中藥調控缺血性腦卒中后緊密連接的研究進展

陳婷玉蘇凱奇阮曉迪房 璐張鈺涵劉 昊馮曉東*

(1.河南中醫藥大學,鄭州 450046;2.河南中醫藥大學第一附屬醫院康復中心,鄭州 450000)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)在所有卒中類型中發病率最高,約占79.1%[1],并有逐年遞增的趨勢。高血壓、糖尿病、高脂血癥、肥胖、吸煙、缺乏運動等,均是引發IS的危險因素[2]。生理條件下,由多種蛋白質相互作用形成的緊密連接通過參與調節相鄰內皮細胞之間的溶質運動(即細胞旁擴散)來維持內環境穩態[3-4]。而腦組織在缺氧缺血環境中通過炎癥反應和氧化/亞硝化應激產生大量的促炎介質和氧化因子,嚴重破壞血腦屏障中TJ鏈的完整性[5];TJ鏈斷裂導致內皮細胞的細胞旁擴散屏障通透性大大增加,進一步加重了腦血管源性水腫和出血性轉化,繼而形成惡性循環[6]。

中藥被廣泛應用于治療腦血管疾病,且療效顯著。研究發現,中藥及其活性成分可以多方位、多途徑修復缺血性腦卒中后TJ損傷,降低腦梗死和水腫體積,進而改善IS的預后。因此,本文以腦微血管內皮細胞間的TJ為著眼點,對中藥從炎癥反應和氧化/亞硝化應激兩個重要方面防治BBB損傷減輕IS后神經功能障礙的研究現狀作一綜述,以期為臨床試驗中發現中藥干預IS發揮作用的新靶點提供理論依據。

1 TJ的成分與結構基礎

TJ的形成主要涉及特定的跨膜蛋白,即密封蛋白(claudin)、閉合蛋白(occludin),二者通過與胞漿蛋白(zonula occludens, ZO)的相互作用與細胞骨架相連[7],從而形成電荷選擇性孔道,僅允許離子和不帶電分子通過。

1.1 密封蛋白claudin

claudin是TJ中最為豐富的一類跨膜蛋白,通過同一膜內的順式配對(在一個細胞的質膜內)或跨膜反式配對(跨相鄰細胞的質膜)排列形成延伸鏈,跨越并封閉相鄰內皮細胞[8]。claudin的C端與輔助蛋白ZO的PDZ結構域相連。目前已知人體中存在23種claudin,其中claudin-1、-3、-5、-12廣泛分布于腦微血管內皮細胞。在大鼠的腦毛細血管中,claudin-5比 claudin-12的mRNA表達水平大約高出750倍,主要控制分子量＜0.8×103的小分子溶質的細胞旁擴散運動,是調節血腦屏障(blood brain barrier, BBB)內皮細胞運動和離子通透性的關鍵因子[9-11]。腦組織缺血缺氧破壞了claudin-5蛋白的排列結構,導致BBB通透性增大,加重血管源性腦水腫。然而,有研究發現在腦水腫發生后,靶向抑制claudin-5通過增加了BBB選擇通透性起到減輕水腫改善認知障礙的效果[12]。因此,針對IS后不同時段開發靶向調控claudin-5的藥物治療腦水腫可能具有很大前景。

1.2 閉合蛋白occludin

occludin是分子量為60×103～65×103的完整膜蛋白,包括兩個細胞外環(ECL)、一個細胞內環。occludin的ECL1含有大量酪氨酸和甘氨酸殘基,酪氨酸殘基參與形成氫鍵發揮疏水作用,而甘氨酸殘基則為TJ提供靈活性。ECL2富含酪氨酸殘基,含有兩個半胱氨酸,在氧化環境中形成二硫鍵,在缺氧環境下發生同源寡聚化;其胞質內的C端形成卷曲螺旋結構與ZO和肌動蛋白細胞骨架相連[13-14]。occludin異常降解會增加血腦屏障通透性,加重中樞神經系統疾病的進程。

1.3 胞漿蛋白ZO

ZO是一種普遍存在的支架蛋白,其谷氨酸激酶區與occludin的C端相連,并通過PDZ區與claudin的C端共同參與TJ的組裝。ZO還調節內皮細胞頂端細胞骨架的組成和功能并連接周圍的肌動蛋白。敲除犬腎上皮細胞中的ZO-1,細胞接觸形態發生顯著改變,肌動蛋白定位重新分布,TJ鏈的染色區域由曲變直,結構復雜性降低,對大于3.7?溶質的滲透性增高;在重組ZO-1后,連接接觸點的曲折度有所增加,降低了BBB的通透性[15]。由此說明,ZO不僅參與內皮細胞TJ的組成還維持了TJ正常的復雜結構。

