歐盟食品動物注射部位獸藥殘留指南概述

孫 雷，王亦琳，葉 妮，張 驪，王鶴佳

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

歐盟注射部位殘留指南最初于1994年作為注射部位殘留評估原則的工作文件發布，2004年被舊版注射部位殘留指南取代。2022年新發布指南與法規(EU)2019/6第4章中的新定義和術語進行了統一，增加了對注射部位殘留參考值(ISRRV)的引用，參考的法規和其他科學指南也進行了更新。另外，該指南應與歐盟可食組織休藥期制定指南(EMA/CVMP/SWP/735325/2012 Rev.2)[1]一起使用。本文詳細介紹了歐盟食品動物注射部位獸藥殘留指南，對于我國制定獸用注射制劑的休藥期具有較強的參考意義。

1 背 景

歐盟法規(EC)470/2009[2]規定擬用于食品動物的所有藥理活性物質都應對消費者安全性進行評估，確定宰前休藥期，以確保藥物殘留消除至允許濃度以下。每種獸藥有其自身的肌肉最大殘留限量(MRL)或注射部位殘留參考值(ISRRV)，因此每種獸藥應分別制定自身的休藥期，并作為上市許可的內容之一。

除了藥物劑型、給藥劑量和給藥次數之外，休藥期的長短很大程度上取決于給藥途徑。注射制劑在注射部位表現出的消除動力學速度明顯慢于其他可食組織，主要是因為設計成緩釋制劑或儲庫制劑，或藥物本身或劑型的理化性質，或其他因素，如皮下給藥、肌肉給藥或肌肉之間的結締組織給藥。給藥后出現的纖維化、包囊或壞死等組織反應是導致注射部位藥物釋放緩慢的另一個潛在因素。注射部位藥物殘留量相對較高，并且往往消除不規律不穩定，因此動物之間的差異有時很大。某些藥物在給藥部位的不均勻擴散可能導致藥物殘留的不均勻分布。與其他組織不同，注射部位樣品的準確位置會對發現殘留物有較大影響。另外，藥物在注射部位的代謝和/或降解，引起注射部位殘留物的總組成可能與其他組織大不相同。這一切表明，從藥代動力學角度來看，注射部位可能無法與其他肌肉等可食組織直接比較。因此，通過遠離注射部位的肌肉組織確定的休藥期通常不足以確保注射部位藥物殘留消除至低于MRL和ADI或其他參考值。因此，需要特別考慮注射部位藥物殘留對消費者的潛在風險。

2 適用范圍

該指南旨在評估食品動物肌肉注射和皮下注射時給藥部位獸藥殘留對消費者的潛在風險，并詳細闡述休藥期的確定方法。風險管理方面，例如殘留監控計劃中注射部位的殘留檢測不在該指南的范圍內。

申請人為建立休藥期而進行的所有體內實驗均應符合指令2010/63/EU[3]中動物保護的相關要求，以及替代、減少和優化的3R原則(EMA/CHMP/CVMP/JEG-3Rs/450091/2012[4]；EMA/CHMP/CVMP/3Rs/164002/2016[5])。

3 法律依據

根據2018年12月11日歐洲議會和理事會關于獸藥產品的條例(EU)2019/6(廢除指令2001/82/EC[6])第10、11、14、16和35條要求，用于食品動物的獸藥產品信息應包括休藥期。委員會批準條例(EU)2021/805[7]中第II.3B和IIIa.3B提出了確定休藥期所需的材料要求。

4 評價方法

基于法規470/2009(EC)和歐洲公開MRL評估報告(EPMAR)對藥物進行的風險評估，注射部位的殘留評估和休藥期制定應基于MRL、注射部位殘留參考值(ISRRV)、ADI或必要時的暴露限量。注射部位殘留評估應遵循下面總的原則：

委員會條例 (EU) 2018/782確定了法規 (EC)470/2009[8]中提及的風險評估和風險管理建議制定的方法原則，取代歐盟藥品管理規則第8卷[9]。

CVMP可食組織休藥期制定指南(EMA/CVMP/SWP/735325/2012 Rev.2)，取代之前的指南注釋：休藥期協調方法(EMEA/CVMP/036/95)[10]。

以及VICH指南：VICH GL 48確定休藥期的殘留消除實驗[11]，VICH GL49殘留消除實驗分析方法驗證[12]，VICH GL 57確定水產品休藥期的殘留消除實驗[13]。

