一株雞傳染性喉氣管炎病毒流行毒株的鑒定與致病性分析

王靜文，張 敏，陳 玲，楊承槐，蔣桃珍

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一種雞的急性、高度接觸性呼吸道傳染病，以呼吸困難、氣喘、咳出血樣滲出物為臨床特征，病理剖檢常見氣管與喉頭黏膜細胞腫脹、糜爛和出血，嚴重影響雞群的生長和發育以及生產性能[1]。該病1925年最早發生于美國[2]，我國最早報道見于貴州省。該病以往多發于蛋雞和種雞，近些年隨著我國養雞業蓬勃發展，商品肉雞中亦普遍發病。弱毒疫苗雖然存在著毒力返強、潛伏感染等諸多缺點，目前仍是防控ILT的主力軍，主要包括雞胚源和組織細胞源兩種[3-5]。

檢驗用強毒在活疫苗評價試驗中的重要性不言而喻[6]。美國藥典規定，攻毒后觀察10日，至少80%攻毒對照雞應出現死亡或嚴重臨床癥狀[7-8]；歐洲藥典規定，攻毒后觀察7日，至少90%攻毒對照雞應出現死亡或嚴重臨床癥狀[9]。《中國獸用生物制品規程》(2000年版)中界定的雞傳染性喉氣管炎病毒強毒株的標準為5只攻毒至少3只出現嚴重眼炎、咳嗽、喘氣等臨床癥狀；《中國獸藥典》中寫明，按照104.0EID50/只的攻毒劑量，10日內4只攻毒對照雞應至少3只出現眼炎和呼吸道癥狀；《獸藥質量標準》(2017年版)生物制品卷中指出，喉囊內接種ILTV王崗株104.2EID50/只，10只攻毒對照雞至少7只發病[10]。然而，目前庫存王崗株毒力普遍偏弱，不能有效滿足ILT活疫苗評價需求，因此亟需一株毒力更強、更穩定的ILTV強毒株。

本研究對一株ILTV流行毒株凍干物進行了系統鑒定，包括純凈性、病毒含量、特異性、真空度等，重點關注其作為檢驗用強毒在致病力方面的表現，為 ILT疫苗的效力評價奠定基礎。

1 材 料

1.1 毒株 雞傳染性喉氣管炎病毒江蘇株(ILTV JS株)由哈爾濱獸醫研究所劉勝旺研究員饋贈提供。

1.2 試劑 生理鹽水、5%蔗糖牛奶、無菌培養基、支原體培養基購自北京中海生物有限公司；外源病毒檢測試劑盒購自IDEXX公司；凍干保護劑(主要成分蔗糖、明膠、水解乳蛋白等)、胰蛋白胨磷酸鹽肉湯(TPB)、ILT陽性血清由實驗室制備保存。

1.3 實驗動物 SPF雞胚、SPF雞均購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

2 方 法

2.1 毒種繁殖 將ILTV JS株用TPB溶液10倍稀釋后，經絨毛尿囊膜接種10日齡SPF雞胚50枚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育120 h。無菌剪取出現增厚及痘斑的絨毛尿囊膜，高速勻漿研磨后加入10倍體積的TPB溶液。無菌檢驗合格后作為凍干用毒液，置于-70 ℃保存。

2.2 毒種凍干與封口 將待凍干病毒液分為兩批，一批與5%蔗糖脫脂牛奶等量混合；另一批與自制凍干保護劑按照2 ∶1比例混合，無菌分裝于安瓿瓶后立即置于凍干機內按常規程序進行凍干，隨后抽真空、火焰燒熔封口。將凍干毒種置于-70 ℃保存待檢。

2.3 性狀觀察 肉眼觀察凍干培養物在安瓿瓶內的狀態，輕輕振蕩觀察是否易與瓶壁脫離，以及加入稀釋液后的溶解情況。

2.4 無菌與支原體檢驗 隨機抽取10支凍干培養物，按照《中國獸藥典》附錄 3306和附錄3308進行無菌檢驗和支原體檢驗。

2.5 病毒含量測定 隨機抽取3支凍干培養物，用TPB溶液復溶至原體積后進行10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6四個稀釋度各經絨毛尿囊膜接種5枚10日齡SPF雞胚，每枚0.2 mL，同時設TPB溶液對照組。置37 ℃孵育120 h。到期后，打開雞胚外殼，觀察記錄絨毛尿囊膜出現灰白色痘斑或增厚的雞胚數，按照Reed-Muench法進行病毒含量計算。凍干后24個月，再次隨機抽取各3支凍干培養物，按上述方法進行病毒含量測定。

