小麥條銹菌效應蛋白Hasp83在條銹菌致病性中的功能分析

王建鋒，成嘉欣，舒偉學，張艷茹，王曉杰，康振生，湯春蕾

小麥條銹菌效應蛋白Hasp83在條銹菌致病性中的功能分析

王建鋒，成嘉欣，舒偉學，張艷茹，王曉杰，康振生，湯春蕾

西北農林科技大學植物保護學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100

【背景】條銹病是小麥上的重大病害，由條形柄銹菌小麥專化型（f. sp.，）侵染引起。條銹菌是活體營養型寄生真菌，在侵染過程中形成吸器，通過吸器從寄主植物汲取營養。同時，吸器分泌效應蛋白調控寄主免疫，促進侵染過程。【目的】明確條銹菌效應蛋白的功能及其作用機理，為揭示條銹菌的致病機制打下基礎。【方法】比較分析條銹菌夏孢子、芽管和吸器轉錄組，獲得在吸器誘導表達的分泌蛋白基因，在本氏煙葉片細胞中瞬時表達觀察是否能抑制由BAX引起的細胞壞死；利用qRT-PCR分析該基因在條銹菌侵染小麥不同階段的表達水平。借助熒光假單胞菌Ⅲ型分泌系統和寄主誘導的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）分析在條銹菌侵染過程中的功能。利用酵母雙雜交系統篩選小麥中與Hasp83互作的蛋白，免疫共沉淀技術進一步在煙草細胞中共表達驗證Hasp83及其候選靶標蛋白的互作。【結果】開放閱讀框全長522 bp，編碼173個氨基酸，蛋白N端1—29位氨基酸為信號肽，無保守結構域，在本氏煙葉片細胞中瞬時表達能抑制由BAX引起的細胞壞死。qRT-PCR分析顯示，在條銹菌侵染時期上調表達；利用細菌Ⅲ型分泌系統在小麥水源11品種中瞬時表達Hasp83能夠抑制熒光假單胞菌引起的胼胝質積累，在接種條銹菌無毒性小種CYR23后，瞬時表達Hasp83株系產生的活性氧積累面積和過敏性壞死面積相比對照減少19.35%—38.62%；利用HIGS技術在接種條銹菌毒性小種CYR31的小麥水源11中沉默，發現條銹菌的產孢量、菌絲長度、菌絲擴展面積和吸器數目減少，致病力降低。酵母雙雜交結果表明，效應蛋白Hasp83與其小麥中候選靶標過敏性壞死誘導蛋白Tahir1互作。免疫共沉淀進一步證明Hasp83及其候選靶標Tahir1存在互作。【結論】條銹菌效應蛋白Hasp83可抑制寄主由非致病細菌和無毒性條銹菌生理小種引起的小麥防衛反應，增強病原菌的致病力。

小麥條銹病；吸器；效應蛋白；轉錄組分析；靶標蛋白鑒定

0 引言

【研究意義】由條形柄銹菌小麥專化型（f. sp.，）引起的小麥條銹病嚴重危害我國小麥的安全生產，病害嚴重流行年份可導致小麥減產10%—30%，甚至絕收[1]。小麥條銹病在全球小麥種植區均有發生，我國是發生面積最大、造成經濟損失最重的國家[2-4]。種植抗病小麥品種是防控小麥條銹病的主要策略[5]。然而由于小麥條銹菌的毒性變異頻繁，高溫適應性增強，病原菌新小種不斷產生[6]，導致絕大多數生產品種抗銹性喪失，致使小麥條銹病在我國連年流行成災[7]。目前，對小麥條銹菌侵染致病的機理認識不夠，缺乏有效的防控措施。因此，挖掘病菌關鍵的致病因子，解析其調控寄主促進病菌致病的作用機理，開發病害防控新策略，對持續有效防控小麥條銹病具有重要意義。【前人研究進展】植物在與病原菌的長期進化過程中，形成了復雜的免疫系統，包括細胞膜上的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別病原菌相關分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）激發的PTI（PAMP-triggered immunity），及植物抗病蛋白（resistance protein，R）識別病菌無毒基因編碼產物（avirulence protein，Avr）激發的ETI（effector-triggered immunity）[8-9]。為克服植物的免疫反應，病原菌分泌效應蛋白抑制寄主的PTI和ETI，促進侵染與定殖[10]。小麥條銹菌為活體營養型寄生真菌，在侵染小麥的過程中，會產生吸器這一高度分化的侵染結構，從寄主細胞源源不斷地汲取營養物質維持自身生長發育與繁殖[11]。另外，條銹菌通過吸器向寄主細胞中分泌大量的效應蛋白（effector），調控寄主的免疫反應，促進條銹菌的侵染與定殖[12-14]。通過小麥條銹菌全基因組測序與吸器轉錄組測序，分析獲得了大量候選效應蛋白[15-16]。目前已鑒定到一些條銹菌效應蛋白，發現它們靶定寄主細胞不同區室，通過多元化策略調控寄主免疫。Pst_13661編碼多糖去乙酰化酶，分泌到植物細胞間質，對病菌細胞壁的幾丁質脫乙酰化，避免寄主幾丁質酶識別，降低寄主對幾丁質應答產生的免疫反應，從而幫助病菌致病[17]。Pst_12806定位到寄主植物葉綠體，抑制細胞色素b6/f復合體鐵硫亞基TaISP的功能，削弱葉綠體介導的防衛反應，促進病菌定殖[18]。細胞質效應蛋白Pst_4/5則通過劫持并阻止光合電子傳遞鏈關鍵蛋白TaISP進入葉綠體，干擾葉綠體免疫[19]。Pst_A23位于植物細胞核斑點，結合小麥pre-mRNA調控寄主可變剪接抑制免疫[20]。胞質效應蛋白Hasp98通過抑制寄主免疫途徑關鍵組分TaMAPK4的激酶活性，調控寄主免疫[21]。PsSpg1與Pst27791分別通過靶向小麥感病基因增強其激酶活性，磷酸化下游轉錄因子，進而改變其轉錄調控活性，抑制防御相關基因表達，促進小麥感病[22-23]。在解析條銹菌效應蛋白作用機理的基礎上，利用RNAi技術操縱效應蛋白基因表達，過表達或編輯其小麥靶標基因，創制了小麥抗病新材料，顯著提高了小麥抗銹性。【本研究切入點】效應蛋白具有抑制植物免疫系統的功能，但條銹菌大部分效應蛋白的基本功能以及分子機制依然不清楚，因此解析效應蛋白調控植物免疫分子機制，可為進一步了解條銹菌的致病機制并開發防控新途徑提供依據。【擬解決的關鍵問題】明確候選效應蛋白Hasp83調控條銹菌的毒性功能，篩選鑒定其在寄主小麥的互作蛋白，為揭示效應蛋白Hasp83的致病機理及深入研究條銹菌-小麥互作機制打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2016—2020年在西北農林科技大學植物保護學院植物免疫實驗室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與植物材料 大腸桿菌菌株DH5和JM109、酵母菌菌株AH109由本實驗室提供；熒光假單胞菌菌株Ethan，由美國華盛頓州立大學Scot Hulbert教授饋贈；農桿菌菌株GV3101（含P19），購自上海唯地生物技術有限公司；馬鈴薯X病毒（PVX）病毒載體pGR106，用于農桿菌侵染本氏煙，由南京農業大學竇道龍教授饋贈；pEDV6載體，用于細菌Ⅲ型分泌系統（type Ⅲ secretion system，T3SS）在小麥中瞬時表達，由美國華盛頓州立大學Scot Hulbert教授饋贈；大麥條紋花葉病毒（BSMV）、、鏈的載體，用于寄主誘導的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）試驗，由本實驗室保存；pGBKT7載體和pGADT7載體，用于酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2H）篩選系統，由本實驗室提供；pBinGFP2和pICH86988載體，用于免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）試驗中效應蛋白和候選靶標在煙草中表達，由南京農業大學王源超教授饋贈。

