線粒體鐵蛋白調控上皮-間質轉化對非小細胞肺癌細胞順鉑耐藥的影響

趙峻秀霍明洋陳振宇白雪松馬洪波郗艷麗*

(1.吉林醫藥學院公共衛生學院,吉林 吉林 132013; 2.延邊大學基礎醫學院,吉林 延邊 133002)

肺癌是全球致死率最高的惡性腫瘤,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)大約能占肺癌總數的80%～85%[1-2]。多數肺癌患者確診時已處于臨床晚期,臨床上缺少療效顯著的治療藥物,生物靶向藥物的針對性強,很多患者因基因配型不符而錯失最佳治療機會。此外,許多肺癌患者對臨床常用的化療或放射療法存在耐藥,導致肺癌患者的5年生存率較低,僅有4%～17%[3]。順鉑(cisplatin,DDP)是臨床上常用的抗腫瘤藥物,抗癌譜廣,與多種抗腫瘤藥物有協同作用、且無交差耐藥[4],但順鉑的單獨長期使用會造成患者耐藥[5]。研究發現,肺癌患者的順鉑耐藥可能誘導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程,抑制肺癌細胞的EMT過程,可能會有效抑制肺癌細胞的耐藥與侵襲[6]。持續性鐵過載能促進胰腺癌細胞發生EMT過程[7]。在乳腺癌細胞中,通過抑制膜鐵轉運蛋白的表達可以促使細胞內鐵濃度升高,進而導致EMT發生[8]。由此推測,鐵過載可能與腫瘤細胞的耐藥及EMT過程有關。線粒體鐵蛋白(ferritin mitochondrial,FtMt)是一種定位在線粒體上、與鐵代謝密切相關的蛋白,具有組織受限性表達的特點,由于其mRNA上缺乏鐵依賴的、能翻譯調控鐵反應元件的共有序列,所以它的翻譯不受鐵反應元件(iron resposive element,IRE)-鐵調節蛋白(iron regulatory protein,IRP)機制的調控,而該機制被認為是調控細胞鐵穩態的重要機制[9-10]。已證實FtMt參與了線粒體中的鐵調節并維持線粒體內鐵穩態[11],但目前關于FtMt在肺癌細胞耐受順鉑及EMT過程中的作用尚不清楚。為此,本研究通過比較順鉑耐藥細胞株A549/DDP與非耐藥細胞株A549之間FtMt表達水平、EMT過程及相關信號通路的差異,探索FtMt與順鉑耐藥和EMT之間的關系,為進一步了解肺癌的發病機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞

人非小細胞肺癌A549細胞株(中國科學院典型培養物寶藏委員會細胞庫);人非小細胞肺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP(長春晶美生物工程有限公司)。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(以色列BI);RPMI-1640培養基(美國Hyclone);凋亡檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司);線粒體鐵蛋白一抗(Ferritin mitochondrial,FtMt)、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、βactin、HRP-Goat Anti-Rabbit IgG、HRP-Goat Anti-Mouse IgG(武漢三鷹生物技術有限公司);cDNA合成試劑盒(北京康潤誠業生物科技有限公司);BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix和線粒體提取試劑盒(碧云天生物技術);順鉑(cisplatin,DDP)(美國sigma);引物(生物工程上海股份有限公司)。

NBS Galaxy 170S二氧化碳培養箱(德國,Eppendorf);Epoch 多功能酶標儀(美國BioTek);C6流式細胞儀(美國BD);7500 FastPCR儀(美國ABI);Mastercycler nexus gradient梯度PCR儀(德國Eppendorf);IX73活細胞工作站(日本奧林巴斯);Mini-Protean電泳槽、Mini Trans-Blot轉印槽和Gel Doc XR凝膠成像系統(美國Bio-Rad)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞凋亡檢測

A549細胞以2×105個/孔接種于6孔板,在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養液(完全培養液)中,37℃、5% CO2培養箱中培養過夜。A549/DDP細胞培養于富含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素、2 μg/mL DDP的RPMI-1640培養液(完全培養液)中,37℃、5% CO2培養箱中培養。按如下分組給予受試物處理:對照組加入2 mL的不完全培養液(不含血清,其余同完全培養液),給藥組分別加入相同體積的1.0、2.5和5.0 μg/mL的順鉑溶液(不含血清,其余同完全培養液)。37℃、5% CO2培養箱中培養24 h,消化并收集細胞,離心去上清,向沉淀中加入預冷的PBS洗滌細胞1次,加入195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL的PI染色液,混勻,室溫避光孵育20 min,立即上機檢測。實驗重復3次。