2 缺血性腦卒中與TJ

IS后發生的炎癥反應、氧化/亞硝化應激等均會影響TJ的數量和空間結構[16],加重腦組織BBB屏障的損傷,提高死亡率。

2.1 炎癥反應與TJ

腦組織缺血時,促炎和抗炎細胞因子的表達迅速增加,其中腫瘤細胞壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和干擾素-β(interferon-β, IFN-β)等均是影響TJ的關鍵介質[17]。缺血因素增加基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2的分泌進而松解TJ網狀鏈但不改變其在內皮細胞裂隙內的位置,使得BBB通透性可逆性增加;繼發的神經炎癥產生多種炎性因子刺激MMP-9的分泌,起到進一步降解occludin、ZO-1以及誘導claudin-5重分布的作用[18-20]。小膠質細胞分泌的TNF-α以劑量依賴性方式激活MMP-2和MMP-9直接或間接調節天冬氨酸半胱氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)介導的TJ損傷和BBB高滲透性[21-22]。此外,研究者在培養人腦微血管內皮細胞實驗中發現,p38/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路密切參與了TNF-α和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)下調occludin磷酸化水平的過程[23-24]。LPS 還通過激活蛋白激酶C(protein kinasec, PKC)、Rho相關卷曲形成蛋白激酶1(Rhoassociated coiled forming protein kinase 1, ROCK1)破壞腦微血管內皮細胞TJ復合物的完整性[25]。缺血性腦卒中后,IL-1β的上調一方面激活了磷脂酶A2降解花生四烯酸,破壞內皮細胞磷脂雙分子層結構;另一方面,誘導細胞核因子-κB(nuclear factorκB, NF-κB)/p65的核轉位使周細胞分泌MMP-9,下調occludin、claudin-5和ZO-1的表達,造成TJ結構紊亂[26-27]。

由此可得,促炎因子通過降解TJ或下調其表達和磷酸化水平增加BBB通透性加重腦缺血損傷。然而,抗炎因子IFN-β1a和IFN-β1b則有效地防止了IFN-γ誘導的TJ解體,維持BBB屏障作用[28-29]。Krüppel 樣因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)在IS發生后通過調節黏附分子的表達、抑制氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)條件下的TNF-α誘導的NF-κB磷酸化,上調claudin-5和ZO-1的表達水平,進而減輕腦缺血引起的神經炎癥[30]。

2.2 氧化/亞硝化應激與TJ

氧化應激和亞硝化應激可以通過多種途徑強力破壞TJ組成的內皮細胞屏障。活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)均是缺血誘導產生的自由基,在氧化/亞硝化應激損傷中發揮關鍵作用。ROS降低跨內皮電阻值(transendothelial electrical resistance, TEER)、下調ZO-1和claudin-5的表達并中斷了二者連續排列的共定位生理結構[31]。一氧化氮(NO)和過氧亞硝酸鹽(ONOO-)是典型的RNS。腦組織缺血缺氧后H2O2、NO大量產生,不僅降低了ZO-1和occludin的表達,還將二者的相互作用部位從細胞間隙轉移至細胞質內,進一步加重BBB屏障功能的損傷[32]。NO還影響半胱氨酸與Zn2+的相互作用,暴露Zn2+的活性位點進而活化MMP-9;與此同時,NO與超氧陰離子發生反應生成ONOO-,激活MMP-9和MMP-2降解TJ和細胞外基質導致BBB結構的破壞[5]。氧化應激還通過酪氨酸激酶途徑誘導occludin-ZO-1和鈣粘蛋白-β-連環蛋白復合物的酪氨酸磷酸化與TJ的重新分布[33]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在腦組織缺氧后表達增加,與VEGF受體(VEGFR)-2結合后激活內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)通路下調ZO-1和occludin的表達發揮血管通透性調節劑的作用[34-35];在IS急性期,VEGF還可以劑量依賴性地增加MMP-9活性、降低occludin和claudin-5蛋白的表達[36]。VEGF對MMP-9活性和TJ損傷的增強效應可由血管緊張素-1(angiotensin-1, Ang-1)抑制[37]。核轉錄因子-E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)可以調節內源性抗氧化過程,上調ZO-1和occludin,維持BBB的完整性[38]。

