過敏性哮喘大鼠模型的建立方法與評價

樓金成苗鐔允蘇嘉琪胡 情翟春濤*呂玉娥

(1.山西中醫藥大學,山西 晉中 030600;2.山西省針灸醫院,太原 030006)

過敏性哮喘(allergic asthma,AS)是一種由2型炎癥反應介導的超敏反應所引起的氣道慢性損傷性炎癥疾病[1]。一系列潛在機制導致氣道炎癥,導致可變氣流受限和呼吸道癥狀如喘息、氣短、胸悶和咳嗽等是過敏性哮喘最典型的特征[2]。在過去幾十年中,其流行率大幅上升,全世界有大約3.5億人受其影響,尤其是在兒童中,患病率顯著增加[3]。目前尚無完全治愈方法,但可以通過醫生和患者教育、避免環境過敏原暴露、規范化藥物治療和變應原特異性免疫治療(allergen specific immunotherapy,AIT)等方式來幫助控制癥狀[4]。

目前過敏性哮喘動物模型的實驗動物種屬的選擇主要集中在豚鼠、小鼠和大鼠三大類[5]。其中豚鼠作為最經典的過敏性哮喘動物選擇,可以誘導與人類最相似的炎癥反應和氣道高反應性。但通常誘導的過敏性哮喘豚鼠模型是由IgG介導的是Ⅰ型變態反應,同時個體反應差異較大,同一批豚鼠同一致敏濃度會出現不致敏或過度致敏導致死亡共存的現象[6]。此外,較少的相關生物學抗體和昂貴的價格使豚鼠不再是構建過敏性哮喘的理想動物模型。大鼠和小鼠的過敏性哮喘動物模型同樣具有許多人類過敏性哮喘的特征。然而,過敏性哮喘的主要癥狀,如氣道高反應性和炎癥,在大鼠中比在小鼠中更容易再現[7]。此外,與小鼠相比,大鼠體型更大更加容易處理,且能收集到更多的樣本。因此,過敏性哮喘大鼠模型的重要性日益增加[8]。本文就近5年國內外通過大鼠構建過敏性哮喘模型的文獻進行匯總,從大鼠的品系、造模方法、模型評價等方面對過敏性哮喘大鼠模型的構建進行比較分析。

1 文獻來源

以(“過敏性哮喘”或“變應性哮喘”)和“大鼠”為主題,時間設定為2017年1月～2022年4月在中國知網(CNKI)、萬方醫學網、維普期刊全文數據庫,并在PubMed數據庫(2017～2022)上以“Allergic Asthma”和“Rat”為關鍵詞進行檢索,其中CNKI數據庫檢索到文獻105篇,萬方數據庫38篇,維普數據庫17篇,PubMed數據庫159篇,選擇通過過敏性哮喘大鼠模型進行研究的實驗文獻、碩博論文,排除綜述、科技成果、會議類文獻和重復類文獻,共有18篇文獻符合要求。以下就文獻從大鼠的品系、造模方法、模型評價指標等方面進行整理,詳細見表1。

表1 過敏性哮喘大鼠模型構建方法Table 1 Construction method of allergic asthma rat model

續表1

續表1

2 大鼠品系

雄性SD大鼠和雄性Wistar大鼠是過敏性哮喘大鼠模型中最常用的品系,兩種大鼠致敏后產生的遲發性過敏反應的時間與臨床患者時間接近[27]。其中雄性SD大鼠應用較多,可能與其可長時間耐受高濃度激發,從而出現典型的過敏性炎癥反應有關[28]。其中,也有文獻[26]提到的用雌性BN大鼠造模,并提出與前兩種大鼠相比,過敏原致敏后的BN大鼠能更加容易的產生IgE反應,是研究過敏性哮喘最合適的大鼠品系,在國際上使用率越來越高。但較低的繁殖率和高昂的價格,在國內的使用率較少(表2)。

表2 過敏性哮喘模型所用大鼠品系的頻數及占比Table 2 Frequency and proportion of rat strains used in allergic asthma models

