‘倉方早生’桃及其早熟芽變不同發(fā)育時期果實的轉(zhuǎn)錄組分析

彭佳偉，張葉，寇單單，楊麗，劉曉飛，張學(xué)英，陳海江，田義

‘倉方早生’桃及其早熟芽變不同發(fā)育時期果實的轉(zhuǎn)錄組分析

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071000；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所/河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001；3河北省保定市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北保定 071000；4河北省鹽山縣望樹鎮(zhèn)中學(xué)，河北滄州 061300

【目的】通過對桃品種‘倉方早生’及其早熟芽變不同發(fā)育時期的果實進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，挖掘參與調(diào)控桃果實成熟的關(guān)鍵因子，為深入研究桃果實成熟調(diào)控機理提供理論依據(jù)。【方法】以桃品種‘倉方早生’及其早熟芽變?yōu)樵嚥模總€品種分別選擇長勢一致的樣品樹5株，分別于花后30 d（對應(yīng)‘倉方早生’c1、早熟芽變y1）、45 d（對應(yīng)c2、y2）、59 d（對應(yīng)c3、y3）、71 d（對應(yīng)c4、y4）及89 d（對應(yīng)c5）對不同發(fā)育時期的桃去皮果肉進(jìn)行取樣和轉(zhuǎn)錄組測序，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行定量驗證；利用GO和KEGG對‘倉方早生’及其早熟芽變的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析；基于差異表達(dá)基因構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co- expression network analysis，WGCNA），從中鑒定出與果實成熟密切相關(guān)的樞紐模塊和樞紐基因。【結(jié)果】將處于果實相同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，得到y(tǒng)1與c1、y2與c2、y3與c4和y4與c5四組對比數(shù)據(jù)，共篩選出差異表達(dá)基因4 395個，其中上調(diào)表達(dá)基因2 212個，下調(diào)表達(dá)基因2 183個。其中包括10個乙烯、11個脫落酸和18個生長素合成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因，并構(gòu)建了10個IAA蛋白與預(yù)測互作ARF蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。由GO分類統(tǒng)計結(jié)果可知，差異表達(dá)基因在生物過程板塊主要集中于細(xì)胞過程、代謝過程和單體過程；在細(xì)胞組分板塊主要聚集于膜和細(xì)胞組分；在分子功能板塊主要富集于結(jié)合蛋白和催化活性等方面。‘倉方早生’及其早熟芽變果實的差異基因主要集中在y3與c4和y4與c5對比組中，這些差異基因大多被富集到分子功能中結(jié)合活力、氧化還原酶活性等方面。對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析表明，在果實生長發(fā)育成熟過程中伴隨著多種次生代謝產(chǎn)物的變化，如倍半萜和三萜生物合成、類黃酮生物合成、類胡蘿卜素的生物合成和-亞麻酸代謝等。同時，本研究發(fā)現(xiàn)生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在不同時間節(jié)點均有富集，這意味著植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對果實成熟具有極為重要的作用。【結(jié)論】在‘倉方早生’及其早熟芽變不同發(fā)育時期果實的差異表達(dá)基因中，大量激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因特別是生長素信號途徑基因發(fā)生了富集，這些基因可能在調(diào)控果實發(fā)育中具有重要作用，可對這些候選的和功能及其如何通過相互作用調(diào)控果實成熟的機制進(jìn)行進(jìn)一步的解析。

