1株mphA和mcr-1陽性鼠傷寒沙門菌的鑒定及耐藥特征分析

韓藝然 李欣平 朱坤鵬 彭玉倩 楊海燕 邱少富 向瑩

摘要：目的 1株mphA和mcr-1陽性鼠傷寒沙門菌的鑒定及耐藥特征分析；方法 分離自4歲腹瀉患者糞便樣本中的1株鼠傷寒沙門菌，使用沙門菌血清凝集法進行菌株鑒定，質譜法復核鑒定結果；使用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗；通過全基因組測序及耐藥基因注釋鑒定菌株所攜帶的耐藥基因；通過質粒測序及生信分析進行質粒類型鑒定、質粒耐藥基因、插入子等注釋及質粒結構分析；通過質粒接合轉移試驗評估質粒的水平轉移能力。結果 藥敏試驗結果顯示分離株對包括阿奇霉素、多黏菌素、頭孢曲松和環丙沙星等臨床常用抗生素藥物耐藥。耐藥基因鑒定結果顯示：該分離株攜帶包括大環內酯類抗性基因mphA，多黏菌素抗性基因mcr-1在內的12類45個耐藥基因及1個氟喹諾酮類耐藥點突變gyrA S83F。質粒測序分析結果顯示：該菌株攜帶一個260，008bp大小的IncHI2型質粒，該質粒攜帶包括mphA基因和mcr-1基因在內的19個耐藥基因，15種插入子，4種轉座子。質粒接合轉移實驗結果顯示該質粒可以在腸桿菌目細菌之間水平轉移。結論 研究結果為臨床治療鼠傷寒沙門菌感染中合理使用抗生素以及有效預防、控制耐阿奇霉素、多黏菌素鼠傷寒沙門菌的傳播提供了科學依據。

關鍵詞：鼠傷寒沙門菌；耐藥性；mphA；mcr-1；質粒

中圖分類號：R278；R378文獻標志碼：A

Identification and antimicrobial resistance analysis of a strain of Salmonella typhimurium positive for mphA and mcr-1

Han Yiran， Li Xinping， Zhu Kunpeng， Peng Yuqian， Yang Haiyan， Qiu Shaofu， and Xiang Ying

（1 College of Public Health， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001;

2? The Centre of Disease Control and Prevention of Chinese People's Liberation Army， Beijing 100071）

Abstract Objective To identify a mphA and mcr-1-positive multidrug-resistant Salmonella typhimurium isolate and analyze its antimicrobial resistance. Methods The strain isolated from a fecal sample of a four years old kid and collected. The Salmonella strains were identified by serum agglutination method， and the results were verified by mass spectrometry . The antimicrobial sensitivity test was conducted by microbroth dilution method. The antimicrobial resistance（AMR） genes were identified by whole genome sequencing and AMR genes annotation. Plasmid sequencing and bioinformatics analysis were used to identify plasmid types， annotate plasmid AMR genes and insertion sequences， and analyze plasmid structure. The horizontal transfer ability of the plasmid was estimated by plasmid conjugative transfer assay. Results The results of? antimicrobial sensitivity test showed that the isolates were resistant to commonly used antibiotics including azithromycin， colistin， ceftriaxone and ciprofloxacin. Identification of AMR genes showed that the isolated strain carried 45 AMR genes in 12 classes， including macrolide resistance gene mphA， colistin resistance gene mcr-1 and a point mutation in gyrA gene. Plasmid sequencing analysis showed that the strain carried a 260，008 bp size of IncHI2 plasmid， which carried 19 AMR genes， 15 classes of insertion sequences and 4 classes of transposons. The results of plasmid conjugative transfer assay showed that the plasmid could be transferred horizontally between intestinal strains. Conclusion This study provides a scientific basis for guiding the rational application of antibiotics and curbing the continuous spread of bacterial resistance.

