超聲影像在評價大鼠結節性甲狀腺腫的應用

高祥舉高冬梅陳憲梅宋婷婷高 占高 杰*王杰瓊*

(1.山東中醫藥大學中醫學院,濟南 250355;2.山東中醫藥大學情志病證研究創新團隊,濟南 250355;3.山東中醫藥大學情志病證肝藏象藥理青年科研創新團隊,濟南 250355;4.山東中醫藥大學藥學院,濟南 250355)

甲狀腺腫是一種常見的內分泌疾病,存在單純性甲狀腺腫,也可伴有結節性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、Graves病等甲狀腺疾病[1-2]。2015年～2017年對國內31個省、直轄市、自治區的流行病學調查結果顯示,成年人甲狀腺腫大的患病率為1.17%[3],且與少年代謝綜合征、糖尿病、肝炎等有關,其本身病變率達5%[4]。結節性甲狀腺腫(nodular goiter)是甲狀腺腫中的一類,多由甲狀腺激素分泌不足,刺激甲狀腺體積增大,隨時間發展,甲狀腺在增大過程中形成一個或多個結節[5]。

雖然近些年來,對甲狀腺相關疾病基礎研究日益增多,但其發病機制及病理過程尚不完全清楚,因此建立可重復、簡單易行且穩定的動物模型顯得尤為重要,國內多以制作大鼠模型為主。目前臨床上公認的結節性甲狀腺腫的診斷金標準是超聲影像及細針穿刺病理結果[6-7],但缺乏動物模型超聲檢測操作步驟、方法及相關參數。目前也未見應用超聲檢測大鼠結節性甲狀腺腫細節報道,這對于基礎研究人員使用超聲檢測大鼠甲狀腺來說有不小的困難。本實驗通過建立大鼠結節性甲狀腺腫模型,確定其超聲下甲狀腺位置,再利用超聲技術來進行模型評價,造模后取甲狀腺組織進行病理學模型鑒定,旨在建立一種簡單易行、穩定可靠的大鼠甲狀腺結節模型評價方法。同時為今后大鼠甲狀腺超聲檢測的操作提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠40只,體重150～180 g,6～8周,雌雄各半,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2021-0011],飼養于山東中醫藥大學實驗動物中心大樓[SYXK(魯)2017-0022]。飼養大鼠運抵實驗室后先行適應性飼養1周,自由飲水進食。保持12 h/12 h明暗周期,實驗室溫度控制(23±1)℃,濕度控制50%～60%,噪聲≤60 dB,實驗動物使用經山東中醫藥大學實驗動物福利倫理審查委員會批準(SDUTCM2022030001),并按照實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

生理鹽水(辰欣藥業股份有限公司);丙基硫氧嘧啶(PTU,上海朝暉藥業有限公司,國藥準字H31021082);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);薇婷絲滑沁香脫毛膏(利潔時家化中國有限公司);耦合劑(天津津亞科技發展有限公司);40%多聚甲醛;HE染色試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)。粘附載玻片(中國世泰);游標卡尺(上海美耐特實業有限公司);Ultra 超優刀片(賽默飛);P60-VET 動物超聲(大為寵物醫療(江蘇)有限公司);高頻曲棍球探頭10.0 MHz(大為寵物醫療(江蘇)有限公司);R580 呼吸麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

取Wistar大鼠雌雄各20只,隨機分2組,每組20只,即對照組(control)、模型組(model),雌雄分籠飼養。

1.3.2 PTU法制備結節性甲狀腺腫大鼠模型

采用Tamura的方法造模[8],模型組用生理鹽水配成0.1%的PTU溶液,每只大鼠每天按100 mg/kg連續灌服8周。對照組給與同體積的生理鹽水連續灌服8周。