桃；果實成熟；轉(zhuǎn)錄組分析；加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

0 引言

【研究意義】桃是重要的落葉果樹之一，因其果實口感甜美和氣味芳香而深受消費者喜愛。但桃果實在貯藏和運輸過程中極易損傷變質(zhì)，生產(chǎn)中主要依靠種植不同成熟期的桃品種來延長市場供應(yīng)期。桃的果實成熟期是一個十分重要的農(nóng)藝經(jīng)濟性狀，選育不同成熟期的桃品種，對豐富市場供給、提高種植者的經(jīng)濟收益具有重要意義。本研究通過對‘倉方早生’及其早熟芽變進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出與果實成熟有關(guān)的代謝通路，深入挖掘與桃果實成熟有關(guān)的候選基因，分析相關(guān)基因表達(dá)變化與差異，為挖掘調(diào)控桃果實成熟的關(guān)鍵基因及其分子機制奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】果實成熟是一個非常復(fù)雜的過程，包括顏色、質(zhì)地、香氣和生物活性化合物等多個方面的變化[1-2]。大量研究表明，果實成熟涉及到多種植物激素的調(diào)控[3-4]。其中，乙烯（Ethylene，ETH）是呼吸躍變型果實成熟及其后續(xù)代謝變化的主要觸發(fā)和協(xié)調(diào)因子，直接影響果實品質(zhì)[5-7]。如HAYAMA等[8]所述，乙烯影響桃果實軟化的起始和進(jìn)程，其濃度是調(diào)節(jié)軟化速度的重要因素，桃果實的成熟軟化在轉(zhuǎn)錄水平上受乙烯的調(diào)控。乙烯的合成由ACC合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS）和ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）兩種酶催化[9-10]，是乙烯合成的關(guān)鍵基因，在桃果實中的轉(zhuǎn)錄隨著成熟的進(jìn)程而增加[11]。有研究表明，乙烯轉(zhuǎn)錄因子（ERFs）可以通過在不同程度上調(diào)控乙烯合成關(guān)鍵基因來影響果實成熟進(jìn)程[12-13]。同時，脫落酸（abscisic acid，ABA）作為一種關(guān)鍵的植物激素，也參與了呼吸躍變型果實的成熟和衰老，被認(rèn)為是包括桃在內(nèi)的幾種呼吸躍變型果實成熟的決定因素之一[14-15]。ABA可以啟動桃果實成熟，而且在果實成熟后期與乙烯一起積累[16]。在桃果實成熟過程中，ABA濃度顯著增加，加速桃果實的軟化和成熟[17]。此外，ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的基因?qū)麑嵆墒煲灿兄嗨频恼{(diào)控作用[18]。Zeng等[16]從桃中鑒定的10個2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C，PP2C）基因中，和可以引發(fā)果實成熟，并在果實成熟的后期發(fā)揮重要作用，在番茄中也有類似報道[19]。WANG等[17]在桃基因組中檢測到兩個9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）基因的表達(dá)水平與ABA一致，表明兩個基因可能是果實成熟過程中ABA積累的重要參與者。生長素（Auxin）也是果實發(fā)育成熟過程中的重要激素，有重要的調(diào)控作用[20-22]。通過TATSUKI等[23]的研究可以看出，在不同類型的桃果實成熟過程中，硬質(zhì)桃果皮組織中的IAA濃度較低，且沒有增長；但溶質(zhì)桃果皮組織中的IAA水平顯著增加，導(dǎo)致果實軟化。因此，桃成熟進(jìn)程中IAA濃度可以調(diào)控果實的成熟軟化。GUAN等[24]從桃基因組中鑒定到23個，表達(dá)模式分析得出和在完全成熟時顯著上調(diào)表達(dá)，且上調(diào)倍數(shù)最大，為果實發(fā)育、果實成熟進(jìn)程所必需；此外，由基因表達(dá)變化可知，等均可能在果實發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮功效。部分研究表明3種植物激素的調(diào)控因子協(xié)同調(diào)控桃果實成熟，如PAN等[25]發(fā)現(xiàn)，在處于低表達(dá)水平時，對硬質(zhì)型（stony hard，SH）桃果實成熟期間生長素的積累產(chǎn)生影響，從而抑制乙烯生物合成基因的表達(dá)，導(dǎo)致果實不能軟化；WANG等[26]發(fā)現(xiàn)是調(diào)節(jié)桃成熟過程中生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，與一起在桃果實成熟過程中整合生長素和乙烯信號，并通過結(jié)合和激活和啟動子促進(jìn)ABA生物合成，來調(diào)節(jié)桃果實的成熟和軟化。另有研究表明，通過抑制兩個ABA生物合成基因（、）和一個細(xì)胞壁降解基因（）的表達(dá)來調(diào)節(jié)果實成熟[27]。【本研究切入點】目前，桃果實成熟的機制尚未完全闡明。本研究將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)全面準(zhǔn)確地對桃果實成熟的通路進(jìn)行挖掘篩選與分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以桃品種‘倉方早生’及其早熟芽變?yōu)檠芯吭嚥模M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過分析‘倉方早生’及其早熟芽變的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挖掘出與參與調(diào)控果實成熟有關(guān)的激素信號途徑中的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試材‘倉方早生’和早熟芽變于2020年取自保定市順平西閆莊試驗園，兩品種盛花期相近，均在4月6—7日，花后59 d早熟芽變的果實開始著色，花后71 d達(dá)到成熟；‘倉方早生’花后89 d達(dá)到成熟，兩品種果實均屬于溶質(zhì)型。