小麥品種水源11（攜帶抗病基因）和銘賢169（不攜帶任何抗病基因）由本實驗室保存。將水源11和銘賢169的種子均勻播種在直徑9 cm塑料花盆中，16℃光照16 h，13℃黑暗8 h培養，相對濕度70%，待幼苗第二葉片展開備用。水源11用于小麥條銹菌小種CYR31的繁殖、表達譜分析、T3SS效應蛋白的瞬時表達和HIGS試驗，銘賢169用于小麥條銹菌小種CYR23的繁殖。

供試煙草為本氏煙（），由本實驗室保存。將培育好的煙草幼苗移栽至直徑9 cm塑料花盆中，25℃光照16 h，黑暗8 h培養，相對濕度75%，待其培養至4葉期備用。

供試小麥條銹菌生理小種CYR23和CYR31在本實驗室低溫窯洞進行繁殖。其中，水源11接種生理小種CYR31表現為完全產孢的感病反應，接種CYR23誘發過敏性壞死的抗病反應；生理小種CYR23和CYR31在銘賢169上均完全產孢。

1.1.2 試劑和引物 T4 DNA連接酶、T-simple vector（Takara，北京寶日醫生物技術有限公司）；各種限制性內切酶、Taq Polymorase、Pfu DNA Polymerase、RevertAid Master Mix with DNase I（Thermo Fisher，賽默飛世爾科技有限公司）；2×Taq MasterMix（含染料）、DL2000 Marker（康為世紀公司）；質粒小提試劑盒（Omega，北京諾博萊德科技有限公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（BioTeke，北京百泰克生物技術有限公司）；快速通用RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）；RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7試劑盒（Promega公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（OXOID，北京拜爾迪生物技術有限公司）；Amp、Kana、利福平等抗生素、DMSO、葡萄糖（MP，北京伊諾凱科技有限公司）；真菌DNA提取試劑盒（BIOMIGA公司）；DAB、WGA、苯胺藍、蛋白胨、YNB（BD公司）；酵母生長所需各種氨基酸（Clontech公司）；PEG3350（Spectrum，上海斯百全化學有限公司）；LiAc（Sigma，默克科技公司）；NP-40裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；GFP-Trap瓊脂糖凝膠珠（Chromo Tek公司）。引物和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本研究所用引物及其序列見表1。

1.2 Hasp83生物信息學分析

運用SignalP 5.0在線軟件（https://services.healthtech. dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）預測Hasp83的信號肽；利用SMART在線軟件（http://smart.embl-heidelberg. de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1）分析Hasp83保守結構域；利用Ensembl Fungi（http://www.fungi.ensembl. org/）網站查找Hasp83的特異沉默片段。

1.3 Hasp83的獲取與重組載體構建

在小麥條銹菌吸器轉錄組中獲得的ORF序列[16]。利用Primer Premier 5設計特異引物，以CYR31侵染水源11小麥葉片的cDNA為模板擴增得到目的基因。采用一步克隆法將擴增得到的去信號肽基因序列連接到Ⅰ和Ⅰ酶切的pGR106載體，獲得重組載體pGR106-Hasp83Δsp。

表1 本研究所用引物序列

擴增編碼去信號肽基因序列，利用BP酶（Gateway? BP Clonase?，Invitrogen）構建到含有attP位點的pDONRTM221中間載體，陽性質粒pDONRTM221- Hasp83Δsp通過LR酶（GatewayTMLR ClonaseTM，Invitrogen）反應獲得重組載體pEDV6-Hasp83Δsp。

設計的特異沉默片段和，用特異引物擴增沉默片段，利用T4 DNA連接酶連接到Ⅰ和Ⅰ酶切的BSMV::（BSMV::00）載體，獲得BSMV::和BSMV::重組載體。

擴增編碼去信號肽基因序列，連接到RⅠ和HⅠ酶切的pGBKT7載體，獲得重組載體pGBKT7-Hasp83Δsp。將去信號肽基因序列構建到Ⅰ和HⅠ雙酶切的pBinGFP2載體，獲得重組載體pBinGFP2-Hasp83Δsp；此外，采用擴增含HA標簽的候選靶標基因序列，利用一步克隆法連接到Ⅰ單酶切的pICH86988載體，構建重組載體pICH86988-Tahir1-HA。

1.4 接種與qRT-PCR檢測分析

小麥水源11和銘賢169生長至一葉一心期時，脫去葉片表面蠟質，將條銹菌CYR31和CYR23夏孢子分別用ddH2O稀釋制成孢子懸液，毛筆蘸取孢子懸液均勻接種于葉片正面，水源11接種條銹菌小種CYR31，銘賢169接種條銹菌小種CYR23，黑暗保濕24 h后轉移至16℃溫室進行培養，14 d后即可收集新鮮夏孢子。

