2017～2021年陜西省實驗動物使用單位SPF級大、小鼠質量監測結果分析與評估

吳朋朋張彩勤趙 勇譚鄧旭師長宏白 冰

(空軍軍醫大學實驗動物中心,西安 710032)

隨著生命科學的發展,實驗動物已成為其研究的基礎與支撐,是醫學教學和生物醫學研究不可缺少的實驗材料。實驗動物的質量直接影響實驗結果的準確和課題研究的成敗,決定研究成果的可行性、重復性和科學性,特別是一些人獸共患性疾病,直接威脅動物飼養人員和研究人員的健康與生命安全[1-2]。因此,做好實驗動物的質量檢測與評估的相關工作,對實驗動物的生產和應用具有重要作用[3-4]。

本中心作為陜西省實驗動物質量檢測機構(陜西省實驗動物質量監督檢測中心),根據《實驗動物質量管理辦法》、《實驗動物許可證管理辦法》和《陜西省實驗動物管理辦法》等相關法律法規以及實驗動物國家標準[5-8],除了每年對各實驗動物生產單位進行質量抽測外,近年來,加大對省內實驗動物使用單位的質量抽檢,并及時反饋檢測結果,對不合格的動物進行處置并做好后期的跟蹤監測,確保本地區實驗動物使用安全。本文對2017～2021年期間陜西省實驗動物使用單位飼養的SPF級大、小鼠質量抽檢結果進行了總結分析,探討了影響動物質量的因素,以期為動物實驗過程中的質量管理和監測提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

抽檢的不同品系的S PF級大、小鼠均來自陜西省內實驗動物使用單位,各年度抽檢單位數量、動物品種及數量見表1。

表1 2017～2021年陜西地區實驗動物質量監測結果Table 1 Monitoring results of laboratory animals in Shaanxi from 2017 to 2021

1.2 主要試劑與儀器

大、小鼠酶聯免疫抗體檢測試劑盒購買于蘇州西山生物術有限公司和中國食品藥品檢定研究院,其中蘇州西山生物術有限公司小鼠酶聯免疫抗體檢測試劑盒批號:鼠痘病毒(E22012201)、肝炎病毒(E22040801)、仙臺病毒(E22012802)、肺炎病毒(E22031411)、呼腸孤病毒III型(E21102902)、細小病毒(E22012601)、弓形蟲(E21112502)、支原體(E22012701)、泰澤病原體(E21120604);大鼠酶聯免疫抗體檢測試劑盒批號:仙臺病毒(E22022503)、漢坦病毒(E22022502)、細小病毒 H-1株(E21102201)、細小病毒KRV株(E21102202)、肺炎病毒(E21121501)、冠狀病毒/涎淚腺炎病毒(20210702)、呼腸孤病毒Ⅲ型(20210702)、支原體(E21102901)、弓形蟲(E21122801)、泰澤病原體(E21101401);中國食品藥品檢定研究院小鼠酶聯免疫抗體檢測試劑盒批號:鼠痘病毒(20210604)、肝炎病毒(20211125)、仙臺病毒(20211123)、肺炎病毒(20211003)、呼腸孤病毒III型(20211009)、細小病毒(20211017)、弓形蟲(20211109)、支原體(20211104)、泰澤病原體(20210917),大鼠酶聯免疫抗體檢測試劑盒批號:仙臺病毒(20211111)、漢坦病毒(20211025)、細小病毒H-1株(20211023)、細小病毒 KRV 株(20211113)、肺炎病毒(20210914)、冠狀病毒/涎淚腺炎病毒(20210917)、呼腸孤病毒Ⅲ型(20210917)、支原體(20211118)、弓形蟲(20211008)、泰澤病原體(20211204);細菌培養平板(批號:0032213)、鑒別培養基(批號:20210314)和細菌生化微量管(批號:20210917)由杭州微生物試劑有限公司提供,其余相應檢測試劑均參照國家標準配備。多功能酶標儀(Synergy LX)購于美國Bio-Tek公司;生物顯微鏡(BX3)購于日本奧林巴斯公司;全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(VITEK 2 Compact)購于法國梅里埃公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 抽樣