每個品種分別選擇長勢一致的樣本樹5株。根據(jù)果實生長動態(tài)的4個發(fā)育時期（圖1）共采樣5次：花后30 d（第1次膨大期，對應(yīng)c1與y1）、花后45 d（硬核期，對應(yīng)c2與y2）、花后59 d（早熟芽變第2次膨大期，對應(yīng)c3與y3）、花后71 d（早熟芽變成熟期，‘倉方早生’第2次膨大期，對應(yīng)c4與y4）及花后89 d（‘倉方早生’成熟期，對應(yīng)c5）。每次分別隨機采取‘倉方早生’和早熟芽變果實10個，取5 g去皮果肉，切碎，迅速用液氮處理后置于-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及檢測、cDNA文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序 采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，China）分別對‘倉方早生’及其早熟芽變在不同采樣時間的果實進(jìn)行總RNA的提取，所有操作按照說明書進(jìn)行。取2 μL RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA樣品的質(zhì)量。用NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific，USA）對RNA質(zhì)量進(jìn)行初步檢測。利用HiFi Script gDNA Removal RT Master Mix（Beijing ComWin Biotech Co.,Ltd.）試劑盒合成第一鏈cDNA。采用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜測序，由北京華諾時代科技有限公司完成。

c：倉方早生Kurakato；y：早熟芽變Early-ripening mutant。下同 The same as below

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量評估 測序reads經(jīng)fastp（version 0.18.0）[28]過濾后得到clean reads，通常以Q20、Q30大小衡量測序準(zhǔn)確度，通常≥85%[29]。將得到的clean reads與桃參考基因組（http://www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_v1.0）比對，進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)注釋、基因表達(dá)分析和基因功能預(yù)測等。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組差異基因的實時熒光定量PCR驗證 使用Primer Premier Software設(shè)計qRT-PCR引物，利用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEN，China）合成cDNA。以為內(nèi)參基因，按照Ultra SYBR One Step RT-qPCR Kit （Beijing ComWin Biotech Co.,Ltd.）提供的說明書，在Light Cycler_96進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性60 s；95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 10 s，45個循環(huán)；95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s。采用2-ΔΔCT法[30]計算基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 樣品間差異表達(dá)基因及富集分析 通過EdgeR包（http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/ html/edgeR.html）計算篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEG），篩選條件是|log2Fold Change|＞1，-value＜0.05，log2（FC）為樣品1與樣品2的FPKM差異倍數(shù)的對數(shù)值[31]。采用GO和KEGG兩個數(shù)據(jù)庫[32]，對篩選出的差異基因進(jìn)行功能注釋以及通路顯著性富集分析。

1.2.5 植物激素相關(guān)代謝途徑中差異表達(dá)基因的篩選與熱圖分析 根據(jù)樣品間差異表達(dá)基因的GO功能分析與KEGG代謝途徑富集分析結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找出與桃果實成熟有關(guān)的代謝途徑。本試驗重點分析植物激素相關(guān)途徑并從中篩選出差異表達(dá)基因，進(jìn)一步明確基因的功能注釋，并利用Tbtools軟件制作熱圖對這些基因進(jìn)行分析。

1.2.6 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 首先對前期得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和質(zhì)量控制。利用GSG（Good Samples Genes）函數(shù)來檢測數(shù)據(jù)集中是否有離群值和缺失值。使用R中的WGCNA（v1.47）包構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[31]。篩選樣本間表達(dá)量差異最大的前10%的基因作為后續(xù)構(gòu)建加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)，直至篩選到樞紐基因。將樞紐基因的蛋白序列上傳至KEGG官網(wǎng)（http://www.KEGG.jp/）得到基因的功能注釋。對富集到生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的AUX/IAA進(jìn)行蛋白互作預(yù)測，得到若干個ARF蛋白，將IAA與ARF的相互作用關(guān)系通過Cytoscape進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

對‘倉方早生’及其早熟芽變果實不同生長發(fā)育時期的27個樣品進(jìn)行RNA提取以及轉(zhuǎn)錄組測序分析。經(jīng)過濾去除低質(zhì)量的reads后與桃參考基因組進(jìn)行比對，比對率均在90%以上。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的實時熒光定量PCR驗證