采集小麥條銹菌夏孢子、萌發芽管和接種條銹菌CYR31后24、48、72、120和168 h的小麥水源11葉片，用華越洋公司快速通用RNA提取試劑盒提取RNA，使用RevertAid Master Mix with DNase I試劑盒反轉錄合成cDNA。采用Primer Premier 5設計效應蛋白基因特異引物，利用qRT-PCR技術分析其在小麥侵染不同階段的表達情況。以小麥條銹菌為內參，采用2-??Ct法[24]計算基因的相對表達量，進行3次生物學重復。

1.5 農桿菌侵染本氏煙瞬時表達Hasp83

將構建好的重組質粒pGR106-Hasp83Δsp通過電擊轉化法轉入GV3101感受態細胞，挑取陽性菌落在含有卡那霉素（50 μg·mL-1）和利福平（50 μg·mL-1）的LB培養基中28℃培養36 h。5 000 r/min離心10 min，收集菌體，10 mmol·L-1MgCl2清洗兩次，乙酰丁香酮（As）緩沖液（1 mL 1 mol·L-1KOH-MES、100 μL 150 mmol·L-1As、1 mL 1 mol·L-1MgCl2定容至100 mL）懸浮菌體，稀釋至OD600=0.3，黑暗靜置2 h后注射煙草葉片背面。24 h后，在同一位置注射攜帶pGR106-Bax的農桿菌菌液，4 d后觀察表型并拍照。本試驗陽性和陰性對照分別為含重組載體pGR106-Avr1b和pGR106-eGFP的農桿菌菌液，進行3次生物學重復。

1.6 細菌Ⅲ型分泌系統在小麥水源11上瞬時表達Hasp83

將構建好的pEDV6-Hasp83Δsp載體通過電擊轉化法導入熒光假單胞菌EtHan感受態細胞中，挑取陽性菌落在含有氯霉素（30 μg·mL-1）和慶大霉素（25 μg·mL-1）的LB培養基中28℃培養48 h。4 500 r/min離心1 min收集菌體，用10 mmol·L-1MgCl2清洗3次后重懸菌體至OD600=1.0，注射二葉期小麥水源11第2葉，24 h后采集注射葉段，經冰醋酸﹕無水乙醇=1﹕1脫色、水合氯醛固定后，用0.05%苯胺藍染液過夜避光處理。染色樣本于熒光顯微鏡UV Light通道下觀察胼胝質，每個樣品隨機選取50個1 mm2的視野統計胼胝質數量，進行3次生物學重復。以攜帶有pEDV6-dsReD的EtHan懸浮液注射葉片為陰性對照，細菌無毒效應基因在小麥葉片瞬時表達激發免疫反應，監測試驗系統是否成功。含有pEDV6-Hasp83Δsp的EtHan菌液注射小麥葉片24 h后，接種條銹菌無毒生理小種CYR23，采集接菌后24和48 h的樣品，分別進行3, 3’-二氨基聯苯（3, 3’-diaminobenzidine，DAB）和小麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色，接菌后120 h采集葉片，用于生物量檢測。

DAB染色：采集對應時間點葉片，在200 μL DAB（1 mg·mL-1）中光照反應3—4 h，葉片剪成2 cm葉段經過（冰醋酸﹕無水乙醇=1﹕1）脫色、水合氯醛過夜固定，于熒光顯微鏡下統計活性氧面積及過敏性壞死面積（激發波長488 nm）。每次統計30個侵染點，進行3次生物學重復。

WGA染色：將經過脫色固定后的葉片放置于含1.5 mL 1 mol·L-1KOH溶液的2 mL離心管中，高壓滅菌121℃，5 min，棄去離心管中的KOH溶液，50 mmol·L-1Tris-HCl浸泡30 min，重復浸泡2次后，用0.1% WGA熒光染液避光處理30 min。染色葉片在熒光顯微鏡（激發波長488 nm）下觀察統計菌落面積、菌絲長度、吸器數目。

生物量檢測：利用真菌DNA提取試劑盒提取接菌的小麥總DNA，將DNA樣品分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7，以小麥和條銹菌為內參基因制作雙標準曲線。通過雙標準曲線計算瞬時表達樣品中條銹菌的相對生物量，進行3次生物學重復。

1.7 寄主誘導的基因沉默

利用Ⅰ內切酶線性化BSMV和空載體，Ⅰ內切酶線性化載體，重組載體BSMV::及BSMV::重組載體用HⅡ內切酶線性化。采用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7（Promega）將線性化DNA片段進行體外轉錄。參照Holzberg等[25]的方法，將BSMV::（、、:Hasp83）的體外轉錄產物按1﹕1﹕1比例混合（各10 μL），加入200—300 μL FES緩沖液（2.613 g磷酸氫二鉀、1.877 g甘氨酸、0.5 g焦磷酸鈉、0.5 g硅藻土、0.5 g斑脫土，定容至50 mL，高壓滅菌20 min）中，充分混勻，摩擦接種小麥第2葉。BSMV::為陰性對照，BSMV::用于監測BSMV系統。接種病毒后25℃培養10 d，待出現病毒癥狀，于第4葉接種條銹菌CYR31，分別于接菌后24、48和120 h采集接菌葉片進行DAB與WGA染色，同時提取樣品RNA，觀察統計活性氧過敏性壞死面積，菌絲生長發育情況，分析沉默效率。

1.8 酵母雙雜交篩選候選靶標

將重組誘餌質粒pGBKT7-Hasp83Δsp利用PEG/ LiAC法轉化至酵母AH109中，篩選條銹菌侵染的小麥cDNA文庫，挑取在三缺培養基（SD-Trp-Leu-His）上生長的酵母單菌落，無菌水稀釋后在四缺培養基（SD-Trp-Leu-His-Ade）劃線，30℃培養，5 d后挑取單菌落轉移到含有X--gal的四缺培養基培養。利用AD-F和AD-R引物擴增四缺培養基上顯藍的菌落，產物送至公司進行測序。測序結果在NCBI 數據庫中BlastX比對，獲得候選基因序列。

酵母雙雜交驗證效應蛋白和候選靶標互作：利用Primer Premier 5設計候選基因引物，以CYR31侵染小麥葉片的cDNA為模板進行擴增，將其產物構建至pGADT7載體。將含候選基因的重組載體與pGBKT7-Hasp83Δsp質粒共轉入酵母AH109菌株中，分別涂布于二缺培養基（SD-Trp-Leu）和三缺培養基（SD-Trp-Leu-His），30℃培養3 d。挑取SD-Trp-Leu上的陽性單菌落，以106、105、104、103梯度稀釋，在SD-Trp-Leu、SD-Trp-Leu-His和四缺培養基（SD-Trp-Leu-His-Ade）點斑，培養基倒置放于30℃培養3 d。