另外，根據該指南獲得的注射部位休藥期不一定是最終休藥期，注射部位休藥期應該與其他可食組織休藥期進行比較，選擇最長休藥期作為產品最終監管用的休藥期。在休藥期時間點，所有可食組織中的藥物殘留量都應低于法規(EU)37/2010[14]規定的MRL，或低于ISSRV(適用時)；如果沒有MRL或ISSRV，可以選用其他參考值，如ADI或暴露限量。詳見圖1以及可食組織休藥期制定指南(EMA/CVMP/SWP/735325/2012 Rev. 2)。

4.1 基于MRL的方法 對于有肌肉MRL的藥物，注射部位通常被視為肌肉組織，殘留評估應考慮肌肉MRL和殘留標志物。休藥期應確保注射位點的殘留標志物濃度降至肌肉MRL以下，休藥期的制定應符合可食組織休藥期制定指南要求(EMA/CVMP/SWP/735325/2012 Rev. 2)。

大多數情況下，注射位點基于MRL的方法可以獲得足夠安全的休藥期。但是，采用這種方法時應確保肌肉中的殘留標志物對于預測注射部位的關注殘留物也是有效的，如果肌肉的殘留標志物不是注射部位殘留物的組成部分(如肌肉中的代謝物不在注射部位出現)，則可能認為不合適。換句話說，某些情況下基于MRL制定的休藥期不一定能確保包括注射部位在內的標準食物籃中殘留物的攝入量低于ADI。如果有任何跡象表明基于MRL的方法可能與ADI不一致，則需要進行基于ADI的評估，以確定計算休藥期的合理性。

圖1 注射部位的采樣和檢測以及基于MRL和ADI的休藥期評估Fig 1 Sampling and detection of injection site and evaluation of withdrawal period based on MRL and ADI*在某些情況下，需要同時進行基于ADI的評估來檢驗基于MRL確定休藥期的合理性，以確保食物籃中的殘留物低于ADI；**根據可食組織休藥期制定指南((EMA/CVMP/SWP/735325/2012 Rev. 2))計算休藥期，另外，還必須根據其他組織的MRL計算各自休藥期，最長休藥期將被視為最適合監管用的休藥期。

4.2 基于ISRRV的方法 對于注射部位殘留消除采用肌肉MRL會延長休藥期的藥物，歐盟制定了注射部位殘留參考值(ISRRV)。ISRRV的設置水平應確保在可能的休藥期內，包括注射部位在內的300 g標準食物籃中藥物殘留量低于ADI。ISRRV并未在法規(EU)37/2010中公布，而是在歐盟公共MRL評估報告(EPMAR)中提供了該數值。例如：加米霉素在羊肉MRL為50 μg/kg，ISRRV為1500 μg/kg；泰拉霉素在豬肉MRL為800 μg/kg，牛肉MRL為300 μg/kg，ISRRV為6000 μg/kg。

使用基于ISRRV的方法計算休藥期原則上和基于MRL的方法類似，通過比較殘留數據和ISRRV進行推算。

4.3 基于ADI的方法 對于沒有肌肉MRL或ISRRV的藥物，注射部位藥物殘留評估的參考值通常是ADI。注射部位基于ADI的殘留評估應包括藥物所有相關的ADI終點(如必要時的藥理學ADI、毒理學ADI和微生物ADI)。根據ADI的類型，關注的殘留可能是與藥物相關的總殘留，也可能是總殘留中的毒理學、藥理學和/或微生物活性成分。

膳食結構中殘留物的評估應基于包括注射部位在內的標準食物籃，注射部位應作為肌肉組織看待，300 g食物籃模型應體現注射部位的藥物殘留。基于ADI的方法進行休藥期計算的過程如下：

1.確定每個時間點每只動物300 g注射部位的關注殘留量以及其他可食組織中的關注殘留量(必要時考慮殘留標志物/關注殘留的比值)；

2.對于每個時間點的每只動物，確定標準食物籃中的殘留總量，其中肌肉中的殘留量由根據(1)推導出的注射部位殘留量代替；

3.確定合適的ADI。

4.4 基于暴露限量的方法 該方法原則上適用于委員會條例(EU)37/2010附件表1中“無需制訂MRL”的藥物，這些藥物尚未確定ADI，但當作為特定的注射制劑使用時，有可能在注射部位留下相對較高的殘留量，且仍具有生物活性。常用的暴露限量有：建議的飲食上限(例如維生素)、可耐受的攝入量上限(例如礦物質/微量元素)、內源性化合物的天然堿含量或任何其他適當的限量。所選暴露限量的合理性以及評估方法都需要進行科學論證。