從轉(zhuǎn)錄組中選取變化趨勢明顯的8個DEG進(jìn)行驗證，包括5個果實成熟相關(guān)的DEG（、、、、）和3個隨機挑選的DEG（、、），結(jié)果如圖2所示。轉(zhuǎn)錄組測得的FPKM值與這8個基因相對表達(dá)量的變化趨勢基本一致，且與基因已知正常表達(dá)量一致，表明RNA-seq數(shù)據(jù)可靠，可以進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和關(guān)鍵基因挖掘。

2.3 桃‘倉方早生’與早熟芽變果實差異表達(dá)基因

把同一發(fā)育時期的‘倉方早生’和早熟芽變果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩對比，共獲得差異表達(dá)基因4 395個，其中上調(diào)基因2 212個，下調(diào)基因2 183個。如圖3-A所示，y1與c1、y2與c2、y3與c4和y4與c5中分別有282、152、1 409和2 552個差異表達(dá)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果實發(fā)育后期兩個階段（y3與c4、y4與c5）的差異基因數(shù)量較發(fā)育前期明顯增多。

通過維恩圖探究果實不同成熟期各樣品間轉(zhuǎn)錄組的不同，如圖3-B所示，鑒定到‘倉方早生’及其早熟芽變在不同成熟時期涉及的差異表達(dá)基因存在較大差異，各個發(fā)育時期均存在差異表達(dá)的基因有13個。對上述13個基因進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)其中的光合作用途徑（ko00195: Photosynthesis）與果實發(fā)育密不可分，鐵氧還蛋白-NADP+還原酶（ferredoxin-NADP+reductase，F(xiàn)NR）作為光合電子傳遞鏈的末端氧化酶直接參與光合作用；細(xì)胞色素P450途徑（ko00199: Cytochrome P450）中注釋到的，具有強大的催化作用，能通過植物新陳代謝來調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。

圖2 差異基因的qRT-PCR驗證

圖3 y1與c1、y2與c2、y3與c4、y4與c5四組差異基因數(shù)（A）及樣品間差異表達(dá)基因維恩圖（B）

2.4 差異基因的GO富集分析

GO富集分析可以反映桃果實發(fā)育過程中DEG的主要生物學(xué)功能。本研究將處于同一發(fā)育時期的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，果實中差異基因在生物過程（biological process）富集數(shù)量最多（圖4）。其中，y1與c1組間比較發(fā)現(xiàn)282個DEG，被富集到24個GO通路；y2與c2組間比較發(fā)現(xiàn)152個DEG，被富集到25個GO通路；y3與c4組間比較發(fā)現(xiàn)1 409個DEG，被富集到32個GO通路；y4與c5組間比較發(fā)現(xiàn)2 552個DEG，被富集到35個GO通路（圖5）。

圖4 ‘倉方早生’及其早熟芽變果實不同發(fā)育時期GO富集差異基因數(shù)目

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

將4個對比組中-value≤0.05的代謝途徑列為顯著富集的代謝途徑，通過KEGG分析顯示，y1與c1、y2與c2、y3與c4和y4與c5中分別有53、36、342和522個差異基因又被分別注釋到多條代謝途徑上，分別是66、50、189、179條。分析發(fā)現(xiàn)，在y1與c1組間主要富集在倍半萜和三萜生物合成、類黃酮生物合成、類胡蘿卜素的生物合成途徑；在y2與c2組間中GABAergic突觸途徑富集程度最高，然后是FoxO信號通路和自噬調(diào)節(jié)途徑；在y3與c4組間，主要富集的代謝途徑是光合作用、DNA復(fù)制、碳代謝；y4與c5組間顯著富集在減數(shù)分裂-酵母、細(xì)胞周期等方面（圖6）。但是，在處于果實發(fā)育后期的y3與c4及y4與c5對比組中，植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中包含差異基因數(shù)均較多，分別為27與40個DEG。

2.6 植物激素相關(guān)代謝途徑中差異表達(dá)基因的篩選與熱圖分析

本研究重點關(guān)注與植物激素有關(guān)的通路，從轉(zhuǎn)錄組中篩選到10個乙烯、11個脫落酸與18個生長素生物合成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，并對此進(jìn)行分析。

圖5 ‘倉方早生’及其早熟芽變果實不同發(fā)育時期差異表達(dá)基因的GO功能類別

圖6 ‘倉方早生’及其早熟芽變果實不同發(fā)育時期差異表達(dá)基因的KEGG富集

篩選出的10個與乙烯有關(guān)的差異表達(dá)基因中，包括2個乙烯生物合成基因和8個乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。如圖7-A所示，的表達(dá)在不同時間點均具有顯著差異，其中表達(dá)量高的（ppa001786m）在果實二次膨大期差異顯著，早熟芽變較‘倉方早生’表達(dá)量上調(diào)。