1.3.3 超聲檢測分組大鼠結節性甲狀腺腫方法

(1)大鼠甲狀腺超聲定位及檢測

選用大為P60型彩色多普勒超聲儀,高頻曲棍球探頭。將老鼠頸部脫毛,充分暴露檢查部位,采用異氟烷進行呼吸麻醉,探頭從下頜骨開始,沿頸部長軸向下進行連續橫切掃查,同時大鼠身體一側放置病理標尺記錄位置,上線與大鼠下頜骨下緣對齊,探頭探查到舌骨時記錄距離,并繼續向下探查,待圖像中甲狀腺整體消失再記錄位置。同時記錄甲狀腺的狀況,包括甲狀腺兩葉和頸部相鄰結構的橫向和縱向圖像。對左右側葉分別測量內外側、前后和頭尾直徑(圖1A、圖1B),并根據超聲影像結果進行診斷分析。

圖1 超聲下大鼠甲狀腺圖像及側葉測量Figure 1 Ultrasound images of the rat thyroid gland and lateral lobe measurements

(2)HE染色法檢測大鼠甲狀腺病理形態學改變

大鼠仰臥解剖位,麻醉后從頸部正中線剪開大鼠頸部的皮膚,由胸骨剪至下頜,暴露甲狀軟骨和氣管,用眼科剪小心剪開軟骨腹面的肌肉和筋膜組織,將甲狀軟骨完全暴露(圖2A),從軟骨下插入眼科彎鑷,將軟骨和氣管撐開完全暴露甲狀腺(圖2B),放置一病理尺與老鼠身體平行,使用另一病理尺進行測量在體甲狀腺的上下緣距下頜骨的距離(圖2C、圖2D),并記錄數值。用手術剪從喉剪開,為減少誤差,向下計數至第六氣管軟骨剪掉(圖2E、圖2F),取下后使用游標卡尺測量甲狀腺側葉的內外側、前后和頭尾直徑。之后浸入40%多聚甲醛固定48 h,包埋,從甲狀腺向氣管方向連續切片,每張切片厚度3 μm,進行常規HE染色。

圖2 大鼠甲狀腺在體測量及離體圖像Figure 2 In vivo measurements and ex vivo images of the rat thyroid gland

1.4 統計學方法

采用GraphPad prism 9.0.0進行分析處理,大鼠甲狀腺超聲測量與體外游標卡尺測量采用配對t檢驗,對照組與模型組的甲狀腺側葉前后、內外、頭尾徑長比較采用獨立樣本t檢驗,P＜0.05表示差異具有顯著意義。

2 結果

2.1 大鼠甲狀腺的超聲定位

通過記錄超聲頸部橫切掃描甲狀腺位置參數,結果顯示:對照組中,甲狀腺位于大鼠下頜骨下(2.4±0.4)～(3.3±0.5)cm的位置(圖3A),模型組中,甲狀腺位于大鼠下頜骨下(2.1±0.3)～(3.3±0.3)cm的位置(圖3B)。由此可見,在使用超聲對大鼠甲狀腺進行掃描時,位于距離大鼠下頜骨(2.3±0.5)～(3.3±0.5)cm處可探查到甲狀腺(圖3C、圖3D)。

圖3 多普勒超聲檢測大鼠甲狀腺的起、止位置Figure 3 Ultrasound detection of the starting and ending position of the thyroid gland in rats

2.2 大鼠甲狀腺的超聲測量結果及體外驗證

取大鼠處死前最后一次超聲掃描數據與處死后體外甲狀腺游標卡尺測量結果進行分析,分別對甲狀腺的左葉、右葉的內外側、前后和頭尾直徑進行配對t檢驗,活體超聲掃描測量與甲狀腺體外測量結果沒有顯著性差異(P＞0.05)。結果如圖4。

圖4 兩側甲狀腺超聲掃描與游標卡尺測量各數值配對t檢驗結果Figure 4 Paired t-test results for each value of ultrasound scan and vernier caliper measurement of the thyroid gland on both sides