1.9 免疫共沉淀驗證效應蛋白和候選靶標互作

將重組質粒pBinGFP2-Hasp83Δsp和pICH86988- Tahir1-HA轉入GV3101感受態細胞，選取陽性菌落在含有卡那霉素（50 μg·mL-1）和利福平（50 μg·mL-1）的LB培養基中28℃培養36 h。農桿菌菌液的處理見1.5。將含有pBinGFP2-Hasp83Δsp和pICH86988-Tahir1的農桿菌菌液（各組分OD600終濃度均為0.5）注射煙草，25℃培養48 h后采樣。采集葉片于研缽中液氮速凍并充分研磨，研磨好的粉末置于2 mL離心管中加入預冷的NP-40裂解液進行渦旋，12 000 r/min 4℃離心10 min。將上清轉移至含50 μL預處理GFP-Trap瓊脂糖凝膠珠的離心管中，4℃孵育2 h。1 000 r/min離心1 min，棄上清。用NP-40 裂解液洗滌凝珠3次，向離心管中加入1×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min。煮沸樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，利用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上，隨后將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液內室溫封閉1 h，在含anti-GFP抗體的TBST緩沖液（抗體比例1﹕1 000）中4℃過夜孵育；TBST緩沖液清洗3次后，置于含辣根過氧化物酶交聯二抗的TBST緩沖液中室溫孵育1 h。TBST緩沖液清洗3次后，在化學發光成像儀下進行曝光。

2 結果

2.1 Hasp83在條銹菌侵染小麥中上調表達

比較分析小麥條銹菌生理小種CYR31的夏孢子、芽管與吸器轉錄組，發現在吸器階段顯著上調表達（圖1）。（GenBank：KI516380.1）全長522 bp，編碼173個氨基酸，SignalP 5.0預測N端1—29位氨基酸為信號肽，SMART預測沒有明顯的結構域。qRT-PCR分析結果顯示，在條銹菌夏孢子、芽管表達量較低，在條銹菌侵染的小麥葉片中誘導表達，24、72、和168 h表達量顯著升高，72 h達到峰值，表達量為在夏孢子中的308倍，隨后下降（圖2）。

H：吸器haustorium；GT：芽管germinated tube；U：夏孢子urediospore

U：夏孢子urediospore；GT：芽管germinated tube。 **：P＜0.01

2.2 Hasp83抑制Bax誘導的細胞壞死

Bax是一種小鼠促細胞凋亡蛋白，其在本氏煙中表達誘導產生細胞壞死，與病原菌誘導產生的過敏性壞死反應具有相似的生理特性[26]。因此，能否抑制由Bax引起的細胞壞死成為初步篩選和檢驗效應蛋白毒性功能的有效方法[27-28]。通過農桿菌侵染在本氏煙中瞬時表達Hasp83Δsp，24 h后注射含Bax的農桿菌菌液，觀察本氏煙葉片的壞死情況。結果表明，單獨注射含pGR106-eGFP的農桿菌菌液不能引起本氏煙細胞壞死，24 h后在原位置注射含Bax的農桿菌菌液細胞壞死明顯；單獨注射含重組質粒pGR106- Hasp83Δsp的農桿菌菌液沒有出現壞死反應，原位點注射含Bax的農桿菌菌液后也未觀察到明顯壞死現象出現，與對照Avr1b表型一致（圖3）。Hasp83能抑制由Bax引發的細胞壞死。

2.3 Hasp83抑制小麥的基礎免疫反應

含熒光假單胞菌EtHan注射小麥葉片能夠引起胼胝質積累[29-30]，為明確Hasp83抑制小麥的基礎免疫作用，利用熒光假單胞菌EtHan的Ⅲ型分泌系統在小麥葉片瞬時表達Hasp83Δsp，檢測胼胝質。注射攜帶有pEDV6-dsRed的熒光假單胞菌能激發小麥產生胼胝質，表達陽性對照AvrRpt2誘導胼胝質積累顯著增多，瞬時表達Hasp83的小麥葉片中胼胝質數目較對照葉片dsRed相比顯著減少（圖4-A），進一步統計分析顯示，瞬時表達Hasp83的小麥葉片中胼胝質數目較pEDV6-dsRed表達葉片相比降低44.53%（圖4-B），說明Hasp83可以抑制由熒光假單胞菌EtHan激發的小麥基礎免疫反應。

A：攜帶有pGR106-Hasp83Δsp、pGR106-eGFP或 pGR106-Avr1b的農桿菌侵染煙草葉片，24 h后注射含有pGR106-Bax的農桿菌，5 d后觀察表型N. benthamiana leaves were infiltrated with A. tumefaciens containing pGR106-Hasp83Δsp, pGR106-eGFP, or pGR106-Avr1b, either alone or with A. tumefaciens cells carrying pGR106-Bax, which were infiltrated 24 h later. At 5 d post infiltration, the phenotypes were observed and photographed。B：農桿菌侵染煙草葉片示意圖Schematic diagram of A. tumefaciens infiltrating N. benthamiana leaves

2.4 Hasp83抑制小麥抗條銹病反應并促進病原菌生長

為進一步明確Hasp83能否抑制寄主小麥對條銹菌的抗性，在瞬時表達Hasp83的小麥葉片上接種條銹菌無毒小種CYR23，觀察統計接菌后24和48 h的活性氧與細胞壞死。結果顯示，與瞬時表達dsRed的葉片相比，表達Hasp83的小麥葉片中活性氧積累和細胞壞死面積在24和48 h均有不同程度減小（圖5-A），活性氧積累面積在24和48 h分別下降34.47%和38.62%（圖5-B），細胞壞死面積在24和48 h分別減少19.35%和25.58%（圖5-C），表明Hasp83能抑制由無毒條銹菌生理小種引起的小麥抗病反應。

A：苯胺藍染色觀察瞬時表達Hasp83小麥葉片中胼胝質Observation of callose deposition stained by aniline blue in wheat leaves transiently expressing Hasp83。dsRed：陰性對照negative control；AvrRpt2能誘導胼胝質產生bacterial AvrRpt2 could induce callose production in wheat。標尺Scale=200 μm。