抽樣按照GB 14922.2-2011《實驗動物 微生物等級及監測》進行,在每一房間不同籠架多點采樣,根據每個品系動物的種群數量隨機采樣3～5只,按SPF級動物進行包裝、運輸,包裝箱上注明動物品種、級別、數量及檢測項目。

1.3.2 檢測

檢測項目及方法依據《實驗動物 微生物學檢測方法》(GB/T 14926.1-2001～GB/T 14926.64-2001)和《實驗動物 寄生蟲學檢測方法》(GB 18448.1-2001～GB 18448.10-2001)執行[7-8],涵蓋國家標準中規定的必檢項目(細菌、病毒和寄生蟲)。為避免交叉污染,所有檢測樣本的采集均在生物安全柜中實施。采集動物糞便、體表毛發開展寄生蟲檢測;分離血清,酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清中的病毒抗體;采取呼吸道分泌物和腸道內容物,分離培養細菌并進行生化鑒定,確定感染菌群類型[9-11]。檢測中發現的病毒和細菌陽性樣品均進行二次復檢。

1.4 統計學方法

按照相應國家標準對檢測結果進行綜合判定,符合該病原微生物檢測結果者作出陽性報告(感染),不符合者作出陰性報告(未感染)。用SPSS 23.0統計軟件對近5年抽檢的大、小鼠微生物及寄生蟲感染陽性率(或血清抗體陽性率)進行統計學分析,結果以每年檢出的陽性動物數占抽檢動物總數的百分比進行表示。用單因素方差分析法進行每年間感染情況的差異性分析,以P＜0.05表示差異有顯著性,最后用GraphPad Prism 8軟件進行作圖。

2 結果

2.1 2017～2021年SPF級大、小鼠寄生蟲檢測結果

5年間,累計抽檢小鼠2549只,大鼠503只(表2、圖1和圖2)。檢測范圍包括皮毛上的蚤、虱和螨等體外寄生蟲成蟲及其蟲卵;腸道內的鞭毛蟲、纖毛蟲、蠕蟲及其蟲卵;血清中的弓形蟲抗體采用ELISA進行檢測。

小鼠主要存在體外寄生蟲(螨蟲)和腸道鞭毛蟲的感染(表2、圖1),5年中均有檢出,但檢出率呈逐年下降趨勢。體外寄生蟲(螨蟲)的檢出率由2017年的5.26%(19/361)降為2021年的0.15%(1/670),單位檢出率由20.00%(3/15)降為3.12%(1/32);腸道鞭毛蟲的檢出率由2017年10.53%(38/361)降低為2021年的0.45%(3/670),單位檢出率由20.00%(3/15)降為3.12%(1/32)。弓形蟲抗體檢出率也呈現逐年降低的趨勢,由2019年的0.84%(5/598)降至2021年的0.15%(1/670),單位檢出率由10.00%(2/20)降為3.12%(1/32)。但是,腸道蠕蟲的檢出率卻由2018年的0.40%(2/506)增加至2021年的2.39%(16/670),單位檢出率由5.88%(1/17)增加至9.38%(3/32)。

圖1 2017～2021年陜西地區SPF級小鼠寄生蟲檢測結果Figure 1 Parasite detection results of SPF mice in Shaanxi from 2017 to 2021

表2 2017～2021年陜西地區SPF級大、小鼠寄生蟲檢測結果Table 2 Parasite detection results of SPF mice and rats in Shaanxi from 2017 to 2021

大鼠也存在體外寄生蟲(螨蟲)、腸道鞭毛蟲和蠕蟲的感染(表2、圖2)。檢測結果顯示,體外寄生蟲(螨蟲)檢出率由2017年的7.07%(8/113)降至2018年后無檢測出,單位檢出率由2017年的40.00%(2/5)降為0.00%;腸道鞭毛蟲的檢出率由2017年的11.50%(13/113)降低為2021年的0.83%(1/120),單位檢出率由60.00%(3/5)降低為7.69%(1/13)。蠕蟲檢出率由2017年的3.79%(3/79)增長為2021年的7.50%(9/120),單位檢出率由20.00%(1/5)增加至2021年的15.38%(2/13)。