Key words Salmonella typhimurium; Antimicrobial resistance; mphA; mcr-1; Plasmid

沙門菌感染是一個重大的全球性公共衛生問題，在許多國家引起了食源性疾病。食源性疾病主動監測網絡（FoodNet）報告的數據顯示，沙門菌已成為美國食源性細菌病原體的主要死亡原因[1]。目前，沙門菌已有2600多種血清型存在，鼠傷寒沙門菌是最常見的血清型之一[2]。在我國臨床腹瀉樣本分離的沙門菌中，鼠傷寒沙門菌的分離比例多年來排名第一或第二，感染發病率也常年居首位[3-4]。近年來，隨著抗生素的廣泛及長期使用，鼠傷寒沙門菌已進化出多種耐藥表型，呈現出耐藥率高、耐藥范圍廣的特點。由于常見用于治療鼠傷寒沙門菌感染患者的抗生素，如環丙沙星、頭孢曲松等的耐藥率增加，阿奇霉素被FDA推薦用于鼠傷寒沙門菌感染臨床治療藥物[5-6]。由于多黏菌素具有腎毒性和神經毒性的副作用，在20世紀80年代逐漸被其他抗菌類藥物所替代[7]。然而，近年來，隨著碳青霉烯類抗生素耐藥性的日益流行，多黏菌素被認為是治療多重耐藥革蘭陰性菌的最后手段[8]。隨著阿奇霉素和多黏菌素在沙門菌感染治療中的使用率增加，在病原監測過程中，發現了1株對阿奇霉素和多黏菌素共耐藥的鼠傷寒沙門菌，這是極少見的，因此我們對其的耐藥特征及其分子機制展開了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

菌株分離于重慶市渝中區4歲急性腹瀉患者糞便樣本的鼠傷寒沙門菌。

1.1.2 主要試劑

沙門菌-志賀菌（SS）瓊脂培養基（北京路橋技術股份有限公司）、營養瓊脂培養基平板（廣東環凱微生物科技有限公司）、沙門屬診斷血清（泰國S&D公司）、CMV3AGNF藥敏板（ThermoFisher Scientific）、Phoenixtm NMIC-413藥敏板（碧迪醫療器械有限公司）、麥康凱瓊脂粉（北京路橋股份技術有限公司）、CAMHB肉湯培養基（武漢金同浩博生物科技有限公司）、頭孢曲松、環丙沙星Etest試紙條（意大利Liofilchem生物公司）、QIAamp DNA Minikit 試劑盒（德國 QIAGEN 公司）、質粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司）。引物合成自生工（上海）生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器

Autof ms1000全自動微生物鑒定儀（鄭州安圖生物工程有限公司）、英國先德系列AutoReader自動快速微生物藥敏及鑒定分析系統和SWIN微生物數據處理與報告系統、MiSeq platform 測序儀（Illumina公司）、美國Bio-Rad公司的PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定與復核實驗

將實驗室保存的菌株進行復蘇，使用三區劃線法在LB培養基上進行過夜培養，在培養好的營養瓊脂平板上挑取單菌落使其在SS培養基上37 ℃培養16～18 h，然后根據典型菌落形態，（中心黑色邊緣無色透明）挑選單菌落接種于LB培養基上進行過夜培養，37 ℃培養16～18 h。通過O抗原和H抗原的玻片凝集法進行血清型鑒定，血清型鑒定過程嚴格參考國家沙門菌檢驗標準（GB/T4789.4-2016），通過質譜試驗對鑒定結果進行復核。

1.2.2 抗菌藥物敏感性實驗

采用肉湯稀釋法，選用CMV3AGNF和Phoenixtm NMIC-413商業化藥敏板進行抗菌藥物敏感性實驗，以大腸埃希菌ATCC25922菌株作為質控菌株。測定共包含16類35種抗生素，包括氨基糖苷類：慶大霉素（GEN，0.25～16 μg/mL）、妥布霉素（NN，?2～8 μg/mL）、阿米卡星（AN，8～32 μg/mL）、鏈霉素（STR，2～64 μg/mL）；抗菌青霉素+酶抑制劑：哌拉西林/他唑巴坦（TZP， 4/4～64/4 μg/mL））；頭孢類：頭孢唑林（CZ， 2～16 μg/mL）、頭孢呋辛（CXM， 4～16 μg/mL）、頭孢曲松（CRO，0.25～64 μg/mL）、頭孢他啶（CAZ， 1～32 μg/mL）、頭孢噻呋（XNL，0.12～8μg/mL）、頭孢哌酮-舒巴坦（SCP， 0.5/8～32/8 μg/mL）、頭孢吡肟（FEP， 1～16 μg/mL）、頭孢西丁（FOX，0.5～32μg/mL）；喹諾酮類：萘啶酸（NAL，0.5～32μg/mL）、左氧氟沙星（LVX， 1～8 μg/mL）、諾氟沙星（NOR， 2～8 μg/mL）、環丙沙星（CIP，0.015～4 μg/mL）、莫西沙星（MXF， 0.5～2 μg/mL）；磺胺類：復方磺胺甲惡唑（SXT，0.12/2.38～4/76 μg/mL）、磺胺異惡唑（FIS，16～256 μg/mL）；