3 造模方式

過敏性哮喘是一種環境與機體相互影響的疾病,其發病機制主要分為致敏即免疫記憶階段和效應階段兩方面[4]。免疫記憶階段:當過敏原首次進入氣道時,會被抗原提成細胞(如樹突狀細胞)識別并把他們加工成小肽后與細胞膜表面的主要組織相容性復合體(MHC)II類分子結合形成復合物,并通淋巴管向幼稚的CD4+Th細胞提供過敏原成分,在存在2型細胞因子的情況下,產生過敏原特異性Th2。由Th2細胞產生的IL-4可以促進B細胞成熟并分化為漿細胞,生成抗原sIgE,sIgE與肥大細胞表面的高親和力IgE受體FcεRI結合,生成IgE抗體,使機體致敏,其中部分增殖的效應Th2成為過敏原特異性記憶T淋巴細胞[4]。效應階段:當過敏原再次進入機體時,被血液內的IgE識別并結合,促使肥大細胞(Mast Cell,MC)脫顆粒,釋放炎性介質產生早期過敏性反應[6,29],表現為血管擴張和支氣管收縮等,導致支氣管結構功能改變,形成急性哮喘癥狀[30]。氣道慢性炎癥反應是效應階段的延續,Th2細胞向氣道炎癥部位遷移,在炎癥部位受到過敏原攻擊時,氣道局部釋放的趨化因子使Th2細胞釋放2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等。IL-5對促進組織嗜酸性粒細胞增多和肥大細胞增生至關重要,而IL-13可以刺激杯狀細胞產生粘液并誘發氣道高反應(Airway Hyper Reactivity,AHR)[31]。故在過敏性哮喘動物模型的造模時,主要也分為兩個階段,分別是致敏期和激發期。

3.1 致敏期

卵清蛋白(OVA)是使用最多的致敏原[32],主要分為單純OVA和復合OVA(含佐劑,主要包括Al(OH)3等)兩大類,具有較強的抗原性和免疫原性。

3.1.1 致敏濃度

分析前文篩選的文獻發現,所選文獻中共出現了7種不同的OVA致敏濃度。在7種致敏濃度中,最常用的是將1mg OVA溶于含有一定量佐劑(Al(OH)3)中(7篇,38.9%)。致敏濃度及頻數見表3。隨后將所有文獻中所提的OVA的產品目錄號及所對應純度進行檢索并整理,發現在一定程度上,致敏濃度的選擇與所選OVA的純度有關,所以過敏性哮喘大鼠模型致敏期間所用的具體造模濃度的選擇應根據自身所擁有OVA的純度來決定。

表3 過敏性哮喘大鼠模型各致敏濃度的頻數和占比Table 3 Frequency and proportion of each sensitizing concentration in allergic asthma rat model

3.1.2 致敏方法

致敏操作方法主要分為3種,分別是腹腔注射、皮下注射和皮下注射聯合腹腔注射。見表1。同時發現致敏時適當地使用特殊佐劑如脂多糖(LPS)[25]或百日咳毒素[17,26]可以有效的加強致敏效果。

3.2 激發期

最常用來激發哮喘的方式是通過OVA霧化激發,OVA的濃度范圍通常在1%～5%之間,霧化次數在7～14次不等。也有文獻[26]提示可以通過鼻內滴注的方式來激發哮喘。有研究將相同致敏方式和致敏濃度的大鼠分別用同一濃度的OVA分別霧化激發4周和8周,發現兩組大鼠氣道損傷情況雖然有些許差異,但差異無統計學意義[33]。

4 模型的評價指標

分析前文篩選的文獻,總結文獻中關于造模后模型的評價指標主要包括:(1)發作時一般行為學觀察;(2)肺組織病理形態學觀察;(3)肺功能檢測;(4)Th2型細胞因子;(5)血清免疫球蛋白IgE;(6)炎性細胞浸潤情況(表4)。

表4 過敏性哮喘大鼠模型評價指標Table 4 Evaluation index of allergic asthma rat model

4.1 發作時一般行為學觀察

過敏性哮喘大鼠模型哮喘發作期的典型癥狀表現為造模期間頻繁并持續的出現呼吸加快并伴有喘息、口唇黏膜發紺、腹肌痙攣、毛色暗淡并伴有豎起、抓耳撓腮等,并隨著激發次數的增多,癥狀會加重且出現的頻率逐漸增加。金禹彤等[14]通過記錄各組大鼠引喘潛伏期與發作總持續時間比較;李潘營等[13]通過霧化磷酸組胺和2%的氯化乙酰膽堿等量的混合液后,從第1次喘息開始記錄大鼠2 min內的喘息次數來對過敏性哮喘大鼠模型進行評價。