圖2 2017～2021年陜西地區SPF級大鼠寄生蟲檢測結果Figure 2 Parasite detection results of SPF rats in Shaanxi from 2017 to 2021

2.2 2017～2021年SPF級大、小鼠病原微生物檢測結果

5年中109家單位的小鼠病原微生物檢測結果(表3、圖3)顯示,小鼠主要存在沙門菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、泰澤病原體和支原體的感染,但檢出率呈下降趨勢。其余必檢項目5年內均未檢出。其中,沙門菌2017年檢出率為2.78%(10/361)、2018年為1.18%(6/506)、2019年0.33%(2/598)到2020年以后均為0.00%,單位檢出率由2017年的20.00%(3/15)降低為2021年的0.00%;肺炎克雷伯桿菌僅2018年在1家單位(5.88% 1/17)中檢出0.20%(1/506),其余3年均未檢出;肺炎鏈球菌在2017年1家單位(6.67% 1/15)檢出0.27%(1/361)后,連續4年均未檢出;泰澤病原體血清抗體陽性檢出率由2017年2家單位(13.33% 2/15)檢出1.38%(5/361)降低至2021年的32家單位均未檢出;支原體血清抗體陽性僅在2017年1家單位(6.67% 1/15)中檢出(0.27% 1/361),此后連續4年均未檢出。

圖3 2017～2021年陜西地區SPF級小鼠病原微生物檢測結果Figure 3 Pathogenic microorganism test results of SPF mice in Shaanxi from 2017 to 2021

45家單位的大鼠細菌檢測結果(表3、圖4)顯示,大鼠中主要存在金黃色葡萄球菌、沙門菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌和泰澤病原體的感染,但檢出率呈逐年下降趨勢。其余必檢項目5年內均未檢出。其中,金黃色葡萄球菌2017～2019年連續3年均有1家單位檢出,檢出率分別為1.77%(2/113)、1.27%(1/79)和1.02%(1/98),此后至2021年再未檢出金黃色葡萄球菌;沙門菌僅在2018年1家單位(11.11% 1/9)中檢出(2.53% 2/79),其余4年均未檢出;綠膿桿菌在2017年(1.77% 2/113)和2018年(2.53% 2/79)均有1家單位檢出,2019年至2021年連續3年均未檢出;肺炎鏈球菌僅在2018年1家單位(11.11% 1/9)中檢出(1.27% 1/79),其余4年均未檢出;泰澤病原體血清抗體陽性僅在2017年有2家單位(40.00% 2/5)檢出(4.42% 5/113),此后連續4年均未檢出。

表3 2017～2021年陜西地區SPF級大、小鼠病原微生物檢測結果Table 3 Pathogenic microorganism test results of SPF mice and rats in Shaanxi from 2017 to 2021

圖4 2017～2021年陜西地區SPF級大鼠病原微生物檢測結果Figure 4 Pathogenic microorganism test results of SPF rats in Shaanxi from 2017 to 2021

2.3 2017～2021年SPF級大、小鼠病毒抗體檢測結果

病毒檢測主要采用ELISA方法檢測血清中的病毒抗體,檢測中發現的陽性血清樣本再次采用不同廠家的ELISA檢測試劑盒進行2次復檢,兩次結果均為陽性則判定為感染,檢測結果如表4所示。

表4 2017～2021年陜西地區SPF級大、小鼠病毒血清抗體檢測結果Table 4 Virological test results of SPF mice and rats in Shaanxi from 2017 to 2021

