羊肚菌連續繼代培養對菌絲老化的影響

●田 芳 金 麗 李 賓（鄭州市農林科學研究所 河南 鄭州 450007）

羊肚菌是一種珍稀的食用菌，隸屬于子囊菌亞門，因形似羊肚而得名。羊肚菌具有高蛋白、低熱量的特征，兼具保健功能，深受大眾的喜愛。自從2012年羊肚菌在我國開始規模化的人工栽培，種植面積和規模逐年增加。菌種質量的好壞直接決定著羊肚菌最終的產量和品質，菌種的退化會直接造成羊肚菌的減產甚至絕收，因此研究菌絲老化現象對羊肚菌產業發展至關重要。目前，關于羊肚菌繼代培養與菌絲老化關系的研究較少，結果也不相同。劉偉等[1]研究表明，10個高羊肚菌菌株在繼代培養中，菌絲老化啟動階段，生長速度無明顯變化，只是形態上主菌絲會變的稀疏；老化死亡階段，生長速度急劇下降，菌絲邊緣變的不整齊。錢可晴等[2]研究發現，梯棱羊肚菌在繼代培養中生長速度呈逐漸下降趨勢，第15代菌絲停止發育。劉璐[3]發現“六妹”羊肚菌的生長速度呈現先上升后下降的趨勢，在第8代時達到峰值。由此推測，不同品種、同一品種不同菌株的羊肚菌，其衰老特性不同，因此進一步研究不同菌株的衰老特性很有必要。

老化是一種自然現象，在生物界普遍存在，目前對真菌的老化，并沒有統一明確的理論解釋，支持較多的是與自由基的積累、線粒體DNA受損相關，其過程受到細胞質遺傳因子的調控[3-4]。但羊肚菌作為微生物界更為低等的子囊菌，菌絲更容易老化，其老化現象也更為普遍，老化會造成菌絲活力下降甚至停止發育。然而，在生產中，通過繼代培養擴繁菌種的現象較為普遍。另外，在菌種的低溫保藏過程中，試管也需要定期進行一次繼代，以保持菌種的活力。何培新[4]認為，連續繼代培養20代以上仍未出現明顯老化的菌株，才能作為潛在的優良菌種，菌種老化程度與羊肚菌的最終產量呈負相關，“六妹”羊肚菌在繼代培養的第2代，梯棱羊肚在第6代，栽培產量下降50%[3，5-6]。因此，播種前最好對菌種的活力進行測定，確保菌種質量較佳。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株所有菌株均為鄭州市農林科學研究所在河南和新疆試驗基地經過3～5年馴化后篩選所得的優良菌株。代號中的“7”代表“七妹”羊肚菌，“6”代表“六妹”羊肚菌，2018LM代表2018年四川引種后連續種植4年后篩選的優良菌株。融合種是由引自榆林的“七妹”和引自四川的“六妹”通過原生質體制備、再生后篩選得到的改良菌株。701M1和701M4為分離同一菌株子實體得到的不同組織塊，其他均來自不同羊肚菌菌株的子實體（表1）。

表1 供試菌株的代號及引種地統計

1.1.2 供試培養基PDA培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂22 g，葡萄糖20 g，加水至1000 mL，pH自然。121℃高壓滅菌20 min，冷卻至50℃下，在超凈臺中倒入9 cm平板即可。

1.2 方法

1.2.1 母種的獲得采用干菇組織分離的方法獲得。待子實體生長至七八成熟，菌蓋上的褶還未完全展開即可采集所需菌株，選取形態好、肉厚、菌柄白、無病害的羊肚菌子實體帶回實驗室陰干，做好菌株標記。在紫外消殺后的超凈工作臺中，先用手術刀從子實體的菌蓋和菌柄交接處切下1 cm×1 cm大小的組織塊，放置于10 mL無菌離心管中，加入無菌水浸泡5 min左右，組織塊膨大變軟即可，倒掉廢液，無菌水沖洗一次，將組織塊取出置于裝有75%乙醇的10 mL無菌離心管中，準確計時消毒15 s，迅速用鑷子將組織塊取出置于新的無菌水中浸泡，反復沖洗3次，隨后取出組織塊置于無菌濾紙上，吸干水分。最后在無菌濾紙上用無菌解剖刀切掉組織塊邊緣，分成0.5 cm×0.5 cm大小的塊，放置在PDA平板上22℃黑暗培養2～3 d，至菌絲萌發至直徑3～5 cm即可進行純化獲得母種。

1.2.2 繼代培養用直徑5 mm的打孔器在萌發的菌絲邊緣進行打孔，然后用接種鉤轉接到新的PDA平板中，待菌絲長滿后將平板4℃保存，即為母種，這里稱作第一代菌株，標記為D1。取其中的一個D1平板，在菌絲長滿平板之前，沿著菌絲生長方向的最前端，用直徑5 mm的打孔器取打孔，然后挑取組織塊放置于新的平板一端，組織塊要按照菌絲生長的方向放置，最后將平板置于22℃黑暗條件下培養，得到的菌株即為D2。按照以上方法，進行后續的繼代培養，直至菌絲死亡，每一次轉接即為新的一代，轉接要在菌絲長滿平板前進行。