這類藥物休藥期的制定原則上和基于MRL、ISRRV或ADI的方法類似，通過將殘留數據與暴露限量(通常指某一濃度(即類似于MRL或ISRRV方法)或殘留量(即類似于ADI方法))進行比較來確定休藥期。

5 殘留研究

5.1 總體原則 注射制劑需要知道注射部位的藥物殘留情況。含有新活性成分的藥物，通常要進行合理的實驗給出藥物相關的殘留特征，包括具有潛在生物學意義的代謝物和降解/轉化產物。這些信息通常在放射性殘留消除研究中獲得(即總殘留物；關于放射性殘留研究的一般指南，見VICH GL 46[15])，或適當情況下進行的旨在表征藥理、毒理或微生物活性殘留物成分的殘留消除研究中獲得。

注射部位已知殘留物組成的產品，通常無需進行放射性殘留消除研究，只需測定注射部位母體藥物或其他任何相關的殘留物組成即可(如適用時的殘留標志物)。然后，可從已發表文獻中獲得評估關注殘留物的相關支持性數據(如殘留標志物與總殘留的比值)。

肌肉注射或皮下注射的仿制藥品，成分的微小差異就可能對注射部位的消除產生顯著影響，標準的血藥法生物等效性研究中可能無法檢測到。因此，這類制劑除了證明生物等效性外，還應證明注射部位殘留消除等效，以便采納參比藥品的休藥期。但是，如果證明注射部位的消除較慢，導致休藥期比參比藥品的長，則應將此更長的休藥期作為總的休藥期。也可參見“生物等效性指南4.4部分”[16]。如果證明仿制藥品在注射部位的消除更快，則仍采用參比藥品較長的休藥期，這是因為尚不清楚其他可食組織是否確定了休藥期。

有肌肉MRL或ISRRV的藥物，必須進行注射部位的殘留標志物消除實驗，證實注射部位的殘留藥物消除至MRL或ISRRV以下。如果注射制劑含有殘留標志物特定的衍生物(如母體化合物的酯衍生物)，對分析方法就要進行一些特殊處理(如凈化、裂解/水解步驟等)，以便確定注射部位殘留標志物的準確濃度。

5.2 實驗設計和采樣 進行殘留消除實驗，應在獸醫臨床實踐中常用作注射部位的部位給藥，也應反映肉制品行業指南要求，避免造成注射部位組織損傷，不得在主要肉塊給藥。獲得的實驗數據必須能證實可能的最大殘留量，因此必須按照預期的標簽說明書中最大給藥劑量給藥。如果預期用途是多次給藥，則應按照最多次數給藥。實驗動物應能代表靶動物的年齡和體重，整個實驗過程都應按照正常的飼養水平進行管理。

殘留消除實驗還應包括可能的最大給藥體積，如果藥物預期用于所有年齡/體重動物，但只進行了低年齡/低體重的動物實驗，使用較小體積藥物，那么就不可能外推至使用最大體積藥物的殘留情況。建議仿制藥品每個給藥位點的最大給藥體積應該和參比藥品批準的最大給藥體積一致，同時，還應考慮注射體積的適用性、動物福利和局部耐受性。

注射部位殘留實驗應將注射位點進行永久標記，以便宰殺動物時能夠清晰定位和識別，給藥時應在底層組織的中心給藥，宰殺動物后立即對注射部位進行采樣。注射部位的組織采樣方法直接影響殘留濃度，因此,采樣方法在合理可行的范圍內盡可能最佳：宰殺和采樣程序的設計應確保將具有代表性的組織樣品從殘留濃度最大的區域切走。建議用下面所述的標準方法采集注射部位的初級樣品(核心樣品)：

在動物大小允許的情況下，取大約500 g的組織進行勻漿。該樣品應以注射位點為中心，并采用表1中給出近似尺寸的圓柱體形狀。必須注意，應盡可能包含針頭軌跡、藥物釋放區域和任何組織反應區域。如果有多個注射位點，采樣應包括最后一次注射的部位，至少包括給藥較多的注射部位。實驗設計應確保最后的注射部位位于注射次數較多的身體一側。

