不同濃度L-Met 在擬南芥幼苗根系發育中的功能分析

王 雷，劉國蘭,2,3

（1. 濱州學院 生物與環境工程學院，山東 濱州 256603; 2. 山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室，山東 濱州 256603; 3. 山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，山東 濱州 256603）

根是植物吸收土壤水分和礦質營養的重要器官，為植物體提供機械支撐使其固定在土壤里。根系發育好壞直接影響作物地上部的生長狀況，很大程度上決定著作物的產量，因此對根系生長發育的研究具有重要的理論價值和實踐意義[1-2]。擬南芥作為雙子葉植物，其根系屬于直根系，主根發達，發揮著重要的作用，而作為根生命活動最為旺盛的部位-主根根尖，在根生長發育中作用是極其重要的[2-3]。從縱向上來看，擬南芥的根尖從向上依次可劃分為根冠、分生區、伸長區和成熟區[2,4]。其中，根冠位于根尖的最頂端內含淀粉粒，可以保護幼嫩的分生區并與根向地性有關。根尖的頂端分生組織（root apical meristem, RAM）也叫根尖生長點，該區域的細胞具有持續分裂產生新的細胞的能力[2,4]。分生區與伸長區之間的區域被稱為過渡區，過渡區的細胞分裂速度變慢，細胞變長并向伸長區轉化[2,4]。伸長區細胞進行伸長生長，細胞體積變大，最終細胞分化形成成熟區，此區表皮細胞部分發育成根毛，因此又稱之為根毛區[3-4]。根分生區從縱切面看，從外到內依次為表皮，皮層，內皮層，中柱鞘和中柱[4-5]。擬南芥根尖的幾大區域的組織和細胞都起源于位于根尖的一群具有無限增殖能力而本身保持未分化狀態，可以自我更新并能夠持續分裂形成新的子細胞－根干細胞[2,7]。根干細胞及中央的是幾乎不進行分裂的細胞組成根干細胞靜止中心（quiescent Center，QC）[6-8]。

Met 是脊椎動物包括人體的一種必需的含硫氨基酸[2,9-10]，具有多種生理功能，在植物中，Met 也是一種基本的代謝物，在胞內代謝中處于一個核心環節的位置[2,11-12]。前人研究發現，小部分的Met將用來參與蛋白質的合成，大部分的Met 將作為腺苷甲硫氨酸（SAM）的合成前體發揮作用[2,13-14]。Met 作為體內最重要的甲基供體，為DNA、RNA、脂質、蛋白質、生物堿、膽堿、果膠、植物甾醇等甲基化修飾提供甲基[2,13-14]。作為甲基供體，Met 通過SAM 調控細胞分裂、細胞壁合成、葉綠素合成，以及膜的合成等重要生物學過程[2,14]。此外，在高等植物中，Met 也是植物激素乙烯的合成前體物質[15-16]。研究發現，Met 也可為多胺合成過程提供丙胺基，在細胞分裂分化、細胞凋亡、基因表達，以及穩態維持等生物學過程發揮作用[2,15,17]。近年來研究發現，L-Met 亦可作為一種信號分子行使功能，激活位于擬南芥活性氧ROS 形成的上游GLR Ca2+通道來調節氣孔運動和植物生長發育[18]。前人利用營養缺陷突變體篩選單倍體煙草原生質體得到了第一個需要Met 的皺葉煙草突變體（10.1/9）[13,19]。此外，土豆反義CBL 轉基因植株，Met 含量降低，導致植株表現出發育遲緩矮小，土豆塊莖變小，數量降低等產量降低性狀[20]。目前發現，外源氨基酸特別是外源Met 對植物根系生長發育的影響鮮有報道，待補充完善。本研究在基礎培養基上添加不同濃度梯度的外源L-Met 培養擬南芥幼苗，通過對幼苗主根長度、分生組織長度、皮層細胞數目的統計分析，探究不同濃度L-Met 在擬南芥根生長發育中的的功能。本研究結果有益獲得利于根系生長的最佳外源甲硫氨酸添加濃度，這將為促進植物生長，作物增產增收提供重要的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 本研究中擬南芥材料均為擬南芥哥倫比亞型種子Columbia（Col-0）。

1.1.2 主要儀器與試劑 本研究用到的儀器包括高壓滅菌鍋（北京發恩科貿D-1），純水機（北京普析GWB-2T），電熱恒溫培養箱（上海一恒DHP-9082)，試驗電爐（天津市泰斯特儀器DK-98-Ⅱ），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒），移液器（2.5 μL，10 μL，20 μL，200 μL，1mL（Thermo Scientific）），電子天平（北京艾科勒ALC-210.3），DIC 和熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51），解剖鏡（NIKON SMZ1000）。雙人單面凈化工作臺（SW-CJ-2D，蘇州凈化設備有限公司），pH 計（SARTORIOUS PB-10），智能光照培養箱（上海一恒）。