1.3.2 細胞周期檢測

細胞處理同1.3.1。處理終點后,用1×PBS洗3次,消化并收集細胞,1000 r/min離心3 min,棄上清,向沉淀中加入70%冷乙醇,4℃固定過夜,PBS洗滌,RNaseA 在37℃孵育30 min。1000 r/min離心3min,棄上清,加入0.5 mL、10 μg/mL的PI溶液,室溫避光反應30 min。PBS洗去未結合染色液,立即上機檢測。實驗重復3次。Modfit軟件分析結果。

1.3.3 蛋白表達檢測

A549和A549/DDP細胞接種于6孔板,37℃、5% CO2培養24 h后,用1×PBS洗3次,每孔加入100 μL細胞裂解液,冰浴10 min,待細胞裂解完全,移入1.5 mL EP管中,100℃變性15 min,3000 r/min離心5 min后,取上清進行Western blot檢測Ecadherin和N-cadherin的表達水平。按照線粒體提取試劑盒說明書步驟,提取線粒體,檢測FtMt蛋白表達水平。通過Image Lab 軟件對蛋白印跡進行分析,以β-actin為內參計算蛋白的相對含量。

1.3.4 mRNA表達水平檢測

細胞處理同1.3.1。處理終點后,胰蛋白酶消化收集細胞,1000 r/min離心5 min,去上清留沉淀,加入1 mL TRIzol,冰浴15 min以充分裂解,加入0.2mL氯仿并劇烈搖蕩15 s,12 000 r/min離心15min,留取上清,加入0.5 mL異丙醇,靜置10 min,12 000 r/min離心10 min,棄上清后加入1 mL、75%預冷乙醇,7500 r/min離心5 min后棄上清,37℃干燥后,加入20 μL DEPC水融解。用提取的RNA作為模板,按照試劑盒說明書的步驟合成cDNA,并進行Real-time PCR檢測。以GAPDH為內參,反應條件為:95℃ 2 min,95℃ 15 s,60℃ 15 s,共進行35個循環。擴增后采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。引物序列參照PrimerBank,見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5 細胞遷移檢測

細胞以2×105個/皿接種30 mm培養皿,待細胞貼壁后,用20 μL槍頭在培養皿底部畫一條直線,制備出細胞劃痕區域。加入不完全培養液洗凈劃痕區域殘留的細胞脆片,分別加入2 mL不同濃度的順鉑溶液,置于活細胞工作站,觀察細胞遷移情況。觀察時間為24 h。每個實驗重復3 次,利用Image J 軟件統計分析劃痕區域的寬度。寬度=24 h劃痕區域的寬度/0 h劃痕區域的寬度。

1.4 統計學方法

SPSS 16.0 軟件進行數據處理,所有數據均用平均數±標準差(±s)表示,各組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)檢驗,檢驗水準α=0.05,P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 細胞凋亡的比較

結果顯示,隨著順鉑給藥劑量的增加,細胞凋亡率和壞死率逐漸增多。5.0 μg/mL順鉑組A549細胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死率均顯著高于0、1.0和2.5 μg/mL順鉑組(P＜0.05)。1.0和2.5 μg/mL順鉑組A549細胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死率雖高于0 μg/mL順鉑組,但比較差異無統計學意義(P＞0.05)。1.0、2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549細胞之間早期凋亡、晚期凋亡和壞死率比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。1.0、2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP早期凋亡率顯著高于0 μg/mL順鉑組(P＜0.05)。5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP早期凋亡率顯著高于1.0和2.5μg/mL順鉑組(P＜0.05)。5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細胞晚期凋亡率顯著高于0 μg/mL順鉑組(P＜0.05)。與A549細胞5.0 μg/mL順鉑組比較,A549/DDP細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和壞死率顯著降低(P＜0.05)。與A549細胞1.0 和2.5 μg/mL順鉑組比較,A549/DDP細胞的壞死率顯著降低(P＜0.05)。見表2和圖1。

圖1 不同濃度順鉑處理下A549和A549/DDP細胞凋亡率及壞死率的流式圖Figure 1 Flow cytometry of apoptosis rate and necrosis rate of A549 and A549/DDP cells under different concentrations of cisplatin