利用WGA染色條銹菌侵染結構，觀察并統計菌絲長度和菌落擴展面積。結果顯示，與對照葉片相比，表達Hasp83的小麥葉片接種條銹菌24和48 h后，條銹菌菌絲長度增長，菌落面積增大（圖6-A、6-B），瞬時表達Hasp83的小麥葉片接種條銹菌120 h后，條銹菌生物量顯著增加（圖6-C）。以上結果說明瞬時表達Hasp83抑制小麥免疫，促進條銹菌生長發育。

2.5 HIGS沉默Hasp83減弱條銹菌致病力

為進一步解析Hasp83在條銹菌致病性中的功能，設計的兩個特異片段，分別命名為和。其中，片段長為107 bp，片段為244 bp（圖7-A）。利用HIGS在小麥水源11與條銹菌CYR31親和互作體系中沉默，接種條銹菌14 d觀察侵染表型。沉默植株（BSMV::和BSMV::）中，條銹菌夏孢子堆數目與對照葉片BSMV::相比明顯減少（圖7-B）。qRT-PCR檢測沉默效率，結果顯示，在24 hpi的沉默葉片中表達量較對照BSMV::分別下降50%和44%，在48 hpi分別下降55%和39%，在120 hpi后分別下降60%和66%（圖7-C）。組織學觀察顯示，與BSMV::對照相比，在24和48 hpi沉默葉片中條銹菌的菌絲長度變短，侵染面積變小，形成的吸器數目變少；120 hpi菌落侵染面積也顯著減小（圖7-E、7-F、7-G）。以上結果說明，瞬時沉默降低條銹菌毒力，抑制了條銹菌生長發育。

A：組織學觀察瞬時表達Hasp83小麥葉片接種條銹菌無毒生理小種CYR23 24和48 h的活性氧（ROS）積累及過敏性壞死反應（HR），標尺Scale =20 μm Histological observation of ROS accumulation and hypersensitive response (HR) in wheat leaves transiently expressing Hasp83 at 24 and 48 h post inoculation (hpi) of avirulent Pst CYR23。SV：氣孔下囊Sub-stomatal vesicle；IH：侵染菌絲Infection hyphae。B、C：條銹菌侵染小麥24和48 h ROS積累及細胞過敏性壞死反應面積統計。3次生物學重復，每次統計30個侵染點。*：P＜0.05 Statistical analysis of ROS accumulation and HR per infection site at 24 and 48 hpi. The experiments were repeated for three biological replications with 30 infection sites for each replication

A、B：瞬時表達Hasp83小麥葉片中，條銹菌侵染24和48 h后菌絲長度及侵染面積統計。3次生物學重復，每次統計30個侵染點。*：P＜0.05 Statistical analysis of Pst hyphal length and infection area per infection site at 24 and 48 hpi. The experiments were repeated for three biological replications with 30 infection sites for each replication。C：條銹菌侵染小麥120 h的相對生物量，**：P＜0.01 Relative fungal biomass of Pst at 120 hpi in wheat leaves expressing Hasp83 calculated by qPCR

2.6 Hasp83與小麥Tahir1互作

以Hasp83作為誘餌蛋白，在條銹菌與小麥親和互作的酵母雙雜交cDNA文庫篩選其互作蛋白。經過兩次重復，共獲得52個候選互作蛋白。對其中在兩次篩選結果中均出現的4個蛋白進行驗證，發現其中過敏性壞死誘導蛋白（hypersensitive induced reaction protein 1，Tahir1）在兩次篩選結果中均有出現。（GenBank：AFD54041.1）全長840 bp，編碼279個氨基酸。為了驗證二者是否存在互作關系，以CYR31侵染小麥葉片的cDNA為模板擴增，測序正確后構建至pGADT7載體進行酵母雙雜交互作驗證。結果顯示，共表達pGBKT7-Hasp83Δsp和pGADT7-Tahir1的酵母在四缺培養基（SD-Trp-Leu-His-Ade）上生長（圖8），表明Hasp83與Tahir1在酵母中存在互作。進一步利用Co-IP驗證Hasp83與Tahir1的互作。在煙草中將Tahir1-HA分別與Hasp83-GFP和GFP（陰性對照）共表達，提取煙草葉片總蛋白進行Western blot檢測，結果顯示，煙草總蛋白中均能檢測到Hasp83-GFP，GFP與Tahir1-HA，表明蛋白均表達成功；利用GFP-Trap富集總蛋白，沉淀產物中可以同時檢測到Hasp83-GFP及Tahir1-HA，而陰性對照GFP中則不能檢測到Tahir1-HA（圖9），表明Hasp83與Tahir1在植物體內存在互作關系。

A：Hasp83特異沉默片段示意圖Schematic diagram of the specific silencing fragment of Hasp83。B：利用HIGS技術沉默Hasp83，接種條銹菌CYR31，14 d后觀察表型Disease phenotypes of Hasp83-silencing wheat plants inoculated with Pst CYR31 observed at 14 d post inoculation。C：qRT-PCR分析24、48和120 hpi Hasp83的沉默效率Silencing efficiency of Hasp83 at 24, 48 and 120 hpi assessed using qRT-PCR。BSMV::γ：陰性對照negative control。D：組織學觀察Hasp83沉默葉片接種CYR31 24和48 h的條銹菌生長發育（標尺Scale=20 μm）Histological observation of fungal growth in Hasp83-silencing wheat plants infected with CYR31。SV：氣孔下囊Sub-stomatal vesicle；IH：侵染菌絲Infection hyphae；HMC：吸器母細胞Haustorial mother cell。E—G：Hasp83沉默葉片中，接種條銹菌24、48和120 h后吸器數量、菌絲長度及侵染面積統計。3次生物學重復，每次重復統計30個侵染點。*：P＜0.05，**：P＜0.01 Statistical analysis of Pst haustorium number, hyphal length and infection area per infection site in Hasp83-silencing plants. The experiments were repeated for three biological replications, with 30 infection sites for each replication