本研究用到的試劑包括1/2MS 培養基（Phyto Technology Laboratories 公司，M5519），瓊脂（廣東環凱微生物科技有限公司），蔗糖（上海生工生物工程有限公司），氫氧化鈉（天津市福晨化學試劑廠），LMet（Sigma），阿拉伯樹膠（Sigma），水合三氯乙醛（Sigma），甘油（Sigma）。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物MS 培養基的配制 1/2MS 固體培養基：每700 mL 超純水加入4.48 g MS 培養基干粉，8 g 瓊脂Agar，15 g 蔗糖，定容到1 000 mL。1 mol·L-1NaOH 調節pH 至5.6～5.8，121 ℃，高壓滅菌20 min。

滅菌結束后，超凈工作臺倒平板，對照組采用1/2MS 培養基直接倒平板，500 mL 可倒20 個平板。含不同L-Met 濃度梯度1/2MS 培養基：L-Met 配制成0.3 mg·mL-1的母液，0.2 μm 過濾膜過濾除菌分裝-20 ℃保存備用；分別向冷卻至60 ℃的1/2MS 固體培養基中加入配制好的不同體積L-Met 母液，配制成含L-Met 濃度分別為0 μmol·L-1（A）、30 μmol·L-1（B）、60 μmol·L-1（C）、120 μmol·L-1（D）的梯度濃度培養基。

1.2.2 擬南芥無菌苗的培養及外源L-Met 添加試驗 種子表面消毒及播種：擬南芥哥倫比亞型種子（col-0）70%乙醇依次消毒3 次，每次消毒1 min；用50%次氯酸鈉溶液（含去污劑）消毒1 次，5 min；轉移至超凈工作臺，無菌水清洗3 次至溶液變清；將種子上下顛倒混勻后傾倒在滅菌濾紙上；隨后用無菌牙簽將種子點播在含不同濃度L-Met 的1/2 MS培養基平板上，15 粒均勻排成一行，封口膜封口后置于4 ℃冰箱冷暗處理48 h。

將平皿垂直放入光照培養箱培養，并保持一定的間距（以便有充分的光照）。光照培養條件：溫度（22±1）℃，濕度70%，16 h 光照/8 h 黑暗，16 000 lx光照強度。

1.2.3 幼苗表型分析 根長分析：擬南芥幼苗在1/2 MS 固體培養基上垂直培養7 d，高清像素相機拍照后用Image J 軟件（http://rsbweb.nih.gov/ij/），測量幼苗的主根長度，每次測量30～50 株。

幼苗根分生組織分析：分生組織的大小主要由從根尖靜止中心至伸長區之前的皮層細胞數目決定，取萌發7 d 的擬南芥幼苗加透明液（7.5 g 阿拉伯樹膠，100 g 水合三氯乙醛，5 mL 甘油，60 mL 水，室溫攪拌混勻3～5 h 或過夜）制片，于顯微鏡（20x 物鏡）下對根分生組織進行拍照（n＞30）觀察。

1.3 數據分析

用Excel 對數據進行統計分析，用SPSS 進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 L-Met 參與擬南芥主根的伸長生長

生長在不含有L-Met 的1/2 MS 培養基上的垂直培養的擬南芥WT 幼苗主根生長狀態良好，生長速度較快（圖1-A）。當L-Met 的處理濃度為30μmol·L-1時，WT 幼苗根系生長程較發達狀態（圖1-B），側根增多，主根長度與對照差異不大，或稍長。但隨著L-Met的處理濃度不斷提高，L-Met 的處理濃度為60 μmol·L-1時，WT 幼苗根系生長受到抑制（圖1-C），主根長度明顯變短，約為對照處理的三分之一長度，除此之外，地上部分的生長也稍受抑制。L-Met 的處理濃度為120 μmol·L-1時，主根生長抑制程度更顯著（圖1-D）。

圖1 不同濃度L-Met 處理下的擬南芥根系生長狀況

2.2 梯度濃度L-Met 處理下擬南芥主根長度統計

通過使用Image J 軟件對生長在不同濃度梯度（0、30、60、120 μmol·L-1L-Met）培養基上的擬南芥7 d苗齡WT 幼苗主根進行長度測量（統計樣本數平均大于20）, 數據統計分析發現生長在不含有L-Met培養基上幼苗主根平均長度為（33.4±0.9）mm（圖2）。當L-Met 的處理濃度增大為30 μmol·L-1時，主根增大0.9 mm，平均長度為（34.3±1.2）mm（圖2）。與對照處理相比較，統計分析，差異未達到顯著水平（P=0.058）。但隨著L-Met 的處理濃度不斷提高，LMet 的處理濃度為60 μmol·L-1時，根系生長受到抑制，主根長度明顯變短，統計數據顯示平均長度為（12.0±0.4）mm，與對照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）（圖2）。當L-Met 的處理濃度增大至120 μmol·L-1時，主根生長抑制作用更加顯著，平均長度為（10.0±0.7）mm，與對照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）（圖2）。