表2 A549和A549/DDP細胞凋亡率及壞死率的比較(%)Table 2 Comparison of apoptosis rate and necrosis rate between A549 and A549/DDP cells

2.2 細胞周期的比較

與0 μg/mL順鉑組比較,5.0 μg/mL順鉑組A549細胞G0/G1期顯著降低(P＜0.05);2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549細胞S期顯著升高(P＜0.05)。5.0 μg/mL順鉑組A549細胞G2/M期顯著低于0、1.0和2.5 μg/mL順鉑組(P＜0.05)。各劑量組A549細胞凋亡率之間比較有顯著差異(P＜0.05)。1.0和2.5 μg/mL順鉑組A549/DDP細胞G2/M期顯著高于0 μg/mL順鉑組;5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細胞G2/M期顯著低于0、1.0和2.5μg/mL順鉑組。5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細胞凋亡率顯著高于0、1.0和2.5μg/mL順鉑組(P＜0.05)。2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細胞G0/G1期顯著高于A549細胞(P＜0.05)。0 μg/mL順鉑組A549/DDP細胞S期顯著高于A549細胞(P＜0.05),G2/M期顯著低于A549細胞(P＜0.05)。5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細胞S期顯著低于A549細胞(P＜0.05)。1.0、2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細胞凋亡率顯著低于A549細胞(P＜0.05)。見表3和圖2。

圖2 不同濃度順鉑處理下A549和A549/DDP細胞周期的流式圖譜Figure 2 Flow cytometry of A549 and A549/DDP cell cycles under different concentrations of cisplatin

表3 A549和A549/DDP細胞周期的比較(%)Table 3 Comparison of cell cycle between A549 and A549/DDP

2.3 E-cadherin和N-cadherin表達水平的比較

由結果可知,與A549細胞比較,A549/DDP細胞中E-cadherin表達水平雖降低,但比較差異無統計學意義(t=1.919,P＞0.05);A549/DDP細胞中N-cadherin表達水平顯著升高,比較差異有統計學意義(t=4.162,P＜0.05)。見圖3。

圖3 A549和A549/DDP細胞E-cadherin和N-cadherin的表達水平Figure 3 Expression levels of E-cadherin and N-cadherin in A549 and A549/DDP cells

2.4 EMT信號通路的比較

結果顯示,與A549細胞比較,A549/DDP細胞中E-cadherin mRNA水平降低,但比較差異沒有統計學意義(t=0.570,P＞0.05);A549/DDP細胞中N-cadherin、snail、slug和vimentin的mRNA水平顯著升高(t=8.469,t=8.768,t=5.793,t=7.118,P＜0.05);Twist的mRNA水平雖然顯著升高,但比較差異無統計學意義(t=2.819,P＞0.05)。見圖4。

圖4 A549和A549/DDP細胞EMT信號通路的比較Figure 4 Comparison of EMT signaling pathways in A549 and A549/DDP cells

2.5 細胞遷移的比較

由結果可知,與A549細胞比較,A549/DDP細胞傷口劃痕區域面積顯著升高(t=6.745,P＜0.05),表明A549/DDP細胞遷移的速度顯著快于A549細胞。見圖5。

圖5 A549和A549/DDP細胞遷移的比較Figure 5 Comparison of A549 and A549/DDP cell migration

2.6 FPn、DMT1、hepcidin和TfR1的mRNA水平比較

由圖6可知,與A549細胞比較,A549/DDP細胞中DMT1 mRNA水平雖降低,但比較差異無統計學意義(t=2.112,P＞0.05)。FPn、hepcidin和TfR1 mRNA水平顯著升高,且比較差異有統計學意義(t=5.385,t=2.893,t=5.611,P＜0.05)。

圖6 A549和A549/DDP細胞中FPn、DMT1、鐵調素和TfR1的mRNA水平Figure 6 mRNA levels of FPn, DMT1, hepcidin and TfR1 in A549 and A549/DDP cells

2.7 FtMt表達水平的比較

由結果可知,與A549細胞比較,A549/DDP細胞中FtMt蛋白表達水平顯著升高(t=2.804,P＜0.05)。見圖7。

圖7 A549和A549/DDP細胞中FtMt的表達水平Figure 7 Expression level of FtMt in A549 and A549/DDP cells