圖8 酵母雙雜交驗證Hasp83與候選小麥蛋白Tahir1互作

圖9 免疫共沉淀胞外驗證Hasp83與靶標蛋白Tahir1的互作

3 討論

3.1 小麥條銹菌效應蛋白的研究方法

條銹菌侵染小麥時通過吸器向寄主分泌效應蛋白調控植物的免疫與代謝，促進寄主植物感病[11]。鑒定小麥條銹菌的關鍵效應蛋白，對揭示其致病機理具有重要意義。近年來，通過生物信息學分析從小麥條銹菌全基因組與吸器轉錄組中獲得大量分泌蛋白基因[15-16]，為鑒定小麥條銹菌效應蛋白提供了豐富的基因資源。然而，小麥條銹菌為活體營養寄生真菌，缺乏穩定的遺傳轉化體系，極大限制了效應蛋白基因的功能研究。寄主誘導的基因沉默（HIGS）技術通過在寄主細胞內表達靶向病原菌效應蛋白基因的干擾片段，在小麥條銹菌侵染過程中通過吸器跨界轉運到病原菌，從而特異沉默病原菌靶標基因[31-33]。利用細菌Ⅲ型分泌系統（T3SS）可將病原菌效應蛋白直接轉入寄主細胞，為在小麥中瞬時表達條銹菌基因提供了技術支持[29]。這些技術的發展，為解析活體營養專性寄生真菌的基因功能奠定了基礎，并促進了小麥條銹菌效應蛋白的鑒定與功能研究。

通過HIGS瞬時沉默及T3SS介導的瞬時表達技術，鑒定到一批顯著影響條銹菌致病力的效應蛋白，如Hasp68、Hasp2和Hasp98[21,34-35]。研究表明這些效應蛋白基因沉默后均顯著降低條銹菌致病力，瞬時表達抑制小麥的PTI和ETI。本研究鑒定并克隆了一個在吸器階段誘導表達的條銹菌效應蛋白基因，小麥上瞬時表達效應蛋白能夠抑制小麥PTI相關胼胝質積累及無毒條銹菌生理小種誘導的免疫反應，促進條銹菌生長發育，瞬時沉默則顯著降低條銹菌致病力，表明Hasp83為影響條銹菌致病力的關鍵效應蛋白。不同于Hasp8[36]在條銹菌侵染前期誘導表達，在條銹菌侵染小麥早期及后期均誘導表達，特別在72 h達到表達高峰，表明在條銹菌侵染早期與寄主建立寄生關系及后期在小麥葉肉細胞間的擴展中均發揮功能。

3.2 小麥條銹菌效應蛋白調控寄主免疫的作用機制

小麥條銹菌效應蛋白能夠通過多種作用途徑調控寄主的免疫反應。Pst_12806、Pst_4和Pst_5通過干擾葉綠體光合作用抑制葉綠體介導免疫，促進致病[18-19]。富含甘氨酸和絲氨酸效應蛋白PstGSRE1及細胞核效應蛋白Pst_A23分別通過干擾轉錄因子TaLOL2入核或寄主pre-mRNA可變剪接，在轉錄水平和轉錄后水平調節寄主基因轉錄，促進病菌侵染[20,37]。Pst18363和Pst27791增強免疫負調控因子Nudix水解酶23（TaNUDX23）及TaRaf46蛋白穩定[23,38]，PsSpg1則通過提高感病基因激酶活性抑制寄主抗病性[22]。這類效應蛋白操縱寄主感病基因介導小麥感病性，另外一類效應蛋白則通過抑制免疫正調控因子的活性，抑制寄主免疫。Hasp98和 PstGSRE4分別抑制寄主免疫正調控激酶TaMAPK4的活性，銅鋅超氧化物歧化酶TaCZSOD2活性，導致寄主活性氧積累減少，介導條銹菌致病力[21,39]。本研究中，Hasp83與小麥過敏性壞死（HR）誘導蛋白Tahir1互作。在玉米與大麥中，的表達與寄主植物局部細胞壞死及抗病反應相關[40-41]。Athir1和Athir2能夠與NB-LRR類抗病蛋白RPS2形成復合體激活植物的ETI，在擬南芥中過表達和顯著減弱丁香假單胞菌DC3000生長與侵染[42]。水稻Oshir1蛋白定位在細胞質膜上，與LRR類抗性蛋白Oslrr1互作，促進植物的過敏性壞死，以阻止丁香假單胞菌DC3000的進一步侵染與擴展[43]。研究表明Hir蛋白通常與R蛋白互作，介導植物抗病HR。鑒于過敏性壞死誘導蛋白在植物抗病HR的重要作用[40-41]，推測效應蛋白Hasp83通過與Tahir1互作，影響Tahir1功能抑制HR反應，可能通過干擾Tahir1與R蛋白的互作，影響Tahir1穩定或活性等作用機制。后續對Tahir1在小麥抗條銹病及HR反應中的功能，及Hasp83調控Tahir1抑制小麥HR，降低抗病性的作用機制需進一步研究。在深入揭示作用機理的基礎上，有望通過沉默創制RNAi小麥，精準編輯Tahir1與Hasp83互作位點打破二者互作，創制抗病小麥材料。

4 結論

Hasp83可作為小麥條銹菌的重要效應蛋白，具有抑制寄主免疫增強病原菌致病力的毒性功能，效應蛋白Hasp83與小麥過敏性壞死誘導蛋白Tahir1互作。

[1] 陳萬權, 徐世昌, 吳立人. 中國小麥條銹病流行體系與持續治理研究回顧與展望. 中國農業科學, 2007, 40(增刊1): 177-183.

Chen W Q, Xu S C, Wu L R. Epidemiology and sustainable management of wheat stripe rust caused byWest. in China: A historical retrospect and prospect.Scientia Agricultura Sinica, 2007, 40 (Suppl. 1): 177-183. (in Chinese)

[2] 陳萬權, 康振生, 馬占鴻, 徐世昌, 金社林, 姜玉英. 中國小麥條銹病綜合治理理論與實踐. 中國農業科學, 2013, 46(20): 4254-4262.

CHEN W Q, KANG Z S, MA Z H, Xu S C, Jin S L, JIANG Y Y. Integrated management of wheat stripe rust caused byf. sp.in China. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(20): 4254-4262. (in Chinese)

[3] WAN A M, ZHAO Z H, CHEN X M, HE Z H, JIN S L, JIA Q Z, YAO G, YANG J X, WANG B T, LI G B, BI Y Q, YUAN Z Y. Wheat stripe rust epidemic and virulence off. sp.in China in 2002. Plant Disease, 2004, 88(8): 896-904.

[4] CHEN W Q, WU L R, LIU T G, XU S C, JIN S L, PENG Y L, WANG B T. Race dynamics, diversity, and virulence evolution inf. sp., the causal agent of wheat stripe rust in China from 2003 to 2007. Plant Disease, 2009, 93(11): 1093-1101.