由此可得,在IS發生后,炎癥和氧化因子的釋放繼而引發的MMPs的激活是影響TJ降解和重塑的主要原因。明確上述病理過程與TJ的相互作用機制對于發現保護缺血性腦卒中后血腦屏障破壞、減輕神經系統損傷的新藥物至關重要(見圖1)。

圖1 中藥對缺血性腦卒中TJ的保護機制Figure 1 Protective mechanism of traditional Chinese medicine on tight junction in ischemic stroke

3 中藥干預對缺血性腦卒中后TJ的影響

中藥可以更好的適應復雜的人體環境,從宏觀的角度發揮神經保護作用。近年來許多基礎研究顯示中藥單體及其提取物、中藥復方通過抑制炎癥反應和氧化/亞硝化應激等過程修復缺血性腦卒中后TJ的損傷,預防并減輕大腦功能損害。

3.1 中藥單體及其提取物

現將保護缺血性腦卒中后TJ的中藥活性成分依據不同的功效分類為清熱類藥、活血類藥、補腎類藥、升陽類藥等,并就其保護機制進行詳述(見表1)。

表1 中藥單體及其提取物對缺血性腦卒中TJ調控的效應Table 1 The effects of Chinese medicine monomers and their extracts on tight junction regulation of ischemic stroke.

3.1.1 清熱類藥

胡桃楸有清熱解毒、止痢明目的功效。Liu等[39]用其提取物胡桃苷(Juglanin)預處理可通過抑制缺氧誘導的VEGF和VEGFR2的增加提高大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型小鼠的occludin和ZO-1蛋白的含量;并將體外實驗中細胞死亡率由21.6%降低至12.3%。外源性VEGF-A(屬VEGF家族)抵消了胡桃苷對內皮細胞以及TJ的保護作用,證實胡桃苷作用于VEGF/VEGFR2信號通路恢復occludin和ZO-1的正常表達減少內皮細胞損傷。

黃芩有瀉火解毒、止血安胎的功效。黃芩的提取物黃芪苷,一方面抑制LPS誘導IL-1β和TNF-α的產生引起的血腦屏障中TJ的減少,起到“節流”的效果,并上調claudin-5和ZO-1蛋白的表達發揮“開源”的作用;另一方面激活Nrf2信號通路降低氧化應激水平,上調Nrf2、HO-1和醌氧化還原酶-1(nadph quinine oxidoreductase 1, NQO-1)的表達,以此來減輕炎癥反應與氧化應激對腦組織的損傷[40]。

冬凌草有消炎止痛、清熱解毒、健胃活血的功效。冬凌草甲素有效增加缺血性腦卒中后血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)和Nrf-2所調控的抗氧化因子NQO-1的表達,降低同側大腦中的ROS水平,促進Nrf-2的核轉位防止氧化應激誘導的內皮損傷。除此之外,冬凌草甲素還可防止外周炎性細胞浸潤并減少IS后的神經炎癥進而保護TJ[41]。

3.1.2 活血類藥

燈盞花具有活血化瘀,通脈止痛的功效。燈盞花素注射液是以燈盞花乙素為主要成分的一種中藥制劑。燈盞花注射液減少缺血引發的誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的合成,抑制MMP-9的活化;3,5-二咖啡酰奎寧酸(燈盞花的化學成分之一)通過減少iNOS的活化和自由基的生成兩種途徑抑制MMP-9的表達和活化,從而減少claudin-5的降解。由此得出,燈盞花素減輕腦缺血損傷的分子機制主要是通過ROS/RNSMMPs-TJ信號通路保護血管內皮細胞間的TJ實現[42-43]。

丹參有活血化瘀、通經止痛的功效,其提取物隱丹參酮通過抑制MMP-9上調ZO-1、claudin-5和occludin的表達,從而改善OGD/R誘導的TEER值的降低和內皮通透性的增加[44]。

南蛇藤屬有祛風除濕活血止痛、利尿解毒的功效。Luo等[45]以OGD誘導腦內皮細胞發生缺氧性損傷,發現南蛇藤素通過激活MAPK信號通路以濃度依賴性的方式恢復缺氧誘導的TEER損失,并上調內皮細胞中occludin、claudin-5和ZO-1的表達。