1.2.3 不同代數生長速度的測定每隔24 h，以接種的組織塊生長邊緣為起點，用刻度尺選取3個不同方向，測量菌落的半徑，3次的平均值即為菌落半徑，并做好數據統記。生長速度（mm/h）=菌落半徑（mm）/時間（h）。同時要注意，每次測量都要在菌絲長滿平板之前進行。

1.2.4 菌落的形態觀察組織塊轉接到新的PDA平板后，每天做好菌絲濃密度、粗壯度及整齊度的記錄，并對10個不同菌株的繼代培養菌絲長勢進行打分。最后將每個菌株所有代數的長勢得分相加，除以代數得到平均值，數值越高，說明菌絲長勢越濃密、越粗壯、邊緣越整齊。菌絲濃密度分為4個等級：稀疏記0分，較稀疏記1分，較濃密記2分，濃密記3分；菌絲粗壯度分為4個等級：纖細記0分，較纖細記1分，較粗壯記2分，粗壯記3分；整齊度分為4個等級：不整齊記0分，較不整齊記1分，較整齊記2分，整齊記3分。同時，菌株的色素產生情況也要及時做好記錄。

2 結果與分析

2.1 不同菌株的繼代培養生長速度測定

從圖1可以看出，10個菌株繼代培養的生長速度均不相同。其中701M1、601M1、601M6、2018LM菌株的生長速度最快，701M4、701M5、72M11菌株的生長速度次之，701M6、73M1、XZ菌株的生長速度最慢。隨著連續培養代數的增加，菌絲生長速度呈緩緩下降的趨勢，出現小范圍升降波動屬于正常現象。在培養30代之前，10個菌株均能在4 d內長滿平板。30代以后，10個菌株的菌絲生長速度均出現急劇下降，菌絲迅速老化死亡。這與劉偉等[1]報道的高羊肚菌在老化啟動階段其菌絲生長速度與旺盛期無明顯變化一致。另外，從生長速度急劇下降的時間來看，2018LM在31代菌絲停止生長，73M1的老化死亡發生最晚，在43代出現。比較而言，“六妹”羊肚菌的老化死亡時間要早于“七妹”羊肚菌和“六妹”與“七妹”融合種，融合種的老化性狀更接近于“七妹”羊肚菌，“七妹”羊肚菌最不容易老化。

圖1 10個菌株的繼代培養生長曲線

2.2 菌落的形態觀察

從表2可以看出，根據統計的長勢得分值，72M11的菌絲整齊度、菌絲濃密度和粗壯度均為最佳，其次是73M1菌株，701M1、701M5和701M6的菌絲也都較整齊、濃密和粗壯，XZ、2018LM1的菌絲整齊度、濃密度和粗壯度最差。同時，連續培養10代以后，所有菌株均出現菌絲邊緣的整齊度下降，主菌絲變纖細且稀疏，次生菌絲減少，逐漸呈現出老化的現象，推測可能菌絲生長已經進入老化啟動階段。另外，分離自同一個菌株子實體的菌絲長勢701M1要優于701M4菌株，說明菌絲長勢具有個體差異性。

表2 10個菌株在繼代培養中的菌絲長勢統計 單位：分

另外，本試驗發現在繼代培養過程中，第2代的701M4、701M6、72M11、73M1、701M5在培養后7 d產生黃褐色的色素，2018LM在培養后10 d產生黃褐色的色素，601M6在培養后14 d產生色素，601M1、XZ、701M1這3個菌株一直未形成色素。培養至第10代時，701M4、701M6、72M11、73M1、701M5于5 d左 右 產 生 色 素，2018LM于7 d左右產生色素，601M6于10 d左右產生色素，601M1、XZ、701M1這3個菌株依然未形成色素，701M5和72M11產生氣生菌絲較多。從這里看，隨著培養代數的增加，色素產生提前，“六妹”產生色素的時間要晚于“七妹”，但是從生長速度來看，“六妹”的老化卻早于“七妹”，推測色素產生和菌株的老化存在一定的關系，但是否有必然的關系，還需要更進一步的數據支持。

3 結論與討論

菌種的老化會直接影響羊肚菌的產量和品質。在羊肚菌生產中，通過繼代培養擴繁母種的現象較為普遍，實驗室也經常采用繼代培養的方式進行菌種保藏，因此研究繼代培養對菌絲老化的影響意義重大。本試驗中，10個菌株的羊肚菌在繼代培養過程中，均在不同時間出現老化現象，生長速度急劇下降，菌絲變得稀疏、纖細、邊緣出現參差不齊，色素產生時間提前。其中，“六妹”羊肚菌2018LM、601M1、601M6的生長速度相對更快，產生色素的時間也晚于“七妹”羊肚菌和融合種，但是菌絲整齊度不如“七妹”羊肚菌，老化時間也比“七妹”羊肚菌和融合種提前，“七妹”羊肚菌的老化死亡時間最晚。從這里看，色素產生提前是菌株進入老化階段的一個指標，但產生時間的早晚不能直接決定哪個菌株先老化，它們之間不存在正相關關系。相較于錢可晴等[2]報道的15代即老化死亡，本研究中的10個試驗菌株均能在30代前保持較快的生長速度，作為優良菌種，都是有潛力的。考量菌種質量好壞的最主要指標是老化時間和菌絲長勢，綜合所有試驗數據，確定“七妹”羊肚菌品種當中72M11和73M1為最佳菌株。下一步將對繼代培養的所有菌株進行出菇試驗，并結合生產試驗，進一步驗證最適合推廣的優良菌種。