β-內酰胺類：氨曲南（ATM， 2～32 μg/mL）；青霉素：氨芐西林（AMP，1～32 μg/mL）；青霉素+酶抑制劑：阿莫西林/克拉維酸（AUG2，1/0.5～32/16 μg/mL）、氨芐西林/舒巴坦（SAM， 4/2～16/8 μg/mL）；氯霉素類：氯霉素（CHL，2～32 μg/mL）；磷酸類：磷霉素（FF，16～128 μg/mL）；四環素類：四環素（TET，4～32μg/mL）、二甲胺四環素（MI， 1～16 μg/mL）；大環內酯類：阿奇霉素（AZI，0.12～16μg/mL）；多黏菌素：多黏菌素（CL， 1～4 μg/mL）；碳青霉烯類：厄他培南（ETP， 0.25～2 μg/mL）、亞胺培南（IPM， 0.25～8 μg/mL）、美羅培南（MEM， 0.125～8 μg/mL）；硝基呋喃類：呋喃妥因（FM， 16～24 μg/mL）；甘氨酰環素：替加環素（TGC， 1～8 μg/mL）。使用E-test藥敏法復核頭孢曲松和環丙沙星藥敏結果，挑取分離株單菌落于0.85% NaCl中，調整菌落形成單位為1.5×108 CFU/mL，用棉簽蘸取適量菌液涂布于MH瓊脂培養基上，將試紙條貼于MH瓊脂培養基上，37 ℃培養16～18 h，觀察抑菌情況并記錄MIC值。結果按照2021年版臨床和實驗室標準協會指南（CLSI M100S31）進行解釋[9]。

1.2.3 全基因組測序及耐藥基因檢測

使用QIAamp DNA試劑盒提取基因組DNA，使用NEBNext?Ultra?DNA library Prep kit for Illumina制備文庫，并使用Illumina的高通量測序平臺MiSeq生成配對端序列。質量控制和過濾通過Fastp （v0.20.1）[10]。使用SPAdes （v3.9.0）起草基因組組裝，使用QUAST （v4.5）進行基因組組裝質量評估，使用Prokka （v1.12）進行基因組注釋[11-13]。

使用綜合抗生素耐藥性數據庫（CARD）的耐藥性基因標識符（RGI）預測抗微生物藥物耐藥性（AMR）基因的存在[14]，使用BLAST（BLASTn）檢測每個基因組序列中覆蓋率超過70%的AMR基因組和80%的同源性，使用snippy軟件進行耐藥基因序列點突變比對分析。點突變基因進行PCR擴增，PCR產物進行一代測序，將測序結果與耐藥基因序列比對以驗證點突變。

1.2.4 質粒測序分析

使用Qiagen Plasmid Midi kit試劑盒來提取質粒DNA，質粒測序交由北京諾禾致源公司進行，并對質粒基因組進行拼接和組裝；通過RAST在線網站對質粒進行初步注釋；利用CGE網站中的PlasmidFinder功能鑒定質粒的復制子類型；使用Prokka （v1.12）進行基因組注釋，利用card和ISFinder數據庫對注釋結果進行補充，完善序列結構；采用BLAST Ring Image Generator （BRIG）進行質粒序列比較分析。

1.2.5 質粒結合轉移實驗

采用質粒結合轉移實驗測定質粒的可轉移性。以大腸埃希菌J53為受體，進行質粒偶聯轉移實驗。取出菌株劃線接種至LB培養基上，培養16～18 h，將單菌落接菌至5mL LB液體培養基的離心管中，放至37℃的搖床上增菌培養6 h；分別取20 μL的供體菌和60 μL的受體菌J53混于5 mL的LB液中，使供受體菌比例為1：3即可，放入 37 ℃恒溫培養箱中，靜置16～18 h；將上述菌液稀釋1000倍后，吸取100 μL涂布在含有100 mg/mL疊氮化鈉和25 mg/mL阿奇霉素及多黏菌素2 mg/mL的麥康凱培養基上，37℃靜置培養36～72 h。挑選單菌落，通過PCR擴增供體和衍生的轉偶聯菌株中存在的質粒。

2 結果

2.1 菌株鑒定及藥物敏感性

該分離株的0抗原為：1，4，[5]，12；H抗原第一相為：i；H抗原第二相為：1，2，血清型鑒定為鼠傷寒沙門菌，質譜實驗復核結果一致，SS培養基上菌落形態見圖1。耐藥性檢測結果顯示，該分離株對包括阿奇霉素、多黏菌素、環丙沙星、頭孢曲松等多種臨床常用抗生素耐藥（表1）。E-test實驗復核結果顯示，該菌株對頭孢曲松的MIC值為＞32 μg/mL，對環丙沙星的MIC值為1 μg/mL，根據CLSI M100判定標準，復核結果均為耐藥（圖2）。