圖2 梯度濃度L-Met 處理下擬南芥主根長度

2.3 L-Met 處理后擬南芥根尖分生組織的變化

通過對根尖進行透明處理，顯微鏡拍照得到不同梯度濃度L-Met 處理下的根尖分生組織照片。圖3-A 為無添加L-met 處理下WT 的根尖分生組織，白色豎線標記的為根分生組織區域，是指從根尖靜止中心到過渡區的皮層細胞的區段。圖3-B 為30 μmol·L-1L-Met 處理下WT 的根尖分生組織照片，處于不斷分裂狀態的皮層細胞及根尖干細胞分裂活動比較旺盛。圖3-C 為60 μmol·L-1L-Met 處理下WT 的根尖分生組織的長度狀態，與對照相比較，根尖出現分化，分裂細胞減少。圖3-D 為120 μmol·L-1L-Met 處理下WT 的根尖分生組織的長度狀態，隨L-Met 濃度的增大，根尖分化程度愈趨嚴重，分裂細胞銳減。

圖3 梯度濃度L-Met 處理下擬南芥主根根尖分生組織

2.4 L-Met 處理后擬南芥根尖分生組織長度及皮層細胞數的統計

通過對生長在不同濃度梯度L-Met 培養基上的擬南芥WT 幼苗主根進行根尖分生組織長度進行測量，數據統計分析發現生長在不含有L-Met 的普通培養基上幼苗根尖分生組織平均長度為（243.0±9.1）μm。當L-Met 的處理濃度增大至30 μmol·L-1時，根尖分生組織變長，平均長度增至（254.2±5.6）μm，但與對照相比差異不顯著。隨L-Met 的處理濃度提高，L-Met 的處理濃度為60 μmol·L-1時，根尖分生組織變短，平均長度為（165.4±10.9）μm，與對照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）。當L-Met 的處理濃度增大至120 μmol·L-1時，分生組織繼續分化，平均長度為（122.1±13.6）μm，與對照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）（圖4-A）。

筆者同時對所統計的根尖分生組織區域所對應的皮層細胞數目進行統計，圖4-B 中所示，不含有L-Met 的普通培養基上幼苗根尖皮層細胞約（36.0±1.5）個；30 μmol·L-1濃度處理下，皮層細胞數增加，平均增至為（38.0±0.9）個；60 μmol·L-1濃度處理下，皮層細胞數銳減，平均降為（23.0±2.1）個，與對照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）；濃度增加至120 μmol·L-1時，皮層細胞數繼續降低，平均降為（18.0±2.0）個，與對照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 梯度濃度L-Met 處理下擬南芥根尖分生組織長度及皮層細胞數目

通過梯度濃度的L-Met 對擬南芥幼苗進行處理，擬南芥根尖分生組織長度及皮層細胞數都呈現同時增加或降低的相同趨勢。這說明L-Met 對擬南芥幼苗根生長發育的影響不是通過調節細胞大小體積實現的，而是通過調劑具有分裂能力的細胞數目的多少影響根的長度。L-Met 通過抑制根尖分生組織的分裂活性進而抑制主根生長。

3 討論與結論

本試驗主要是從研究甲硫氨酸對于植物根系生長發育的影響出發，在基礎培養基中添加梯度濃度的L-Met（0、30、60、120 μmol·L-1），光下培養7 d 后進行觀察統計分析。我們分別測定了主根長度，根尖分生組織長度以及皮層細胞數目等指標，試驗結果顯示，低濃度（30 μmol·L-1）的L-Met 可以促進擬南芥根系生長，主根變長，側根數目目測增多，但未達到差異顯著水平。與此同時，隨著L-Met 濃度的增加，其對根系生長的促進作用并不是梯度增強的。相反，L-Met 濃度越高，表現出對根系生長的抑制作用越強，即濃度大于60 μmol·L-1時，擬南芥主根生長明顯受抑制，根尖分生區細胞逐步分化，皮層細胞數目減少，進而導致根尖分生組織變短，且差異極顯著。繼續增大L-Met 濃度至120 μmol·L-1時，根尖分生區細胞分化愈發嚴重，L-Met 通過抑制根尖分生組織細胞分裂活性進而導致主根生長緩慢，根生長受抑制效應也更加明顯，統計分析差異極顯著。由此可以推斷，當L-Met 濃度增大至一定范圍，植物將不能正常萌發生長，甚至死亡。本研究還發現，LMet 濃度范圍在0～30 μmol·L-1范圍，是可以促進植物根系的生長發育的，因此可以尋找一個最佳LMet 濃度添加到培養基或其他培養介質中，為促進植物生長，作物增產增收提供新的思路。

本研究發現，L-Met 濃度范圍在0～30 μmol·L-1范圍附近，可以促進植物根系的生長發育，但促進根系生長的L-Met 最適宜濃度還有待驗證。擬南芥根尖在L-Met 濃度在增大至60 μmol·L-1會抑制根系生長，那么具體添加多少L-Met 濃度對促進擬南芥的生長效應最高，從多少L-Met 濃度開始對擬南芥的根系發育出現抑制還需要進一步探索。