2.6 特異性檢驗 隨機抽取1支凍干培養物，用滅菌生理鹽水稀釋至200 EID50/0.1mL。取1.5 mL與等體積的ILT陽性血清混合，室溫作用1 h(期間振搖1次)，經絨毛尿囊膜途徑接種10枚10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，同時設置病毒對照組和生理鹽水對照組。置于37 ℃孵育，24 h內死亡雞胚棄去不計，觀察記錄24～120 h雞胚存活和出現痘斑發育情況。

2.7 外源病毒檢驗 隨機抽取1支凍干培養物，用生理鹽水作10倍稀釋后，點眼滴鼻加肌肉注射 21日齡的SPF雞20只，每只0.2 mL。21 d后，按上述途徑重復接種一次。第二次接種后21 d，采集所有雞血清，按照《中國獸藥典》附錄3305檢測所有相關病毒。

2.8 致病力試驗 隨機抽取1支凍干培養物，用生理鹽水分別稀釋至100 EID50/0.2mL和1000 EID50/0.2 mL，每個稀釋度分別氣管內接種21日齡、35日齡、49日齡 SPF雞各10只，每只0.2 mL。同時，每個日齡組設生理鹽水對照雞10只。接種后連續觀察14 d，記錄死亡數和出現精神沉郁、張口呼吸、結膜炎等癥狀，并于接種后第3天和第5天采集咽拭子，于1 mL TPB溶液靜置后，抽提病毒組DNA，用TK基因特異性引物(Forward 5'-3'：TCCGAGTTCGAGAACGATGAC，Reverse 5'-3'：GAGTGGGTGCCTATCTACGAG)進行PCR擴增，檢測病毒分離情況。擴增條件和程序如下：95 ℃預變性5 min，進入循環擴增：94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30次后72 ℃再延伸10 min。

3 結果與分析

3.1 性狀觀察 凍干培養物為海綿狀團塊，較易與瓶壁脫離，加生理鹽水振搖1 min內溶解。

3.2 無菌檢驗與支原體檢驗 凍干毒種按照《中國獸藥典》進行無菌檢驗和支原體檢驗，結果均符合規定。

3.3 真空度測定 使用高頻火花真空測定器對凍干毒種進行測定，出現白色、粉色或紫色輝光的判為合格。本凍干培養物真空度測定合格率為96%。24個月后隨機抽取5支，真空度檢驗5/5合格。

3.4 病毒含量測定 使用蔗糖牛奶作為保護劑的凍干毒對雞胚的半數感染量分別為104.9、105.0和104.8EID50/0.2mL，符合要求；使用自配凍干保護劑的凍干毒對雞胚的半數感染量分別為105.3、105.1和105.1EID50/0.2mL，符合要求，且略優于蔗糖牛奶的保護效果。24個月后，使用蔗糖牛奶作為保護劑的凍干毒對雞胚的半數感染量分別為104.5、104.5和104.0EID50/0.2mL；使用自配凍干保護劑的凍干毒對雞胚半數感染量分別為105.0、105.0和105.1EID50/0.2mL，自配保護劑的保護效果較蔗糖牛奶穩定。

3.5 特異性檢驗 該病毒可被ILT陽性血清完全中和，特異性良好。

3.6 外源病毒檢驗 血清抗體檢測結果表明無以下病毒的污染，具體結果見表1。

表1 外源病毒檢驗結果Tab 1 Results of adventitious agents detection

3.7 致病力試驗 該凍干毒在100 EID50和1000 EID50均可引起不同日齡(21日齡、35日齡和49日齡)SPF雞發病或死亡，且100 EID50即可引起至少80%的發病率(具體見表2和表3)，接種雞在接種后第3天，可從咽拭子中檢測到病毒核酸(圖1)，并出現精神沉郁、張口呼吸、結膜炎等臨床癥狀。自第10天逐漸減輕直至消失，剖檢死亡雞只喉頭和氣管內可見干酪樣分泌物或出血(圖2)。

表2 不同日齡雞只接種不同病毒含量病毒的發病率與死亡率Tab 2 The morbidity and mortality on different-day chickens caused by virus with different viral titers

表3 不同日齡雞只在不同攻毒劑量下的發病或死亡記錄Tab 3 Record of Clinical signs or death of chickens of various age with various challenge

NC：陰性對照; M：DL-2000 分子質量標準; Sample：咽拭子PCR擴增結果NC：Negative control; M：DL-2000 Marker; Sample：PCR products of swab extraction圖1 100 EID50攻毒后病毒PCR檢測結果Fig 1 Virus isolation by PCR post challange