小鼠病毒血清抗體檢測結果(表4、圖5)顯示,小鼠肝炎病毒、仙臺病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠細小病毒和小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型在2017～2021年均有檢出。其余必檢項目5年內均未檢出。2017年有3家單位(20.00% 3/15)檢出小鼠肝炎病毒(陽性率4.71% 17/361),1家單位(6.67% 1/15)檢出仙臺病毒(陽性率1.39% 5/361),2家單位(13.33% 2/15)檢出小鼠細小病毒(陽性率2.22% 8/361)。2018～2021年每年均有不同病毒檢出,但陽性單位數和病毒陽性率均呈逐年下降趨勢。至2021年,僅有1家單位(3.13% 1/32)檢出小鼠肝炎病毒且陽性率降為0.30%(2/670),仙臺病毒陽性率降為0.15%(1/670),32家單位均未檢出小鼠細小病毒。此外還發現,對于小鼠肺炎病毒和小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型,這5年來的血清抗體陽性檢出率則呈現逐年上升的趨勢:2017年僅1家單位(6.67% 1/15)檢出小鼠肺炎病毒(陽性率1.11% 4/361),2019年增長為2家單位(陽性率2.84% 17/598),至2021年該2家單位(6.25% 2/32)小鼠肺炎病毒血清抗體陽性檢出率為(2.39% 16/670);而2019年1家單位(5.00% 1/20)檢出小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型(陽性率0.17% 1/598),至2021年,該單位(3.13% 1/32)依舊有檢出(陽性率0.45% 3/670)且比率較過去2年有所增加。

圖5 2017～2021年陜西地區SPF級小鼠病毒抗體檢測結果Figure 5 Virological test results of SPF mice in Shaanxi from 2017 to 2021

大鼠血清抗體陽性以仙臺病毒、大鼠細小病毒、小鼠肺炎病毒和大鼠冠狀病毒為主(表4、圖6)。其余必檢項目5年內均未檢出。其中,仙臺病毒每年均有檢出,但陽性率從最初的3家單位(60.00% 3/5)的7.07%(8/113)降低為2021年1家單位(7.69% 1/13)的0.83%(1/120);大鼠細小病毒和大鼠冠狀病毒抗體陽性僅2017年和2018年在個別單位有檢出,此后2019～2021年連續3年各單位均未檢出;值得注意的是,小鼠肺炎病毒血清抗體陽性率卻由最初1家單位(20.00% 1/5)的0.88%(1/113)增長為3家單位(23.08% 3/13)的(10.00% 12/120)。

圖6 2017～2021年陜西地區SPF級大鼠病毒抗體檢測結果Figure 6 Virological test results of SPF rats in Shaanxi from 2017 to 2021

3 討論

隨著生命科學的發展與實驗動物許可證制度的不斷完善,實驗動物質量監測顯得尤為重要[12]。定期的質量監測,不僅能夠為實驗動物的生產和使用提供科學依據,同時也能及時發現實驗動物飼養中存在的問題,消除實驗動物攜帶的人畜共患病原體,減少實驗動物在生產和使用過程中對人群的感染[13]。對于實驗動物使用單位而言,動物質量監測的缺失會導致日常管理出現盲區,動物一旦感染烈性傳染病如鼠痘等,可導致整個動物群全軍覆沒,造成巨大損失[14]。