[5] WAN A M, CHEN X M, HE Z H. Wheat stripe rust in China. Australian Journal of Agricultural Research, 2007, 58(6): 605-619.

[6] LINE R F. Stripe rust of wheat and barley in North America: a retrospective historical review. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40: 75-118.

[7] FISHER M C, HENK D A, BRIGGS C J, BROWNSTEIN J S, MADOFF L C, MCCRAW S L, GURR S J. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health. Nature, 2012, 484(7393): 186-194.

[8] JONES J D G, DANGL J L. The plant immune system. Nature, 2006, 444(7117): 323-329.

[9] YU X, FENG B M, HE P, SHAN L B. From chaos to harmony: Responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology, 2017, 55: 109-137.

[10] HE Q, MCLELLAN H, BOEVINK P C, BIRCH P R J. All roads lead to susceptibility: The many modes of action of fungal and oomycete intracellular effectors. Plant Communications, 2020, 1(4): 100050.

[11] STAPLES R C. Nutrients for a rust fungus: the role of haustoria. Trends in Plant Science, 2001, 6(11): 496-498.

[12] GIRALDO M C, VALENT B. Filamentous plant pathogen effectors in action. Nature Reviews. Microbiology, 2013, 11(11): 800-814.

[13] CATANZARITI A M, DODDS P N, ELLIS J G. Avirulence proteins from haustoria-forming pathogens. FEMS Microbiology Letters, 2007, 269(2): 181-188.

[14] GARNICA D P, NEMRI A, UPADHYAYA N M, RATHJEN J P, DODDS P N. The ins and outs of rust haustoria. PLoS pathogens, 2014, 10(9): e1004329.

[15] ZHENG W M, HUANG L L, HUANG J Q, WANG X J, CHEN X M, ZHAO J, GUO J, ZHUANG H, QIU C Z, LIU J,. High genome heterozygosity and endemic genetic recombination in the wheat stripe rust fungus. Nature Communications, 2013, 4: 2673.

[16] XU Q, TANG C L, WANG L K, ZHAO C C, KANG Z S, WANG X J. Haustoria-arsenals during the interaction between wheat andf. sp.. Molecular Plant Pathology, 2020, 21(1): 83-94.

[17] XU Q, WANG J F, ZHAO J R, XU J H, SUN S T, ZHANG H F, WU J J, TANG C L, KANG Z S, WANG X J. A polysaccharide deacetylase fromf. sp.is an important pathogenicity gene that suppresses plant immunity. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(8): 1830-1842.

[18] XU Q, TANG C L, WANG X D, SUN S T, ZHAO J R, KANG Z S, WANG X J. An effector protein of the wheat stripe rust fungus targets chloroplasts and suppresses chloroplast function. Nature Communications, 2019, 10(1): 5571.

[19] WANG X D, ZHAI T, ZHANG X M, TANG C L, ZHUANG R, ZHAO H B, XU Q, CHENG Y L, WANG J F, DUPLESSIS S, KANG Z S, WANG X J. Two stripe rust effectors impair wheat resistance by suppressing import of host Fe-S protein into chloroplasts. Plant Physiology, 2021, 187(4): 2530-2543.

[20] 許強. 小麥條銹菌效應蛋白Pst_A23調控植物pre-mRNA可變剪切抑制植物免疫[D]. 楊凌: 西北農林科技大學, 2020.

XU Q. Pre-mRNA regulation mediated byeffector Pst_A23 suppresses plant immunity[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2020. (in Chinese)

[21] WEI J P, WANG X D, HU Z Y, WANG X J, WANG J L, WANG J F, HUANG X L, KANG Z S, TANG C L. Theeffector Hasp98 facilitates pathogenicity by blocking the kinase activity of wheat TaMAPK4. Journal of integrative plant biology, 2023, 65(1): 249-264.

[22] WANG N, TANG C L, FAN X, HE M Y, GAN P F, ZHANG S, HU Z Y, WANG X D, YAN T, SHU W X,. Inactivation of a wheat protein kinase gene confers broad-spectrum resistance to rust fungi. Cell, 2022, 185(16): 2961-2974.

[23] WAN C P, LIU Y, TIAN S X, GUO J, BAI X X, ZHU H C, KANG Z S, GUO J. A serine-rich effector from the stripe rust pathogen targets a Raf-like kinase to suppress host immunity.Plant Physiology, 2022, 190(1): 762-778.

[24] PFAFFL M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001, 29(9): 2002-2007.

[25] HOLZBERG S, BROSIO P, GROSS C, POGUE G P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. The Plant Journal, 2002, 30(3): 315-327.

[26] LACOMME C, CRUZ S S. Bax-induced cell death in tobacco is similar to the hypersensitive response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(14): 7956-7961.

[27] ABRAMOVITCH R B, KIM Y J, Chen S R, DICKMAN M B, MARTIN G B.type III effector AvrPtoB induces plant disease susceptibility by inhibition of host programmed cell death. The EMBO Journal, 2003, 22(1): 60-69.

[28] JAMIR Y, GUO M, OH H S, PETNICKI-OCWIEJA T, CHEN S R, TANG X Y, DICKMAN M B, COLLMER A, ALFANO J R. Identification oftype III effectors that can suppress programmed cell death in plants and yeast. The Plant Journal, 2004, 37(4): 554-565.

[29] YIN C T, HULBERT S. Prospects for functional analysis of effectors from cereal rust fungi. Euphytica, 2011, 179(1): 57-67.

[30] XIN X F, HE S Y.pv.DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annual Review of Phytopathology, 2013, 51: 473-498.

[31] QI T, GUO J, PENG H, LIU P, KANG Z S, GUO J. Host-induced gene silencing: A powerful strategy to control diseases of wheat and barley. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(1): 206.

[32] KOCH A, WASSENEGGER M. Host-induced gene silencing— mechanisms and applications. New Phytologist, 2021, 231(1): 54-59.

[33] NOWARA D, GAY A, LACOMME C, SHAW J, RIDOUT C, DOUCHKOV D, HENSEL G, KUMLEHN J, SCHWEIZER P. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen. The Plant Cell, 2010, 22(9): 3130-3141.

[34] 於立剛, 齊曉晚, 魏晉萍, 王婷, 王曉杰, 康振生, 湯春蕾. 條形柄銹菌吸器特異效應蛋白Hasp68抑制寄主免疫并與小麥組織蛋白酶B互作. 菌物學報, 2020, 39(10): 1905-1919.

