穩心顆粒調節心肌梗死大鼠心肌縫隙連接蛋白43表達及自噬的研究

呂 夢，紀曉迪，劉珂珂，婁利霞，聶 波，趙久麗，吳愛明

心肌梗死后繼發的快速型室性心律失?？蓪е滦脑葱遭赖陌l生[1]?？p隙連接可作為心肌梗死后心律失常的有效治療靶點。在心臟中，縫隙連接介導心肌細胞間的電偶聯，是維持正常心律、調節血管張力和細胞間代謝交換的基礎[2]?？p隙連接蛋白43(CX43)主要在心房和心室肌細胞中表達，是心臟中最豐富的CX亞型[3]。自噬是細胞內受損細胞器和蛋白質降解的保守過程，心肌細胞可以通過自噬降解錯誤折疊或老化的蛋白質以及細胞器，為心肌細胞提供能量供應從而維持正常的心肌功能，而在心肌梗死病理條件下過度激活的自噬則可引起大量細胞死亡，加重病情進展[4]。研究表明，誘導自噬的條件對連接蛋白的表達水平有直接影響[5-6]。

穩心顆粒由黃精、三七、黨參、琥珀、甘松5味藥配伍而成，對于多種原因引起的心律失常有顯著療效。本課題組前期研究發現，穩心顆?？赏ㄟ^調控CX43的表達分布，從而改善心律失常[7]；而在細胞實驗層面，已發現穩心顆?？烧{節肥大心肌細胞自噬水平[8]。基于以上線索，本研究通過結扎冠狀動脈左前降支，建立心肌梗死大鼠模型，初步探討心肌梗死后心律失常病理條件下，穩心顆粒對CX43的表達以及心肌自噬水平變化的影響，以此進一步揭示心肌梗死后心律失常的發病機制并闡明穩心顆粒新的干預靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠40只，體質量(200±20)g，購于北京維通利華實驗技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。通過醫學倫理審批后，于中醫內科學教育部重點實驗室屏障環境動物室中飼養。

1.2 藥物及試劑 穩心顆粒，每袋5 g(山東步長制藥股份有限公司，國藥準字Z10950026)。酒石酸美托洛爾片，每片25 mg(阿斯利康制藥有限公司，批準文號H32025391)。自噬相關蛋白微管相關蛋白/輕鏈3(LC3)、酵母自噬相關基因6哺乳動物同原體(Beclin1) 、P62、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Proteintech抗體公司，貨號分別為14600-1-AP、11306-1-AP、18420-1-AP、10494-1-AP)，CX43抗體(Abcam公司，貨號ab11370)。辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(蘭博利德公司，貨號S0101)，免疫組化通用SP試劑盒、3，3-N-二氨基聯苯胺四鹽酸(DAB)顯色試劑盒(中杉金橋公司，貨號分別為SP-9000、ZLI-9018)，超敏增強化學發光法(ECL)試劑盒(新賽美公司，貨號P10100)。

1.3 儀器 超高分辨率小動物超聲成像系統(加拿大VisualSonics公司，型號：Vevo 2100)，泰盟BL-420S生物機能實驗系統，徠卡石蠟切片機(型號：RM2235)，電泳儀(北京龍方科技有限公司，型號：LF-2000)，水平式脫色搖床(北京龍方科技有限公司，型號：LF-TS03)，光學顯微鏡(德國徠卡顯微系統，型號：DMC5400)，ECL化學發光成像系統(上海天能科技有限公司，型號：Tanon-4600)。

1.4 方法

1.4.1 模型制備[9]選取32只大鼠，在大鼠左胸前區第3、4肋間逐層剪開皮膚、肌肉層，鈍性分離肋骨層，撕開心包膜后，充分暴露手術視野，采用心臟左冠狀動脈前降支結扎法建立心肌梗死大鼠模型，肉眼可見結扎線下左室前壁缺血變白，術后即刻心電圖可見ST段明顯抬高，術后24 h心電圖可見病理性Q波形成。