在ABA代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中（圖7-B），合成ABA的關(guān)鍵基因（ppa002804m）和分解ABA的關(guān)鍵基因P450單加氧酶（ppa005059m、MSTRG.14953.1）在‘倉方早生’及早熟芽變果實生長發(fā)育中表達(dá)差異顯著。在果實發(fā)育及成熟過程中，表達(dá)豐度良好，兩品種均于花后45 d達(dá)到最高值，成熟時，‘倉方早生’中表達(dá)量高于早熟芽變；2個表達(dá)模式相近，呈下降趨勢，且在果實成熟過程中，早熟芽變中的表達(dá)量較‘倉方早生’顯著下調(diào)，通過調(diào)控ABA合成與分解途徑中相關(guān)基因表達(dá)水平最終影響果實不同發(fā)育階段的ABA積累。在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，‘倉方早生’及早熟芽變從59 d之后到果實成熟，調(diào)控ABA受體基因及參與下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因表達(dá)差異顯著，在PYR/PYL-PP2C-SnRK2 ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，與表達(dá)都可能對果實成熟發(fā)揮重要作用。PP2C基因（ppa008381m、ppa005286m、ppa006696m）等表達(dá)量較‘倉方早生’下調(diào)；表達(dá)低且變化幅度小。

將參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的18個差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)量分析（圖7-C）。在花后45 d之前，相關(guān)基因（ppa002065m）在‘倉方早生’及其早熟芽變中表達(dá)無顯著差異；硬核期之后，早熟芽變果實中ppa002065m表達(dá)量逐漸下降，‘倉方早生’中該基因表達(dá)量先緩慢增加后降低。在花后45 d，早熟芽變果實中屬于家族的相關(guān)基因（ppa013846m、ppa013844m、ppa013765m、ppa013847m）表達(dá)量較‘倉方早生’上調(diào)，隨著果實逐漸成熟，其表達(dá)量逐漸增加。在果實生長發(fā)育過程中，AUX/IAA家族差異顯著基因共6個，其中除ppa010871m、ppa010501m在前期不表達(dá)外，其余4個基因表達(dá)量呈上升趨勢。在花后59、71 d，早熟芽變中AUX/IAA相關(guān)基因ppa010342m、ppa010871m、ppa009416m表達(dá)量較‘倉方早生’上調(diào)，其中ppa010871m表達(dá)量上調(diào)幅度最大。隨著果實發(fā)育成熟，ppa007483m、ppa010342m、ppa011935m、ppa011570m表達(dá)量逐漸增高。編碼的ppa003134m表達(dá)豐度較高且在‘倉方早生’及其早熟芽變果實發(fā)育后期表達(dá)量差異顯著。生長素合成限速酶基因（ppa007054m）的表達(dá)量在早熟芽變果實中自硬核期便迅速增加，而在‘倉方早生’中的表達(dá)趨勢則是先緩慢增加，后期才迅速增加。

A：乙烯；B：脫落酸；C：生長素 A: Ethylene; B: Abscisic acid; C: Auxin

2.7 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

為了鑒定與果實發(fā)育相關(guān)的基因，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中測得的34 375個基因進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。首先篩選出樣本間表達(dá)量差異最大的前10%的基因（3 483個）作為網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中的樣本-基因數(shù)據(jù)集。然后計算網(wǎng)絡(luò)權(quán)重，當(dāng)power=10時，相關(guān)性達(dá)到0.85，此時平均連接度趨近于0，為最優(yōu)軟閾值數(shù)。根據(jù)power值獲得臨近矩陣和拓?fù)渚仃嚕玫降耐負(fù)渚仃囀褂孟喈惗葘蜻M(jìn)行聚類，然后使用動態(tài)剪切法將樹剪切成不同的模塊，如圖8所示。本研究鑒定到14個模塊，各模塊所包含的基因數(shù)目見圖9。另外，各個模塊均具有相對獨立性，有利于后續(xù)模塊分析的公平性和客觀性。

