，有效提高了氟苯尼考生物利用度[30]。

4.4 利用緩釋性能增強抗菌藥物在體內作用時間 包合物類似于微型膠囊，具有持續釋放抗菌藥物的作用，可延長藥物消除半衰期。Basaran與Bozkir將鹽酸環丙沙星包合進HP-β-CD中，鹽酸環丙沙星可在8 h內持續釋放[31]。在37 ℃條件下，用于對抗大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的p-茴香醛/β-CD包合物具有24 h持續釋放作用，其在初始階段呈現明顯突釋現象， 10 h內釋放50%以上[32]。而通過將包合物摻進親水性聚合物微粒中，可實現更為優異的藥物控釋功能。Li等人制備了含鹽酸多西環素和氟苯尼考的包合物微粒混懸液，在開始2 h內呈現突釋現象，而后保持一定時間的緩慢持續釋放，二者在體內的消除半衰期分別延長了1.71倍和2.17倍[33]。將氯己定/β-CD包合物與含有牛血清白蛋白的殼聚糖納米顆粒于殼聚糖醋酸溶液中混合以制備新型熱敏水凝膠雙重緩釋系統，該系統中的氯己定可持續釋放30天[34]。氟苯尼考包合物僅在3 min左右就完全釋放，而Rogel等人將HP-β-CD和氟苯尼考的包合物摻入殼聚糖微粒則實現了氟苯尼考在16 min內的持續釋放[35]。此外，分別將甲硝唑與β-CD及HP-β-CD的包合物摻進殼聚糖納米顆粒內，亦可實現甲硝唑500 min的持續釋放[36]。

4.5 協助抗菌藥物穿越細菌生物被膜 生物被膜由細菌產生的聚合物基質粘合在一起形成，主要成分為多糖、分泌蛋白以及胞外DNA[37]。受到持久性細胞形成、適應性應激、高度粘性、有限營養、較少生長代謝活動以及胞外聚合物基質成分等因素影響，生物膜對抗菌藥物具備一定抵抗力，且高度耐受機體免疫系統，抵抗宿主細胞吞噬作用[38]。生物被膜的形成引發細菌廣泛的適應性變化，使得細菌對傳統抗生素治療與宿主免疫反應的抵抗力提高了近1000倍[39]。

包合物形式可協助抗菌藥物穿越細菌生物膜，提高其抗菌效果。研究表明，HP-β-CD是具有生物粘附性及生物相容性的生物材料，可促進包合物粘附生物膜[26]。將多西環素與HP-β-CD絡合，所形成的包合物可借助環糊精分子與生物膜產生弱相互作用來延長多西環素與細菌的接觸時間，同游離多西環素相比，其對放線桿菌的MIC值降低了87.5%[40]。Han等人將二氫卟吩e6和β-CD合成前藥，并與金剛烷封端的基質金屬蛋白酶(MMP)敏感肽組裝成包合物，通過包合物間的自主裝形成MMP敏感型超分子納米顆粒，該納米顆粒在富含MMP的生物膜微環境中會發生表面電荷逆轉以及粒徑尺寸變化，實現在生物膜中的高滲透與長期保留[41]。帶正電荷的γ-環糊精衍生物也能完全穿透細菌生物膜，并通過與帶負電荷的細胞壁產生相互作用來黏附細菌，其與利福平組成的包合物在降低生物膜中細菌活力方面要比游離利福平高出60%[42]。以明膠與環糊精的共聚物作為主體分子、大黃酸作為客體分子制備而成的包合物則可借助靜電相互作用等方式短時間內聚集于細菌生物膜上，通過增加生物膜對其攝取量來高效清除細菌，研究表明其對豬鏈球菌的清除能力是游離大黃酸的2.8倍[43]。

4.6 破壞細菌細胞膜 細胞膜是細菌的保護性屏障。細菌通過改變孔蛋白等組分的表達數量及類型來降低細胞膜通透性，進而將抗生素隔絕在外，這是細菌產生耐藥性的重要機制之一[44]。研究表明，銅綠假單胞菌的膜通透性比大腸桿菌低10～80倍，因此其對多種抗生素具有更強的抵抗力[45]。同時，孔蛋白表達減少也導致其可在短時間內對碳青霉烯類以及頭孢菌素類新型抗菌藥物產生耐藥性[45]。

包合物能夠直接破壞細菌細胞膜結構，提高膜通透性，增加藥物進入量[46]。研究表明，裝載藥物的環糊精分子可通過與脂質雙分子層發生疏水相互作用、形成氫鍵等方式來改變細胞膜流動性、通透性及穩定性，同時引起胞內成分泄漏[47]。Zhao等人制備了六氫-β-酸與環糊精衍生物的包合物，用其處理金黃色葡萄球菌，細菌細胞膜呈現局部破裂狀態且通透性升高，同時伴有電解質及核酸泄漏[48]。Lin等人將青蒿素封裝至β-CD中以期發揮較強殺菌作用，該包合物可對MRSA細胞膜造成不可逆破壞，經透射電子顯微鏡觀察到處理后的細胞膜呈現出明顯的變形、破壞以及不完整形態[49]。同樣，用β-CD包封氯己定也顯著增強了氯己定的抗菌活性。該包合物可通過同細胞膜中負電荷受體結合以穿越細胞膜并于胞內釋放藥物，經透射電子顯微鏡可觀察到其引起細菌產生空泡化、滲漏以及膜缺陷等變化[50]。Hay等人將直鏈淀粉與脂肪胺絡合成新型抗菌包合物，該包合物中的伯胺基團可通過氫鍵和靜電相互作用同細胞膜中陰離子磷酸鹽基團復合，進而借助疏水基團誘導脂質雙分子層重組，破壞細胞膜[51]。

5 展 望

抗菌藥物在過去一百年中發展迅速。然而，多數細菌對傳統抗菌藥物都產生了一定耐藥性。如今，由細胞膜通透性下降、生物膜形成、主動外排等機制導致的細菌耐藥性已經成為全球性問題。如何在避免細菌耐藥性產生的同時減少抗菌藥物的使用劑量，是當前醫藥領域的一個重點研究方向。自1886年首次發現籠狀包合物以來，包合技術一直在不斷發展，并于上世紀50年代開始應用于醫藥領域。包合物不僅能提高抗菌藥物穩定性及溶解度，還能實現持續釋放，這有效提高了抗菌藥物生物利用度，減少了細菌性感染治療過程中的藥物劑量。更為重要的是，它可通過氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用等方式同細菌生物被膜、細胞膜結合。生物被膜上藥物濃度的提高，促進了膜對藥物的攝取。同時，與細胞膜結合后磷脂雙分子層結構將發生改變，導致膜通透性升高，利于抗菌藥物穿越細胞膜。因此，將抗菌藥物制備成包合物可提高其抗菌活性，為實現臨床減抗提供新策略。不過，目前包合技術多以環糊精及其衍生物作為主體分子，在其他主體分子領域研究較少。醫藥研究者可繼續探索針對性破壞細菌耐藥機制的新型主體分子并將其與傳統抗菌藥物結合，制備成難以誘導細菌產生耐藥性的新制劑。相信隨著包合技術領域研究的不斷拓寬與深入，其在減抗和限抗領域必將得到進一步發展。

6 致 謝

本項目感謝中央高校基本科研業務費專項“納米抗菌藥物胞內靶向轉運與釋放及其調控機制研究”(2662020DKPY008)。