通過對2017～2021年陜西省實驗動物使用單位飼養的SPF級大、小鼠質量抽檢結果的分析,發現5年間,陜西地區抽檢單位和動物的數量均有所增長,從側面反映出本地區實驗動物使用數量的穩步提升。但值得注意的是,各單位使用的動物質量還存在著一定的問題,總體趨勢是病原微生物感染降幅明顯,但個別微生物感染控制水平有待提升。具體表現在寄生蟲方面,大、小鼠中主要存在體外寄生蟲(螨蟲)、腸道鞭毛蟲和蠕蟲的感染(表2);細菌方面存在金黃色葡萄球菌、沙門菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、泰澤病原體和支原體的感染(表3);病毒方面則以小鼠肝炎病毒、仙臺病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠細小病毒、小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型、大鼠細小病毒和大鼠冠狀病毒血清抗體陽性為主(表4)。在我國廣東、四川等地區也有金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌檢測陽性的報道[15-16]。2014～2019年北京地區實驗動物質量抽檢結果中,鼠群檢出的病原微生物以細小病毒、泰澤病原體、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等為主[17-18]。可見,本地區與國內其它地區實驗鼠群病原體污染的流行趨勢基本一致。我國現行標準《實驗動物 微生物學等級及監測》中明確規定金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌是SPF級實驗大、小鼠必須檢測和排除的病原菌[6],但上述病原菌均屬于條件性致病菌,可正常存在于動物體內和環境中,只有當動物免疫功能低下時方可感染動物。國外多數企業將其作為環境監測的參考指標,當認為該病原體可能會對正在進行的實驗存在干擾時才進行監測[19-21]。對病原微生物來源進行調查發現,實驗動物感染病原微生物主要集中在3個方面:一是來自病原微生物控制不明確的實驗動物,占病原微生物來源的83.33%(20/24)。感染動物主要來自于各單位構建的基因編輯動物,其微生物質量狀況不明確,造成動物間交叉感染。二是來自實驗物品、生物試劑和實驗人員的污染,占病原微生物來源的12.50%(3/24)。動物實驗區域人員流動頻繁,個別實驗人員生物安全意識不強,物品消毒滅菌不徹底,潔凈與非潔凈區域實驗儀器、試劑及物品交叉混用,感染性實驗廢棄物的不規范處置均可造成動物感染。三是屏障設施管理存在漏洞,占病原微生物來源的4.17%(1/24)。飼料、墊料和飲水滅菌消毒不徹底,或是存在污染死角,設施設計及布局的缺陷等均可導致病原微生物的入侵。

針對以上實驗動物使用單位的大、小鼠感染現狀,在陜西省實驗動物管理委員會和專家的監督與指導下,對檢測不合格動物所在區域實行了嚴格消殺處理:不符合SPF級標準要求的實驗動物(C57BL/6J、BALB/c小鼠和SD大鼠等),須立即停止實驗、處死感染動物并封鎖該區域。區域內所有動物分區域、分批次進行病原篩查,及時淘汰病原(血清抗體)陽性動物(或整個種群),對房間環境及IVC系統進行徹底消毒,檢測合格后重新引進質量合格的動物開展實驗。同時對同房間內其他小鼠進行嚴密監控,每隔兩周進行復查,確保沒有交叉感染。珍稀的基因編輯小鼠則可經過相應的生物凈化后(剖腹產、胚胎移植或體外受精),采用兩次檢測法確定是否達到SPF級要求,即在目標小鼠離乳后檢測代孕母鼠,分窩留種后檢測淘汰的仔鼠,只有兩次檢測均符合SPF標準方可判定凈化合格。合格的基因編輯鼠群轉移至微生物最高級別控制區域進行飼養,加強區域管控和環境消毒,嚴防病原微生物侵入,動物一旦出現污染,立即轉入低級別飼養區,待重新進行生物凈化后返回。此外,還需加強飼養和實驗人員生物安全、消毒滅菌等專業知識的培訓,降低動物感染的風險[22]。

上述整改措施的實施,極大改善了本地區各使用單位實驗動物病原微生物的感染狀況,陽性動物檢出率總體呈逐年下降趨勢。其中,肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌和綠膿桿菌等細菌感染動物已經連續4年未檢出。然而,腸道蠕蟲、小鼠肺炎病毒、小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型連續5年均有檢出且呈現緩慢增長的趨勢,這是因為檢出的動物都屬于正在實驗的動物或珍稀的基因編輯動物,無法淘汰處理,僅靠隔離與消毒,病原防治比較困難。帶毒(蟲)動物也容易造成周圍動物的交叉感染,只有通過微生物凈化才能徹底清除病原感染[23]。

通過對陜西省2017～2021年實驗動物使用單位屏障環境飼養的SPF級大小鼠病原微生物監測結果的分析,了解到本地區實驗動物質量得到較大改善,但也暴露出很多問題。作為實驗動物質量檢測機構,要堅持不懈的進行日常病原微生物監測,加強生物安全宣傳,促使相關單位明確實驗動物質量對本行業及生物醫藥衛生事業的發展至關重要。同時,督促各使用單位持續采取嚴格的生物安全防控措施,不斷提高實驗動物飼養管理水平。只有檢測機構與各單位相互配合,才能不斷降低實驗動物病原感染風險,提高實驗動物質量,為生命科學的發展提供強有力的支撐。