經(jīng)分析鑒定，模塊turquoise中基因的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致兩品種果實成熟期出現(xiàn)差異的主要原因，以MM值和GS值篩選出隸屬于該模塊中的樞紐基因643個。將上述643個基因進(jìn)行KEGG通路分析，共有356個基因被注釋到了各種通路。經(jīng)統(tǒng)計，生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑注釋到的基因數(shù)目最多，包含了10個AUX/IAA基因，其表達(dá)量變化如圖10所示。AUX/IAA基因在‘倉方早生’和早熟芽變果實中表達(dá)量總體呈上升趨勢，但表達(dá)豐度呈現(xiàn)明顯不同。當(dāng)‘倉方早生’及早熟芽變果實達(dá)到成熟時，表達(dá)量最高，最小，且8自花后45 d表達(dá)量迅速增加。在‘倉方早生’及其早熟芽變的果實中，在各采樣時間點表達(dá)豐度良好，而在果實發(fā)育早期不表達(dá)，在成熟時達(dá)到峰值。在表達(dá)豐度中等的AUX/IAA基因中，的表達(dá)量隨果實發(fā)育成熟持續(xù)上升，當(dāng)果實進(jìn)入成熟時，上升趨勢最明顯。將上述IAA蛋白序列輸入到String中，搜索與之互作的ARF蛋白，并繪制IAA與ARF之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果通過Cytoscape進(jìn)行可視化（圖11）。以Degree繪制點的大小和顏色衡量該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵程度，以combined-score繪制線的粗細(xì)和顏色衡量互作關(guān)系的強度，點越大、越綠則節(jié)點越重要（ARF5＞ARF1＞AUX/IAA6＞AUX/IAA27＞ARF4），線越粗、越綠則互作更強（ARF5-AUX/IAA8＞ARF5-AUX/IAA20D＞ARF9-AUX/IAA20D＞ARF5-ARF4）。

圖8 基于diss TOM的動態(tài)混合算法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹

圖9 各個模塊中基因數(shù)量

從轉(zhuǎn)錄組中查找預(yù)測到的8個ARF蛋白，除ARF9以外，其余均被鑒定到。因此，對余下7個ARF基因進(jìn)行表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)在‘倉方早生’及早熟芽變果實中，隨著果實的發(fā)育進(jìn)程，不同ARF基因間的表達(dá)趨勢大為不同。在果實成熟終階段，表達(dá)水平達(dá)到峰值。多數(shù)ARF基因在‘倉方早生’及其早熟芽變中表達(dá)趨勢相似，而在兩個品種中表達(dá)趨勢相異（圖12）。在果實發(fā)育成熟過程中的表達(dá)豐度保持良好，且蛋白互作預(yù)測表明（圖11），與篩選得到的樞紐AUX/IAA基因均有互作關(guān)系。

圖10 ‘倉方早生’和早熟芽變中IAA的表達(dá)量

圖11 IAA和ARF的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖12 ‘倉方早生’和早熟芽變中ARF基因表達(dá)量

3 討論

3.1 ‘倉方早生’及其早熟芽變間的差異基因表達(dá)分析

本研究對‘倉方早生’及其早熟芽變不同發(fā)育時期果實進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)早熟芽變較‘倉方早生’果實多數(shù)基因下調(diào)表達(dá)。花后30 d，‘倉方早生’及其早熟芽變之間的DEG數(shù)量較低，而花后71 d時‘倉方早生’及其早熟芽變之間的差異表達(dá)基因數(shù)量最高，且各組間除y4 vs c5上調(diào)基因數(shù)目多于下調(diào)基因外，其他3個時期的下調(diào)基因數(shù)目均多于上調(diào)基因，因此推測發(fā)育后期可能是影響早熟芽變果實成熟差異的關(guān)鍵。GO富集顯示，4個對比組中注釋到生物過程類的基因數(shù)量最多，結(jié)合KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，在果實生長發(fā)育成熟過程中，伴隨著多種次生代謝途徑基因的差異表達(dá)，猜測果實在成熟過程中次生代謝產(chǎn)物大量合成，這為更深入研究果實內(nèi)在品質(zhì)形成的分子代謝機理奠定了基礎(chǔ)。