3 討論

NSCLC是常見的惡性腫瘤之一,臨床對于NSCLC的治療往往采用以鉑類為基礎的化學聯合治療,部分患者治療2～3年后對鉑類會產生繼發性耐藥[12]。耐藥細胞具有更強的侵襲轉移特性,晚期NSCLC患者常死于鉑類耐藥后的廣泛轉移,尋找NSCLC鉑類化療耐藥機制一直是醫學界研究的熱點[13]。構建鉑類耐藥的肺癌細胞系將有利于探尋其耐藥機制。在本研究中,購買了一株肺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP,在深入探討肺癌耐藥機制之前,首先驗證了購買的A549/DDP細胞的順鉑耐藥性。通過研究發現,A549/DDP細胞與A549細胞經順鉑處理后,A549/DDP細胞的存活率顯著高于A549細胞,凋亡率和壞死率顯著低于A549細胞。這表明A549/DDP細胞是順鉑耐藥細胞系。

研究證實,順鉑可通過與腫瘤細胞DNA結合形成交叉鍵,從而抑制其復制[14]。當DNA受損后,細胞停滯在G0/G1期,此時細胞發生修復,容易使化療藥物無效[15]。若細胞周期大量停滯在G2/M期,細胞周期調控系統會發生失衡,可誘發腫瘤細胞失控性生長[16]。本研究結果顯示,1.0～5.0 μg/mL順鉑處理后,A549細胞的細胞周期主要停留在G0/G1期和G2/M期,隨著順鉑給藥劑量的增加,A549細胞停留在G0/G1期和G2/M期的細胞數量逐漸降低,即在1.0～5.0 μg/mL范圍內,A549細胞未發生順鉑耐藥,細胞凋亡率隨著順鉑給藥劑量增加而增加。順鉑可以更好地與肺癌細胞DNA穩定結合,抑制肺癌細胞的自我修復,從而誘導肺癌細胞A549發生凋亡。1.0～5.0 μg/mL順鉑處理后,隨著順鉑給藥濃度的增加,進入G0/G1期和G2/M期的A549/DDP細胞數量先升高后降低。在順鉑低劑量給藥條件下(1.0～2.5 μg/mL),其誘導的A549/DDP細胞凋亡率升高的不十分顯著,此時A549/DDP細胞發生了順鉑耐藥;當順鉑給藥劑量增加到5.0 μg/mL時,其誘導的A549/DDP細胞凋亡率顯著升高,此時A549/DDP細胞的耐藥性因順鉑給藥劑量的增加而得到緩解。但在臨床治療中,順鉑給藥劑量的增加,可能會導致出現肝腎組織毒性,引起嚴重的副作用。因而在臨床治療中,順鉑給藥劑量不能隨意增加,順鉑的耐藥性亦不能得到有效的控制。

EMT是指在特定生理病理條件下,具有極性的上皮細胞失去極性,向間質細胞表型轉化,使其具有運動能力且能在細胞基質間自由運動,具有間質表型的細胞對化學藥物的敏感性降低,但向周圍組織及遠端器官侵襲、遷移的能力增強[17]。E-cadherin的減少和N-cadherin的升高是EMT發生的重要標志,此時細胞間的粘附能力下降,運動能力和粘附能力增強[18]。波形蛋白(vimentin)是細胞間質表型的重要標志,能使細胞的空間結構發生變化,增加細胞的遷移與侵襲能力[19]。機體內參與調控EMT過程的關鍵轉錄因子包括鋅指蛋白、snail、slug、twist等,其中snail、slug和twist的研究最為多見[20]。Snail、slug、ZEB1、E12/E47和SIP1均是轉錄抑制因子snail超家族的成員,該家族成員的結構非常相似,C-末端含有鋅指DNA結合區域,N-末端含有SNAG結構域[21]。Snail、slug與EMT的進展有關[22]。下調snail和slug水平,可以逆轉EMT過程[23]。Twist與惡性腫瘤轉移密切相關,在NSCLC肺癌組織中高表達。減少twist的表達可通過抑制N-鈣黏蛋白表達抑制癌細胞侵襲[24]。Twist作為堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子的家族成員,是多種腫瘤的不良預后因子[25]。大量研究表明,EMT過程與肺癌的獲得性耐藥有關,抑制肺癌細胞的EMT過程,可能會有效抑制肺癌細胞的耐藥與侵襲[26]。本研究結果顯示,A549/DDP細胞遷移速度顯著快于A549細胞,且A549/DDP細胞中的E-cadherin表達水平和mRNA水平低于A549細胞,N-cadherin和vimentin蛋白的表達水平和mRNA水平顯著高于A549細胞,參與EMT過程的snail、slug和twist的mRNA水平高于A549細胞。這一結果表明,A549/DDP細胞不僅存在順鉑耐藥,還具備較高的細胞侵襲和遷移能力,即肺癌細胞的順鉑耐藥與EMT過程有關,肺癌細胞發生順鉑耐藥,預示著其可能會同時發生遠端轉移。