1.4.2 分組及給藥 以術后24 h前壁V3～V6導聯、側壁Ⅰ導聯、aVL導聯，同時兼有前間壁V1導聯或V2導聯可見病理性Q波為建模成功標準[10]。隨機分為模型組、美托洛爾組、穩心顆粒低劑量組、穩心顆粒高劑量組，每組8只，另取8只大鼠為正常組。穩心顆粒低劑量組(1.35 g/kg)和美托洛爾組(2.25×10-3g/kg)的給藥劑量參考文獻[11]的等效劑量換算方法進行折算，穩心顆粒高劑量組(2.7 g/kg)的給藥劑量為低劑量組的2倍。術后24 h開始灌胃給藥，每日1次，連續治療4周。正常組及模型組均給予等量生理鹽水。

1.4.3 超聲心動圖檢測 給藥4周后，使用小動物心臟超聲心動圖測量評價大鼠心臟結構和功能。麻醉大鼠后，測量并記錄左室短軸收縮末期前壁厚度(LVAWs)、左室舒張末期前壁厚度(LVAWd)、左室收縮末期內徑(LVIDs)、左室舒張末期內徑(LVIDd)以及左室射血分數(LVEF)。所有原始測量值選取至少3個連續心動周期，取平均值。

1.4.4 心室顫動閾值測定 在體心臟電刺激誘發心室顫動。給藥4周后，腹腔注射麻醉大鼠，行氣管插管，連接呼吸機輔助呼吸，連接BL-420生物機能系統，啟動系統軟件，選擇菜單“輸入信號/通路1/心電”后，出現心電圖波形。沿四五肋間開胸并暴露心臟，刺激電極的正極鉤在心尖，負極鉤在靠近心底方向與正極相距3 mm，設置電刺激條件(粗電壓，串刺激，串長10個刺激波，起始強度1 V)，圖形穩定后，開始電刺激，紀錄第1次誘發心室顫動的電壓值，作為心室顫動閾值。

1.4.5 心臟組織病理學改變 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心臟組織病理學改變。

1.4.6 免疫組織化學染色檢測相關蛋白表達 給藥4周后，麻醉大鼠并取心臟，心臟組織經過固定、脫水、透明、石蠟包埋后制成石蠟切片，并行免疫組織化學染色。參照試劑盒說明書，烤片1 h，脫蠟水化后，進行抗原修復，阻斷劑室溫孵育10 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后加入山羊血清封閉，之后加入一抗，一抗稀釋比例分別為LC3(1∶800)、Beclin1(1∶200)、CX43(1∶200)，4 ℃孵育過夜。DAB顯色，陽性表達呈棕色，采用Image J軟件分析LC3、Beclin1、CX43蛋白表達的平均光密度值(average optical density，AOD)。

1.4.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測相關蛋白表達 每組選取6只大鼠，取出各組大鼠心室梗死邊緣區組織20 mg，按照1∶10的比例加入RIPA裂解液200 μL，充分超聲勻漿，靜置20 min后，低溫離心移取上清，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將各組蛋白調整至4 μg/μL，置于-20 ℃凍存，在半月內檢測完畢。進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳的上樣體積為每組10 μL，200 mA恒流將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉1 h， 緩沖液洗膜后加入稀釋好的一抗，4 ℃過夜孵育。一抗稀釋比例GAPDH、CX43、LC3、P62、Beclin1分別為1∶20 000，1∶8 000，1∶1 500，1∶5 000，1∶5 000。二抗室溫孵育1 h，洗膜后進行化學發光顯影。使用Image J進行分析蛋白條帶，計算出CX43、LC3、P62、Beclin1蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠超聲心動圖指標比較 與正常組比較，模型組大鼠LVAWs、LVAWd、LVEF降低，LVIDs、LVIDd升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，穩心顆粒低劑量組、穩心顆粒高劑量組、美托洛爾組LVAWs、LVAWd、LVEF升高，LVIDs、LVIDd降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠超聲心動圖指標比較(±s)