CHEN等[33]分析了兩種肉質(zhì)桃果實在3個不同發(fā)育階段的RNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定了包含52個在內(nèi)的120個差異基因可能與果實成熟軟化相關(guān)。ONIK等[34]對3個不同階段的蘋果進(jìn)行RNA-Seq分析，結(jié)果顯示，眾多差異表達(dá)基因參與了乙烯、脫落酸、生長素、赤霉素等激素生物合成途徑，MYB、NAC、WRKY和HSF等轉(zhuǎn)錄因子在成熟前和成熟后的果實間也存在差異表達(dá)；除乙烯外，ABA等激素在調(diào)節(jié)蘋果果實成熟中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并可能與乙烯信號相互作用。殷亞蕊[35]通過對‘京紅’桃與其晚熟芽變不同發(fā)育階段果實進(jìn)行RNA-Seq分析，從中篩選出23個生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的差異基因，和表達(dá)量隨著果實發(fā)育呈下調(diào)趨勢，且果實發(fā)育后期在晚熟突變體中的表達(dá)量顯著低于野生型；此外，隨著果實發(fā)育成熟進(jìn)程，多個IAA基因在野生型果實發(fā)育后期的表達(dá)呈明顯上調(diào)。本研究也發(fā)現(xiàn)植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在不同時間節(jié)點均有富集。‘倉方早生’及其早熟芽變果實發(fā)育進(jìn)程差異主要表現(xiàn)在硬核期及以后，早熟芽變果實比‘倉方早生’的硬核期短，推測可能是硬核期基因表達(dá)差異的影響引起后續(xù)植物中生長素、乙烯、脫落酸相關(guān)基因表達(dá)差異，激素相關(guān)基因表達(dá)差異又進(jìn)一步加速果實成熟相關(guān)基因的表達(dá)。

3.2 乙烯、脫落酸和生長素相關(guān)基因在果實發(fā)育過程中的差異表達(dá)分析

前期研究表明，在桃果實乙烯生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是控制桃果實成熟軟化的主要因子[36-39]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實成熟，表達(dá)量增加，當(dāng)果實成熟時，早熟芽變中表達(dá)量顯著高于‘倉方早生’。番茄、柿和甜櫻桃的表達(dá)量也表現(xiàn)出在成熟轉(zhuǎn)變期達(dá)到高峰，后熟期迅速下降的趨勢[40-41]。本研究發(fā)現(xiàn)在果實成熟過程中，相較于‘倉方早生’，早熟芽變中2個表達(dá)水平呈下降趨勢，且ABA合成關(guān)鍵酶顯著下調(diào)，多數(shù)PP2C基因表達(dá)量下調(diào)，暗示脫落酸積累的多少對果實發(fā)育成熟具有十分重要的作用。此外，鑒定到了多個生長素信號響應(yīng)因子、和，這些基因的啟動子區(qū)均包含保守生長素響應(yīng)元件，生長素響應(yīng)因子（auxin response factor，ARF）通過與這些元件特異性結(jié)合來調(diào)控生長素的響應(yīng)[42-44]，其中對于生長素極為敏感[45-47]。在果實發(fā)育前期，早熟芽變與‘倉方早生’相比，表達(dá)量上調(diào)，推測當(dāng)生長素達(dá)到一定濃度時，首先響應(yīng)生長素信號，通過對生長素的合成及運輸調(diào)控果實發(fā)育。另有研究表明IAA基因可以直接或間接促進(jìn)乙烯的生物合成，最終調(diào)控果實成熟進(jìn)程[42,48]。本研究中，與的表達(dá)量隨果實發(fā)育逐漸升高，并在果實成熟時表達(dá)量達(dá)到最高（圖10）。根據(jù)基因表達(dá)量的變化與早熟芽變比‘倉方早生’的上調(diào)倍數(shù)，推測、、等參與果實的成熟。此外，本研究還鑒定到在果實達(dá)到成熟時表達(dá)豐度良好，但在果實發(fā)育后期，在兩個品種中出現(xiàn)顯著的差異表達(dá)，因此推測可能參與果實成熟差異調(diào)控過程。