A：臨床可見眼炎 結膜炎；B：氣管內干酪樣物質；C：喉頭黃色干酪樣物質；D：氣管喉頭充血出血A：Ophthalmitis，conjunctivitis；B：Cheesy secretions in trachea；C：Cheesy exudates in larynx；D：Congestion and hemorrhage in respiratory tract圖2 臨床癥狀及剖檢結果Fig 2 Clinical symptoms and pathological examinations

4 討 論

本研究所用原始毒株分離于江蘇某雞場病雞喉頭氣管，經接種雞胚絨毛尿囊膜所得[11]。在該毒株的制備繁殖與凍干中，經本試驗室摸索探究，將病毒稀釋液由生理鹽水更換為TPB溶液，可有效提升病毒含量；而將凍干保護劑由蔗糖牛奶換作自配保護劑，也減少了凍干損失，同樣有助于病毒含量的穩定。早在1955年，Ginsberg就將TPB溶液應用于Hela細胞的培養中，Watcharee Saisongkorh的研究也表明TPB溶液可有效提升貓立克次體在哺乳細胞系中的復制能力，這些應用多以5%～10%的比例添加于細胞培養液中[12-13]。而在該病毒的雞胚法擴繁，尤其是前幾代的繁育中，直接使用TPB溶液作為接種和收獲病毒的稀釋液，提升了病毒含量。在其他禽類病毒如傳染性法氏囊病病毒的繁殖培育中，TPB溶液的使用也有類似報道[14-16]。

而不同微生物因自身結構、培養方法等差異對保護劑的種類配比要求也不一樣。張云浦、王棟、孫中成等人對某些禽類疫苗如新城疫、傳染性支氣管炎、馬立克、雞痘等耐熱凍干保護劑都有過不同的研究報道[17-19]。本試驗中采用的保護劑成分與上述報道亦有相似之處，如應用水解明膠可去除雜質蛋白，防止有效活性物質隨水蒸氣升華分散，保證骨架支撐，促成更好的成品狀態；一定比例的蔗糖可降低滲透壓差，防止結晶，也能更好維持抗原性；水解乳蛋白和酪蛋白酶促水解物富含豐富氨基酸，保護或提供所需營養物質；谷氨酸鹽作為表面活性劑，降低凍結和脫水過程中張力引起的變形，并在復水過程中對活性組分起到潤濕作用；此外還有磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉等pH調節劑的加入[20]。從保存期結果可以看出，自配保護劑組與常規5%蔗糖牛奶組對比，同樣在-20 ℃以下存放24個月，前者毒價表現明顯更穩定，這對于檢驗用強毒而言十分關鍵。

在前期試驗中，我們采用庫存王崗株毒株對35日齡SPF雞的攻毒試驗結果顯示，104EID50劑量攻毒組，4/10出現張口呼吸癥狀，2/10死亡；104.5EID50劑量攻毒組，7/10出現張口呼吸，3/10死亡，且結膜炎表現不是很突出，可見以10000 EID50劑量接種也不能保證75%的發病率。本實驗室制備的凍干培養物針對不同日齡的雞只以100 EID50劑量攻毒即可導致80%的發病率，表現出穩定的致病力。從35日齡雞只攻毒結果可看出，與庫存毒株王崗株相比，更小的接種劑量可引起更高的發病率和致死率，且結膜炎臨床表現較為明顯，更易于觀察。下一步，擬在同樣的條件和劑量下，將本凍干物與王崗株一同作為攻毒對照，進行更加直接的比對和記錄，并擬建立和制定更為詳細的打分規則，使得攻毒對照更為直觀：如將呼吸頻率分為0(正常呼吸)、1(張口呼吸)、2(伸頸呼吸)；結膜炎分為0(正常)、1(腫脹和眼瞼部分閉合)、2(完全閉眼)；精神沉郁分為0(正常行為)、1(輕微沉郁)、2(嚴重抑郁無精神)；死亡直接記為3分等，同時引入不同時間點體重的測定，以更加立體、全面、細致地評價二者毒株差異[21]。

此外，在病毒分離檢測預試驗中，我們發現采用棉拭子途徑分離檢測病毒的敏感性不低于病死雞喉頭組織粘膜勻漿沉淀，甚至比喉頭組織上清液敏感性要高，并且PCR檢測出病毒陽性的時間與臨床上出現癥狀的時間基本一致：一般是從攻毒后第3天開始出現癥狀，第5天分離率最高，至10 d以后基本恢復。因此，在實際應用中，建議使用100 EID50劑量進行氣管內攻毒，并于攻毒后第3天和第5天采集咽拭子以作效力評價。

本試驗制備的雞傳染性喉氣管炎病毒流行株凍干毒可有效應用于疫苗評價，為方便獲取穩定大量表達，后期擬進行該毒株的細胞適應化研究，以進一步做好評價支持。