YU L G, QI X W, WEI J P, WANG T, WANG X J, KANG Z S, TANG C L. A haustorium-specific effector protein Hasp68 ofsuppresses wheat immunity by targeting wheat cathepsin B TaCTSB. Mycosystema, 2020, 39(10): 1905-1919. (in Chinese)

[35] 季森, 趙夢鑫, 徐靜華, 湯春蕾, 康振生, 王曉杰. 小麥條銹菌效應蛋白HASP2抑制寄主免疫反應. 植物病理學報, 2019, 49(3): 326-333.

JI S, ZHAO M X, XU J H, TANG C L, KANG Z S, WANG X J. Wheat stripe rust effector HASP2 inhibits host immune response. Acta Phytopathologica Sinica, 2019, 49(3): 326-333. (in Chinese)

[36] 趙聰聰, 盛麗梅, 許強, 湯春蕾, 康振生, 王曉杰. 小麥條銹菌細胞質效應子Hasp8抑制植物基礎免疫. 植物保護學報, 2020, 47(3): 537-545.

ZHAO C C, SHENG L M, XU Q, TANG C L, KANG Z S, WANG X J. Cytoplasmic effector Hasp8 off. sp.inhibits plant immunity. Journal of Plant Protection, 2020, 47(3): 537-545. (in Chinese)

[37] QI T, GUO J, LIU P, HE F X, WAN C P, Islam M A, TYLER B M, KANG Z S, GUO J. Stripe rust effector PstGSRE1 disrupts nuclear localization of ROS-promoting transcription factor TaLOL2 to defeat ROS-induced defense in wheat. Molecular Plant, 2019, 12(12): 1624-1638.

[38] YANG Q, HUAI B Y, LU Y X, CAI K Y, GUO J, ZHU X G, KANG Z S, GUO J. A stripe rust effector Pst18363 targets and stabilises TaNUDX23 that promotes stripe rust disease. New Phytologist, 2020, 225(2): 880-895.

[39] LIU C, WANG Y Q, WANG Y F, DU Y Y, SONG C, SONG P, YANG Q, HE F X, BAI X X, HUANG L L, GUO J, KANG Z S, GUO J. Glycine-serine-rich effector PstGSRE4 inf. sp.inhibits the activity of copper zinc superoxide dismutase to modulate immunity in wheat. PLoS pathogens, 2022, 18(7): e1010702.

[40] NADIMPALLI R, YALPANI N, JOHAL G S, SIMMONS C R. Prohibitins, stomatins, and plant disease response genes compose a protein superfamily that controls cell proliferation, ion channel regulation, and death. The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(38): 29579-29586.

[41] ROSTOKS N, SCHMIERER D, KUDRNA D, KLEINHOFS A. Barley putative hypersensitive induced reaction genes: genetic mapping, sequence analyses and differential expression in disease lesion mimic mutants. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 107(6): 1094-1101.

[42] QI Y P, TSUDA K, NGUYEN L V, WANG X, LIN J S, MURPHY A S, GLAZEBROOK J, Thordal-CHRISTENSEN H, KATAGIRI F. Physical association ofhypersensitive induced reaction proteins (HIRs) with the immune receptor RPS2. The Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(36): 31297-31307.

[43] ZHOU L, CHEUNG M Y, LI M W, FU Y P, SUN Z X, SUN S M, LAM H M. Rice hypersensitive induced reaction protein 1 (OsHIR1) associates with plasma membrane and triggers hypersensitive cell death. BMC Plant Biology, 2010, 10: 290.

Functional Analysis of Effector Hasp83 in the Pathogenicity off. sp.

WANG JianFeng, Cheng JiaXin, Shu WeiXue, Zhang YanRu, WANG XiaoJie, KANG ZhenSheng, TANG ChunLei

College of Plant Protection, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi

【Background】Wheat stripe rust is a serious disease on wheat, which is caused byf. sp.().is an obligate biotrophic fungus, which can form haustorium during infection and absorb nutrients from the host plants via haustorium. Moreover,secretes effectors through haustorium to regulate host immunity and promotes the infection process.【Objective】The objective of this study is to clarify the function and mechanism ofeffectors, and to reveal the pathogenicity mechanism of.【Method】By comparing the transcriptome ofurediospore, germinated tube and haustorium,encoding secreted protein was identified to be significantly induced in haustorium, and whether it could inhibit the cell death caused by BAX onleaves was observed through-mediated transient expression. qRT-PCR was used to detect the expression level ofduring differentinfection stages in wheat. The type Ⅲ secretion system (T3SS) ofEtHan and host induced gene silencing (HIGS) were carried out to investigate the function ofduringinfection. The yeast two-hybrid (Y2H) system was used to screen the proteins interacting with Hasp83 in wheat, and co-inmunoprecipitation (Co-IP) assay was used to further verify the interaction by co-expressing Hasp83 and its candidate target proteins incells.【Result】The open reading frame (ORF) ofis 522 bp, encoding 173 amino acids. Hasp83 contains no conserved domain, and the N-terminal 1-29 amino acids encode a signal peptide, which could inhibit the cell death caused by BAX onleaves through-mediated transient expression. qRT-PCR analysis revealed thatwas up-regulated duringinfection in wheat. Transient expression of, and lead to 19.35%-38.62% decrease of reactive oxygen species (ROS) accumulation area and necrotic cell area caused by the avirulentrace CYR23 in wheat. Silencing ofby HIGS in Suwon11 wheat leaves infected with the virulentrace CYR31 significantly reduced pathogenicity ofcompared to controls, resulting in less urediospore sporulation, shorter infection hyphal length, smaller infection area, and decreased haustorium number. Y2H result showed that the effector Hasp83 interacted with wheat hypersensitive-induced reaction (HIR) protein, Tahir1. The interaction between Hasp83 and Tahir1 was further confirmed by Co-IP assay in.【Conclusion】effector Hasp83 can suppress wheat immunity caused by the non-pathogenic bacteria and avirulent, and enhance the pathogenicity of.

wheat stripe rust; haustorium; effector; transcriptome analysis; identification of target protein

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.005

2022-10-31；

2022-12-19

國家重點研發計劃（2021YFD1401000）、國家小麥產業技術體系（CARS-03）、中央高校基本科研業務費專項（2452020223）

王建鋒，E-mail：ipp@nwsuaf.edu.cn。通信作者湯春蕾，E-mail：tclbad@163.com

（責任編輯 岳梅）