RNA-seq獲得的數(shù)據(jù)量大且條目繁多，WGCNA能夠有效從大量數(shù)據(jù)中提取到關(guān)鍵信息來解釋生物學(xué)現(xiàn)象[49]，因此，利用WGCNA解析具體的農(nóng)藝性狀，分析模塊的生物功能，挖掘模塊中的目標(biāo)基因，將為解析復(fù)雜的農(nóng)藝性狀提供重要的參考依據(jù)。本研究運用WGCNA算法從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘出了關(guān)于桃果實成熟的相關(guān)基因，并應(yīng)用該算法對‘倉方早生’及其早熟芽變果實不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過構(gòu)建無尺度的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)權(quán)重參數(shù)將數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類形成不同的模塊，再以相關(guān)系數(shù)值的大小對基因模塊的關(guān)聯(lián)性劃分，得到相關(guān)顯著的模塊turquoise，對模塊中具有特異性的基因深度分析。然后對上述基因進(jìn)行KEGG功能富集分析，進(jìn)一步篩選到與果實成熟相關(guān)的10個AUX/IAA基因，為闡明調(diào)控桃果實成熟的分子網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從桃‘倉方早生’及其早熟芽變果實不同發(fā)育時期的RNA-seq結(jié)果中篩選出與桃果實成熟相關(guān)的差異表達(dá)基因4 395個，其中上調(diào)基因2 212個，下調(diào)基因2 183個。通過WGCNA將差異基因劃分為14個共表達(dá)模塊，其中模塊turquoise是與桃果實成熟度顯著相關(guān)的特異性模塊，結(jié)合GO和KEGG分析，共篩選到39個植物激素相關(guān)通路的差異表達(dá)基因，涉及10個乙烯、11個脫落酸和18個生長素生物合成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。利用樞紐基因挖掘到10個作為候選基因，在此基礎(chǔ)上預(yù)測到了7個ARF基因，并用其構(gòu)建了基因互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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Transcriptome Analysis of Peach Fruits at Different Developmental Stages in Peach Kurakato Wase and Early-Ripening Mutant

1Horticultural Department, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, Hebei;2Mountainous Areas Research Institute, Hebei Agricultural University/Technology Innovation Center for Agriculture in Mountainous Areas of Hebei Province/National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding 071001, Hebei;3Baoding Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Baoding 071000, Hebei;4Wangshu Town Middle School of Yanshan County, Hebei Province, Cangzhou 061300, Hebei

【Objective】 In this study, transcriptome analyses were carried out on the fruits of Kurakato Wase peach and its early-ripening mutant at different developmental stages. The key factors involved in fruit ripening regulation were explored, so as to provide a theoretical basis for further study on the regulation mechanism of fruit ripening. 【Method】 The flesh of Kurakato Wase peach and its early-ripening mutant was sampled at 30 d, 45 d, 59 d, 71 d, and 89 d after anthesis, and transcriptome analyses were performed on the above samples. The candidate differentially expressed genes (DEGs) were verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The biological function of DEGs were analyzed through GO function and KEGG pathway. The weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) was constructed to identify the hub modules and hub genes closely related to fruit ripening. 【Result】 Four comparison groups including y1 vs c1, y2 vs c2, y3 vs c4 and y4 vs c5 were obtained based on fruit development stages. A tatal of 4 395 DEGs were identified with 2 212 up- and 2 183 down-regulated genes.There were 10, 11 and 18 candidate genes involved in ethylene, abscisic acid and auxin synthesis and signal transduction, respectively. The interaction networks between 10 IAA proteins and their predictive interacting proteins ARF were constructed. GO function revealed that the DEGs were mainly enriched in cellular processes, metabolic processes and monomeric processes in the biological process category; in cell component category, DEGs were mainly enriched in membranes and cellular components; in molecular function category, DEGs were mainly enriched in binding protein and catalytic activity. There were more DEGs in comparison groups y3 vs c4 and y4 vs c5, and these DEGs mainly enriched in molecular functions, such as binding and catalytic activity. The KEGG pathway analysis showed that a variety of secondary metabolites changed during fruit development and ripening, such as sesquiterpene and triterpenoid biosynthesis, flavonoid biosynthesis, carotenoid biosynthesis, and-linolenic acid metabolism. In addition, auxin signal transduction pathway was found to be enriched at different time nodes. 【Conclusion】 Among DEGs, a large number of hormone signal transduction pathway genes, especially auxin signal pathway genes, were enriched, and these genes might play an extremely important role during fruit ripening. The functions of candidate genesandand the molecular regulation of fruit ripening would be further elucidated in the future studies.

peach; fruit ripening; RNA-seq; WGCNA

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.012

2022-04-27；

2022-07-21

財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-30-2-03）、熱雜果現(xiàn)代種業(yè)科技創(chuàng)新團隊（21326310D）

彭佳偉，E-mail：1358345303@qq.com。張葉，E-mail：20528036@qq.com。彭佳偉和張葉為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者張學(xué)英，E-mail：yyzxy@hebau.edu.cn。通信作者陳海江，E-mail：chenhaijiang2001@163.com。通信作者田義，E-mail：tianyi@hebau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）