4.2 肺組織病理形態學觀察(HE染色)

肺組織的病理形態學觀察可以直觀的反映在過敏性哮喘發病及持續過程中,肺組織在炎性細胞的浸潤下,不斷的損傷和修復后產生的病理結構性改變。在過敏性哮喘大鼠模型的肺組織HE染色中,可以看到大鼠支氣管周圍會出現大量的炎性細胞浸潤,部分細支氣管上皮壞死,杯狀細胞增生、肥大,支氣管壁增厚和肺泡嚴重變形等一系列表現。

4.3 Th2型細胞因子

過敏性哮喘是一種由2型炎癥反應介導的慢性肺損傷性炎癥,Th2細胞在2型炎癥反應的啟動、維持和增殖中發揮重要作用。當過敏原暴露并進入呼吸道時,樹突狀細胞攝取這些過敏原并引導Th2細胞的增殖分化,從而導致Th2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等的分泌增加。Th2反應是IgE介導的致敏、氣道高反應性 (AHR) 和嗜酸性粒細胞浸潤的基礎,這些都是過敏性氣道疾病的標志。

4.4 血清免疫球蛋白IgE

IgE在過敏性哮喘的發病過程其起著非常重要的作用。Th2細胞通過分泌IL-4和IL-13來激活B細胞的發育并分化成分泌IgE的漿細胞。分泌的IgE與肥大細胞(MC)表面的FcεRI受體結合。再次暴露于該抗原會導致IgE結合的FcεRI受體的交聯化,繼而導致MC脫顆粒,再次釋放先前合成的細胞因子(IL-4和IL-13)導致氣道炎癥的進行性加重,以及合成新的炎癥介質(如組胺、趨化因子和白三烯等)[6,29]。MC釋放的炎癥介質刺激其他炎癥細胞以及結構內皮細胞、上皮細胞和平滑肌細胞,導致支氣管痙攣和氣道黏液分泌增加,誘發氣道高反應(AHR),加重過敏性哮喘的進程[34]。

4.5 嗜酸性粒細胞浸潤情況

Th2細胞分泌的IL-5主要負責骨髓和組織中嗜酸粒細胞的生成和激活。在過敏性哮喘患者的支氣管肺組織中存在大量炎性細胞浸潤[35],嗜酸性粒細胞是其關鍵的炎癥細胞,在過敏性哮喘的氣道高反應性、粘液產生和氣道重塑中都發揮重要作用。有研究表明通過促進EOS的調亡,可以有效減輕氣道炎癥,從而達到緩解過敏性哮喘的目的[36]。

4.6 肺功能檢測

肺功能檢測是診斷哮喘和評估哮喘控制程度的重要檢查方法[37]。最常用來進行哮喘模型肺功能檢測的方式是肺功能氣道反應性測試,用梯度濃度的乙酰膽堿對哮喘模型進行激發并觀察呼吸阻力情況。過敏性哮喘模型大鼠檢測時可以發現,各梯度乙酰膽堿激發模型組大鼠呼吸阻力較空白組升高明顯(P＜0.01)。同時,李潘營等[13]提出,也可以通過氧合指數檢測、肺通透指數等方面來對過敏性哮喘大鼠的肺功能進行評價。

5 總結

隨著過敏性哮喘動物模型的出現,大大加快了過敏性哮喘的研究進程,但現有的哮喘模型僅能表現過敏性哮喘某特定階段的部分病理表現。雖然至今還沒有任何一種哮喘動物模型能完全概括人類過敏性哮喘的發生發展過程,但是通過動物實驗過程中構建過敏性哮喘動物模型,能使我們更好的研究藥物及其他治療方法對過敏性哮喘機制的影響,為實驗結果應用于臨床提供可靠幫助。本文對近5年來制作過敏性哮喘大鼠模型時所選用的常用大鼠品系、不同的致敏方式和致敏濃度,以及部分評價造模成功時的指標進行了綜合闡述,為后續研究人員在制作過敏性哮喘大鼠模型時,能更準確地選擇大鼠品系以及試劑種類,并以此選擇合適的造模方式及造模成功的評價方式,提供了有力支持,并推進實驗順利開展。