表1 注射部位殘留采樣Tab 1 Sampling of injection site residues

為確保上述采樣方法足以代表殘留物的濃度，建議可能的情況下，在每個注射部位采集并分析第二個約300 g的同心環形對照樣品，該樣品來自注射部位已經切走樣品的周圍(外圍樣品)。但是，不可能總是再采集到另外的300 g組織樣品，特別是頸部注射時。如果實驗需要，可以減少外圍樣品的重量，但是所收集的樣品量應滿足分析要求。

實際操作時無法采集準確重量的樣品，采集樣品的重量總在目標值附近變化。注射部位核心樣品通常在400 g至600 g(500±20%)范圍內被認為是可接受的。樣品重量如果遠低于此范圍可能沒包括注射位點相關的組織，通常被視為不具代表性(在缺乏明確和令人信服的相反證據情況下)。注射部位外圍樣品通常在240 g至360 g(300±20%)范圍內。

根據VICH GL 48，質控樣品的采樣程序應確保所采樣品能覆蓋注射部位，這些個例采樣方法需進行論證，同時考慮已有數據和制劑特點。除了使用外圍樣品，還可考慮使用以下方法，但所列方法并不全。

沿著注射軌跡和/或刺激部位收集橢圓形(或其他合適形狀)樣品, 應提供證據證明該方法針對注射部位，例如附上采樣部位的照片。

根據從總放射性標志殘留物研究(TRR)中獲得的信息，提供注射部位殘留物潛在的轉移數據。如沿著注射軌跡和/或刺激部位采集一個圓形核心(或橢圓形)樣品以及幾個鄰近樣品進行TRR比較。如果該方法證明是一種合理的采樣技術，那么在標志殘留物消除研究中只需采集上述的初級樣品即可。該研究中通常會建議增加一個額外的時間點(比休藥期更長的時間點)。

根據靶動物安全性實驗獲得的信息(注射部位的病理檢查)，提供注射部位殘留潛在的轉移數據。

使用與有色染料混合的受試藥品進行上述研究，以便目視評估注射部位殘留物的潛在轉移。

根據VICH GL 48，可以使用每只動物多個注射部位的概念：如果明確休藥期是通過注射部位殘留消除確定的，就可以選擇每只動物兩個注射部位來收集數據(并在確定休藥期時使用這兩個部位的數據)。這種做法可以減少動物數量，有利于動物福利。例如：僅單次注射給藥的藥品，可以第0天于頸部右側給藥，第4天于頸部左側給藥；第二次給藥后第7天安樂處死動物，這樣就可以提供停藥7 d左側注射部位)和11 d(右側注射部位)的消除數據。但是，這種情況下，不能保證其他組織的采樣和檢測結果，因為違反了標簽說明書規定用藥(一次注射變為兩次注射)，就可能引起這些組織中的藥物殘留過度升高。這種給藥方案是專門為通過注射部位殘留消除確定最終休藥期而設計的。

注射部位的核心樣品和外圍樣品在殘留檢測之前，應將整塊進行徹底勻質，以避免分析不均勻的樣品。休藥期評估時，核心樣品和外圍樣品的檢測結果都應進行考慮。如果外圍樣品的殘留量高于核心樣品，除非提供可接受的理由，否則該點不應參與統計計算。

除了法規(EU)2018/782要求的一般數據外，注射部位的殘留實驗還應附有與藥物注射解剖學部位選擇、所用注射技術和設備、注射深度(肌肉注射時)、宰殺時準確定位和識別采取的措施、采樣和樣品制備等全面詳細的實驗設計和實驗條件，還應提供專家對所選采樣方法的研判。

6 相關定義

該指南重點對注射部位、通用術語(ADI、MRL和休藥期)、特定暴露和殘留相關術語(標準食物籃、可食部分(注射部位)、殘留標志物、總殘留、毒理學關注殘留、藥理學關注殘留和微生物學關注殘留)進行了詳細定義。對于注射制劑，注射部位可食部分包括在300 g食物籃中；基于ADI的休藥期評價方法就是用300 g注射部位肌肉替代常規的肌肉。

7 結束語

對食品動物注射部位進行獸藥殘留消除研究，制定科學合理的休藥期，為養殖過程中保障動物性食品質量安全具有十分重要意義。歐盟對注射制劑在食品動物注射部位的獸藥殘留研究方法對我國制定獸用注射制劑的休藥期具有較強的參考意義。