2.2 耐藥基因檢測

該分離株攜帶12類45個耐藥基因，包括大環內酯類抗性基因mphA，黏菌素抗性基因mcr-1，氨基糖苷類抗性基因AAC（3）-Ⅳ、AAC（6）-Iaa、ANT（3）-IIa、APH（3）-Ib、APH（6）-Id、aadA2、acrD、kdpE，β-內酰胺類抗性基因blaCTX-M-14和blaTEM-1，磷霉素抗性基因fosA3，磺胺類抗性基因sul1、sul2，四環素類抗性基因tet（B），多肽類抗性基因bacA，二氨基嘧啶類抗性基因dfrA12，氯霉素抗性基因cmlA1、floR；外排泵相關基因CRP、acrA、ampH、H-NS、acrB、cpxA、golS、marA、mdsA、mdsB、mdsC、mdtB、mdtC、mdtK、msbA、oqxA、oqxB、qacH、sdiA、tolC和yojI，氟喹諾酮類抗性基因emrA、emrB和emrR（表2）。

該分離株攜帶1個氟喹諾酮耐藥基因點突變gyrA S83F，測序結果顯示，gyrA基因堿基序列的248位點由C突變為T，從而導致對應的氨基酸序列83位點由S（絲氨酸）突變為F（苯丙氨酸），該突變是產生氟喹諾酮耐藥性的重要機制[15-16]。

2.3 質粒測序分析

提取質粒并進行測序分析，分析結果顯示該質粒類型為IncHI2型。該質粒攜帶包括大環內酯類抗性基因mphA、多黏菌素抗性基因mcr-1在內的19個耐藥基因（表2）。對該質粒結構進行比對分析，結果顯示mphA基因位于IS26介導的轉座單元中，mcr-1基因位于ISApl1介導的轉座單元中，該質粒含有較多插入序列和轉座子，如IS2、IS4321、Tn5393和TnAs3等。質粒比對發現，該質粒與分離于我國廣州地區的圣保羅沙門菌中大小為237，710 bp的pS25質粒骨架相似，其覆蓋度為81%，相似度為99.98%（圖3）。

2.4 質粒結合轉移

質粒接合轉移成功之后的大腸埃希菌 J53 陽性接合子經 PCR 擴增驗證mphA和mcr-1基因陽性（表3和圖4），對結合菌進行藥敏實驗，實驗結果陽性接合子對阿奇霉素（最低抑菌濃度為≥16 μg/mL）及多黏菌素耐藥（最低抑菌濃度為＞4 μg/mL）（表1）。

3 討論

隨著臨床治療和畜牧業長期使用抗生素，沙門氏菌的耐藥率不斷上升，多重耐藥沙門菌的比例不斷提升。鼠傷寒沙門菌是世界范圍內沙門菌感染最常見的血清型之一，其耐藥問題尤為突出。研究報道多重耐藥鼠傷寒沙門菌blaCMY-2在墨西哥迅速廣泛傳播[17]，對當地公共衛生造成極大威脅。多重耐藥鼠傷寒沙門菌在我國鼠傷寒沙門菌中的占比也高達52.29%[18]。除了對常見抗生素的高耐藥率外，近年來，阿奇霉素及多黏菌素因其治療鼠傷寒沙門菌感染的有效性，這兩類抗生素的臨床應用相對增加，在抗生素選擇壓力下少數鼠傷寒沙門菌出現對阿奇霉素的耐藥性、極少數菌株出現對多黏菌素的耐藥性，這些耐藥鼠傷寒沙門菌的出現和傳播對臨床治療沙門菌感染提出了挑戰。

腸桿菌目細菌對阿奇霉素的耐藥機制主要包括①外排泵過表達，②多肽基tRNA水解酶過表達，③染色體突變，如核糖體蛋白改變和23S rRNA突變，④erm基因編碼的甲基化酶（特別是ermA和ermB）介導的甲基化，⑤ereA和ereB基因編碼的酯酶和/或mphA和mphB編碼的磷酸轉移酶介導的大環內酯失活。其中，mphA介導的阿奇霉素耐藥性在腸桿菌目細菌中被多次報道[19-20]。