三七有活血祛瘀、通脈活絡的功效。Liu等[46]發現體外實驗中,三七皂苷R1激活質膜微囊caveolin-1/MMP2/9通路,恢復質膜中ZO-1、claudin-5的表達,并介導occludin和caveolin-1的重分布。此外,研究證實PI3K/Akt/Nrf2信號通路在三七皂苷抑制ROS生成和TJ降解,保護腦微血管內皮細胞免受OGD/R誘導的BBB破壞中發揮重要作用[47]。

藏紅花有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效。在腦缺血動物模型中,藏紅花素預處理可以顯著改善缺血所致的腦損傷,阻斷MMP-2和MMP-9對TJ的破壞[48]。同時,藏紅花素還可以抑制氧化應激和炎癥級聯反應[49],而這兩者與TJ的損傷密不可分。

當歸有補血和血,調經止痛,潤燥滑腸的功效。當歸根部(Angelica gigantis radix, AGR)通過激活PI3K/Akt通路顯著增加Ang-1、VEGF、酪氨酸蛋白激酶受體-2(Tie-2)、ZO-1和occludin的表達,降低了缺血誘導的BBB 通透性和神經元死亡[50]。

益母草有活血祛瘀、利尿消腫的功效。益母草堿是益母草的提取物,研究證實,通過調節組蛋白去乙?；?(histone acetylation, HDAC-)4/NOX4/MMP-9-TJ信號通路,上調claudin-5、occludin和ZO-1改善神經功能缺損[51]。

3.1.3 補腎類藥

淫羊藿具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ, ICS-Ⅱ)作為主要提取物之一,可以提高卒中后大鼠神經元存活率,維持海馬、皮質、紋狀體神經元的結構完整。分子對接結果顯示ICS-Ⅱ可以直接結合MMP-2、MMP-9,調控皮質和紋狀體中MMP-2、MMP-9與基質蛋白酶抑制劑 1(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMP1)的平衡并抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)依賴的凋亡途徑,顯著增加claudin-5、occludin、ZO-1蛋白表達[52]。

地黃有滋腎陰、補腎陽和化痰開竅的功效。將地黃中提取的梓醇與LPS、腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)共培養24 h后,梓醇顯著逆轉了LPS造成的BMECs核固縮、細胞輪廓模糊、肌動蛋白帶鋸齒狀斷裂、ZO-1和claudin-5表達大幅減少的現象;增加了內皮細胞數目,恢復了細胞骨架形態,并重構細胞間的TJ。該實驗進一步發現梓醇拮抗LPS保護TJ蛋白的過程與其阻斷 RhoA/ROCK2 信號通路的作用密不可分[53]。

蟲草有益腎壯陽、止血化痰、補肺平喘的功效。蟲草素抑制 IL-1β、iNOS、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和MMP-9的表達,降低創傷性腦損傷后NOX1的表達和活性,保護緊密連接蛋白ZO-1和occludin的丟失[54]。

肉蓯蓉有補腎壯陽的功效。研究者發現肉蓯蓉總苷通過上調細胞核中Nrf-2的水平并下調其負調節因子Keap1,增加SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量,減輕氧化應激損傷,進而顯著上調claudin-5、occludin和ZO-1的表達維持BBB的完整性[55]。

3.1.4 升陽類藥

黃芪具有補氣升陽、固表止汗、脫毒排膿、利水消腫的功效。黃芪甲苷可以激活 Nrf2 信號通路減輕LPS 對ZO-1、occludin和claudin-5的破壞,同時抑制炎癥反應并阻止單核細胞的粘附,從而保護BBB的物理屏障[56]。有研究發現,黃芪甲苷還參與調節MMP-9進而介導炎性小體NLRP3/caspase-1信號通路減輕缺氧缺血誘導新生大鼠的腦損傷[57]。因此可以合理的猜想黃芪甲苷對TJ的保護作用可能與其對MMP-9的調控存在時空交叉作用。

人參有強身益智、安神明目、 延年益壽的功效。人參皂苷Rb1(GS-Rb1)是30多種人參皂苷中含量最為豐富的一類。研究人員對MCAO模型小鼠腹膜內注射GS-Rb1后發現GS-Rb1可以有效抑制腦組織因缺血誘發的炎癥和氧化反應。其不僅使促炎因子IL-1β、MMP-9表達下降、抗炎標志物IL-10表達增多;還抑制了NOX活性減輕了氧化損傷,起到保護同側皮質中occludin和ZO-1的作用[58]。