FtMt是一種由染色體5q23.1上無內含子基因編碼的線粒體定位的鐵存儲蛋白,具有與鐵蛋白重鏈同源結構,該結構有助于在FtMt的殼結構中儲存鐵[11,27-28]。FtMt主要在高耗氧量和高代謝活性的細胞中表達,如精母細胞、神經元和心肌細胞。FtMt會隨著線粒體中鐵的增加而增加,但在肝和脾中的FtMt表達相對較低,而這兩個部位的細胞質內儲存了大量的鐵。FtMt的水平似乎與線粒體豐度的相關性大于鐵代謝的相關性[29]。FtMt作為鐵庫,儲存鐵的能力大于細胞質鐵蛋白[30-31]。FtMt增加時會促進鐵從胞質向線粒體重新分布,加入鐵螯合劑后,這種作用會增強。FtMt對鐵的強烈儲存作用解釋了為什么大多數細胞一直保持低水平的FtMt[31]。目前關于FtMt在肺癌細胞中的表達情況研究較少,本課題組之前研究發現,在肺癌細胞A549中檢測到了FtMt mRNA的表達,通過給予順鉑后,線粒體中FtMt mRNA水平下調[32]。這提示FtMt在肺癌細胞中可能有重要作用,但具體機制尚不十分清楚。本研究發現,A549/DDP細胞中的FtMt蛋白表達水平顯著高于A549細胞,這提示在肺癌細胞耐受順鉑的過程中,存在著FtMt蛋白表達水平的變化,FtMt在肺癌細胞耐受順鉑過程中可能發揮了重要作用,但具體作用機制有待進一步研究。

鐵轉運蛋白(ferroportin,FPn)、二價金屬離子轉運蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)和轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor1,TfR1)均是細胞中負責參與鐵運輸的重要信號因子。其中,FPn是目前唯一已知的鐵輸出蛋白,而鐵調素是一種鐵穩態調節激素,可以與FPn結合,以防止鐵外流[33-34]。在本研究中,A549/DDP細胞中DMT1和FPn mNRA水平顯著高于A549細胞,這提示A549/DDP細胞中的鐵代謝比A549細胞活躍。

組織可以通過TfR1從血液中吸收轉鐵蛋白結合鐵,DMT1可介導內吞小泡上轉鐵蛋白-TfR1復合物上的鐵進入細胞漿[35]。當鐵負荷時TfR1和DMT1表達會下調[36]。在本研究中,A549/DDP細胞中DMT1 mRNA水平雖低于A549細胞,但比較差異無統計學意義。這提示DMT1可能不是造成A549/DDP與A549細胞中鐵代謝差異的主要基因。而A549/DDP細胞中TfR1 mRNA水平顯著高于A549細胞,提示TfR1參與了肺癌順鉑耐藥細胞的鐵代謝,TfR1的高表達可能是肺癌順鉑耐藥細胞中鐵代謝紊亂的重要機制之一。此外,Nie等[31]研究發現,細胞轉染FtMt以后,細胞中的TfR1的表達水平會升高,這一結論與我們的結果相似。

綜上所述,肺癌細胞的順鉑耐藥與EMT過程有關,肺癌細胞發生順鉑耐藥的同時可能也發生了侵襲和轉移。肺癌細胞順鉑耐藥過程中,存在著FtMt蛋白表達水平的變化,提示FtMt在肺癌細胞耐受順鉑過程中可能發揮了重要作用。鐵代謝紊亂可能與肺癌細胞順鉑耐藥有關。但具體作用機制有待進一步研究。下一步會通過構建過表達載體或敲除載體進一步評價FtMt在EMT和順鉑耐藥過程中的作用,為非小細胞肺癌發病機制的探討提供更多的實驗數據。