質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr-1最初是2015年在中國的大腸埃希菌中發現的[21]。Hu等[22]通過已公開的細菌數據庫分析發現mcr-1基因序列最早可在2011年中國人腸道菌群的研究中被檢出。但mcr-1基因在腸桿菌目細菌中的檢出水平依然很低，在我國大腸埃希菌中檢出率為1.20%[23]，沙門菌中檢出率為1.08%[24]。由于mphA和mcr-1往往以質粒形式被攜帶，從而導致阿奇霉素、多黏菌素耐藥性通過水平轉移的方式在腸桿菌目細菌中快速傳播，這些基因甚至可以與其他的耐藥基因共同存在于單一質粒，表達后產生多種耐藥機制[25]。

本研究報道了1株同時攜帶mphA和mcr-1的鼠傷寒沙門菌。該分離株對包括阿奇霉素、多黏菌素等多種臨床重要抗生素藥物耐藥。值得關注的是該分離株對頭孢曲松、環丙沙星這些沙門菌感染治療的臨床一線藥物耐藥，這引起我們對臨床治療的有效性的擔憂。研究顯示該菌株攜帶12類45個耐藥基因及1個氟喹諾酮類耐藥基因點突變gyrA S83F，耐藥基因分析結果與耐藥性結果相匹配，這些耐藥基因的攜帶賦予了菌株廣泛的耐藥性。該分離株攜帶的大環內酯類抗性基因僅有mphA基因，多黏菌素抗性基因僅有mcr-1，說明mphA及mcr-1基因在該分離株中分別對阿奇霉素和多黏菌素的耐藥中起到了關鍵作用，與已有的研究報道一致[26-27]。

質粒是能夠在細胞之間自我傳遞的自主DNA分子，它們也能夠通過稱為高頻重組（Hfr）的過程動員部分染色體[28]。質粒通過轉座子或插入序列等可移動遺傳元件獲取新基因，以及它們在大范圍宿主中復制的能力，使它們成為抗菌素耐藥性（Anti-Microbial Resistance， AMR）傳播的完美載體。腸桿菌目細菌中最常見的質粒為IncA/C、IncFIB、IncN和IncHI2，這些質粒在不同菌株間抗生素耐藥性的傳遞中都起著重要作用[29-31]。在本研究中，mphA和mcr-1基因存在于IncHI2型質粒上，該類型質粒在鼠傷寒沙門菌中廣泛分布，在其多重耐藥的出現和快速傳播中發揮了重要作用。鼠傷寒沙門菌中IncHI2質粒常對碳青霉烯類、頭孢菌素類和氟喹諾酮類抗生素耐藥，而阿奇霉素耐藥的報道較少[32-34]。通過質粒結構比較分析，結果顯示p15G2563上存在15種插入序列和Tn3、Tn5393等4種轉座子，這些插入元件均能獨立轉位，可介導耐藥基因在質粒、整合子和染色體間轉移。本研究發現mphA由轉座子IS26轉座單元介導，mcr-1基因位于ISApl1介導的轉座單元中。IS26經常與編碼抗生素抗性因子的基因相關，據報道質粒中IS26的存在大大增加了額外IS26插入該質粒的頻率，從而形成包含多個抗生素抗性基因的區域，導致多重耐藥的發生[35]。ISApl1屬于IS30家族，是介導mcr-1基因最常見的插入元件，Laurent等人研究證實了復合轉座子結構ISApl1-mcr-1-ISApl1的轉位功能[36]，但近年來發現許多mcr-1基因在只有一個拷貝ISApl1的情況下被介導轉座[24]。質粒結合轉移實驗證明了p15G2563可以通過水平轉移導致耐藥性快速擴散。

本研究對該分離株進行了耐藥性和耐藥分子機制的研究，結果表明該分離株攜帶12類46個耐藥基因，對阿奇霉素、多黏菌素、頭孢曲松和環丙沙星等多種臨床常用抗生素耐藥。mphA和mcr-1基因的存在是該分離株分別對阿奇霉素和多黏菌素耐藥的主要機制，且這兩個基因均存在于p15G2563質粒上。p15G2563攜帶19個耐藥基因和多個可轉移元件，并且可以在腸桿菌目細菌之間水平轉移。廣泛耐藥菌株及攜帶多個重要耐藥基因的可轉移質粒出現，給臨床治療帶來了嚴峻挑戰。因此，需進一步加強對鼠傷寒沙門菌的抗生素耐藥特征和耐藥譜變化的監測，并持續探索其耐藥機制，特別是針對臨床一線治療藥物的耐藥性展開研究，這對于指導抗生素合理應用以及遏制細菌耐藥性的不斷蔓延具有重要意義。

參 考 文 獻

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