3.2 中藥復方

大量基礎研究表明,中藥復方可以多方位多靶點地抑制炎癥反應與氧化/亞硝化應激進而修復缺血性腦卒中后TJ的損傷,保護血腦屏障,減輕神經功能障礙(見表2)。

表2 中藥復方對缺血性腦卒中緊密連接調控的效應Table 2 Effect of Chinese herbal compound on tight junction regulation of ischemic stroke

通心絡膠囊由12種中藥成分組成,有通絡止痛、益氣活血的功效。星形膠質細胞分泌的血漿音猬因子(shh)與其受體Patched和Smoothened(Smo)蛋白共同構成shh通路。在缺血條件下shh誘導Ang-1的產生,修復腦微血管內皮細胞之間受損的TJ,起到保護大鼠缺血性腦卒中后BBB屏障進而減輕腦水腫的作用[59-60]。通心絡膠囊可以激活shh通路,增加大腦內皮中TJ的表達。在環巴胺(Smo及其下游信號分子的阻斷劑)與通心絡膠囊聯合給藥時,通心絡膠囊對TJ的上調作用消失[61]。此外,通心絡膠囊還可以下調低密度脂蛋白受體相關蛋白-1(LDL-receptor related protein 1, LRP-1)的水平,繼而增加occludin、claudin-5和ZO-1的表達,并減少梗死區BBB的滲漏[62]。

黃芪赤風湯由黃芪、赤芍、防風3味中藥配制而成, 有行氣活血、祛風通絡的功效。黃芪赤風湯可以降低MCAO大鼠腦組織中IL-1β含量,抑制炎癥反應進程,下調MMP-9表達水平,提高ZO-1、claudin-5蛋白的表達,改善腦缺血狀態[63]。

參桂三生散,由人參、當歸和肉桂組成,通過抑制MMP-2、MMP-9的表達以及TJ和鈣粘蛋白(VECadherin)的降解,增強內皮間連接復合物的穩定性。該過程伴隨著血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)與其受體含量的增加,使用血管活性腸肽拮抗劑加劇了BMECs的細胞旁屏障損傷證實,參桂三生散保護TJ減輕腦缺血損傷除了作用于MMPs外,還與血管活性腸肽密切相關[64]。

七十味珍珠丸,含有70多種藥材,是治療腦血管疾病常用的藏藥方劑。七十味珍珠丸可激活腦缺血再灌注模型大鼠p38/MAPK信號通路下調其腦組織中TNF-α、IL-1β和MMP-9水平,穩定TJ的成分[65-66]。

參附湯是益氣溫陽固脫的代表方劑。張偉[67]發現,參附湯通過上調脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)的限速酶肉堿棕櫚酰轉移酶1A(carnitine palmitoyl transferase 1A, CPT1A)的水平保護缺血再灌注損傷大鼠的TJ,且其作用優于人參和附子單味中藥單獨引發的保護效應。然而脂肪酸氧化與TJ的相互作用機制仍需進一步闡明。

麝香黃芪復方滴丸是在補陽還五湯的基礎上添加麝香、冰片配置而成。張運克等[68]發現麝香黃芪復方滴丸上調MCAO大鼠大腦中occludin、claudin-5、ZO-1的表達進而修復BBB損傷,實現保護腦組織、降低腦水腫的作用。

4 小結與展望

隨著研究的深入,學者們逐漸證實TJ可作為中藥治療IS的效應靶點。本文經分類總結后發現,中藥單體常選用清熱類、活血類、補腎類、升陽類藥物,其作用機制與抑制IS后炎癥與氧化亞硝化反應、抑制MMPs的激活、上調抗氧化因子的表達等有關,對緊密連接蛋白claudin、occludin、ZO起到一定的保護作用。同時經歸納分析得出,對IS后上述3個蛋白起作用的中藥復方大多具有通絡止痛、益氣活血、醒神開竅的功效。

中藥療法作為一種有效的保護血腦屏障TJ的防治手段,被廣泛應用于基礎研究,但是對其作用機制梳理過程中也發現很多不足之處:大部分研究僅觀察了中藥對腦內皮細胞間TJ蛋白表達的改變,其產生影響的復雜機制仍需深入探討;其次,多數實驗采用基因與人類同源性較高的鼠類作為研究IS與血腦屏障相互影響的對象[69],仍缺乏臨床試驗研究,未來還需建立中醫癥候群模型實驗與臨床試驗研究,以更進一步的揭示中藥治腦病的科學作用。因此,在現有的研究基礎上,明確中藥調控IS后TJ的具體保護機制,進一步篩選和研發改善IS后神經功能損傷的藥物至關重要。