2.3 甲狀腺超聲檢查結果分析

甲狀腺由左、右兩葉和峽部組成。超聲頸前正中橫切面甲狀腺呈馬蹄型或者蝶形,頸側區縱切面呈上窄下寬的三角形,甲狀腺被膜顯示為光滑整齊的高回聲帶。對照組大鼠甲狀腺實質回聲呈均勻偏高回聲,內部可見血管呈管狀無回聲(圖5A)。超聲檢測模型組大鼠甲狀腺,出現兩側腺體不對稱性增大,其內存在異常組織,而且甲狀腺側葉有結節無包膜,邊界較為模糊,不規整,散在有點狀或條狀纖維增生的強回聲(圖5B)。運用t檢驗對對照組與模型甲狀腺的前后、內外、頭尾直徑進行對比,得到模型組的前后、內外直徑與對照組存在顯著性差異(P＜0.0001),頭尾直徑沒有顯著性差異(P＞0.05)。結果如圖5C～5H。

圖5 多普勒超聲影像檢測各組大鼠甲狀腺形態學特點分析Figure 5 Analysis of thyroid examination results analysis of morphological characteristics of thyroid gland in various groups of rats by ultrasonic imaging

2.4 甲狀腺病理學檢測結果分析

對甲狀腺切片進行HE染色后,在×400顯微鏡下觀察到對照組大鼠甲狀腺組織濾泡大小均勻,濾泡腔內膠質均勻,上皮細胞排列規整,可見少量毛細血管(圖6A);與對照組相比,模型組大鼠甲狀腺濾泡大小不規則,且上皮細胞增生明顯,排列紊亂,膠質壓縮分布不均(圖6B)。模型組大鼠甲狀腺組織改變符合結節性甲狀腺腫病理檢查診斷[9],與超聲診斷一致。

圖6 HE染色檢測各組大鼠甲狀腺病理學特點分析Figure 6 HE staining was used to detect the pathological characteristics of thyroid in various groups

3 討論

近些年來,甲狀腺基礎研究較早些年投入巨大,且不斷開發出新的甲狀腺動物模型[10],發表的相關文章數量不斷增加(圖7A、圖7B)。目前國內結節性甲狀腺腫動物模型多以大鼠為主,制作方法多樣,其原理都是通過不同方式誘使大鼠攝入碘降低,導致甲狀腺腫,Sun等[11]通過藥物誘導雌性SD大鼠含PTU的飲用水6周;Alayoubi等[12]通過喂食低碘鼠糧;Li等[13]喂養雄性Wistar大鼠甲減組含MMI的飲用水12周等來制作甲狀腺腫動物模型。

圖7 發表文章年度趨勢及類型Figure 7 Annual trends and types of published articles

結節性甲狀腺腫動物模型目前缺乏經濟、高效的評價方法。實驗室評價大鼠模型使用超聲診斷的極少,多以處死大鼠后、取甲狀腺進行HE染色,因其不可逆轉性使這種方法存在明顯不足。而超聲診斷結節性甲狀腺腫的靈敏度、特異性和安全性較高,該方法具有方便、經濟、快速、無創等優勢,且是臨床人群診斷的金標準。

本實驗探討超聲影像技術在大鼠結節性甲狀腺腫評價方面的應用。通過PTU連續灌胃8周,建立動物模型,再結合超聲和體外檢測對甲狀腺的大小、病理情況進行對照,結果一致。證明了超聲準確診斷大鼠結節性甲狀腺腫。同時通過此實驗明確了超聲下大鼠甲狀腺定位參數,為后續研究者的工作提供科學依據和技術參考。

本實驗利用超聲技術來評價結節性甲狀腺腫大鼠動物模型的建立,并利用病理學方法驗證了其檢測結果的準確性和可靠性,從而證實了超聲技術能夠較好的反映出結節性甲狀腺腫的形態,避免了在造模過程中對活體動物采樣所造成的損傷以及處死動物進行病理學檢測等缺點,影響模型的進一步研究。該技術的應用為今后甲狀腺疾病動物模型的評價建立提供了一種更方便的鑒定方法,同時也方便了缺乏超聲經驗的研究人員更快的操作超聲檢測大鼠甲狀腺疾病,為進一步研究甲狀腺疾病動物模型的發病機制和藥物篩選提供了保障。