2.2 各組大鼠心室顫動閾值比較 模型組大鼠心室顫動閾值明顯低于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，穩心顆粒低劑量組、穩心顆粒高劑量組、美托洛爾組心室顫動閾值增高，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠心室顫動閾值比較(±s) 單位：V

2.3 各組大鼠心臟組織病理學改變比較 HE染色顯示，正常組大鼠心肌纖維呈長條狀排列整齊有序，心肌細胞結構清晰完整，細胞質均勻紅染，細胞核形態正常。模型組大鼠心肌纖維呈波浪狀或斷裂溶解，心肌細胞排列紊亂，結構模糊不清，細胞核固縮，形態異常；與模型組比較，穩心顆粒低劑量組、穩心顆粒高劑量組、美托洛爾組心肌細胞結構明顯改善，病理改變明顯減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變HE染色圖( ×400)

2.4 各組大鼠心肌LC3、Beclin1、CX43蛋白表達比較 與正常組比較，模型組LC3、Beclin1蛋白AOD明顯增加，CX43蛋白AOD明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，穩心顆粒高劑量組、美托洛爾組自噬正相關蛋白LC3、Beclinn1 AOD均明顯降低，CX43蛋白AOD增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。正常組CX43陽性表達主要分布在心肌細胞間閏盤處，呈線狀排列整齊；模型組CX43表達明顯減少，呈點狀分布紊亂。詳見表3、圖2。

表3 穩心顆粒對大鼠心肌LC3、Beclin1、CX43蛋白表達的AOD比較(±s)

圖2 各組自噬相關蛋白及CX43表達及分布情況(免疫組織化學染色，×400)

2.5 各組大鼠心肌細胞自噬相關蛋白及縫隙連接蛋白表達比較 與正常組比較，模型組自噬正相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達增加，自噬負相關蛋白P62及CX43蛋白表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，穩心顆粒低劑量組Beclin1蛋白表達明顯減少，P62蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，穩心顆粒高劑量組及美托洛爾組LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達明顯降低，P62及CX43蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 Western Blot法檢測各組大鼠自噬相關蛋白及CX43蛋白表達條帶圖

模型組與正常組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

3 討 論

冠心病在心血管疾病的臨床死亡原因中居首位，而心肌梗死又是冠心病中的一種嚴重疾病類型，由于心肌血液供應減少，心肌細胞缺血缺氧壞死，心肌功能受損，心肌正常收縮及舒張功能喪失，心搏出量降低，誘發心源性猝死[12]。心臟中CX43半衰期較短，一般為1～3 h，主要位于心肌細胞閏盤處，CX43的磷酸化、數量和分布的病理性改變可使心臟電傳導障礙，最終發生心律失常[13]。

基礎水平的自噬在缺血性心肌病、心力衰竭和心肌肥厚期間可明顯上調，保護心臟，然而過度激活的自噬則可導致大量細胞器的降解和細胞死亡[14]。臨床觀察到在心肌梗死病人的壞死心肌組織中，自噬正相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達有所增加，表明在心肌梗死的發生發展進程中，自噬可能被激活[15]。自噬參與縫隙連接蛋白的降解，一方面可以為心肌細胞內縫隙連接蛋白的更新提供基礎，另一方面則成為心血管疾病的內在發病機制[16]。超微結構在自噬體內部觀察到球狀縫隙鏈接體，自噬相關基因(如LC3、P62、Atg6)的遺傳沉默導致環狀縫隙鏈接的積累和LC3與CX43的共定位減少[17]。因此，推測心肌梗死后心律失常病理條件下，縫隙連接蛋白表達的變化與心肌細胞自噬水平相關。

中藥穩心顆粒由黃精、三七、黨參、琥珀、甘松5味中藥組成，循證研究發現穩心顆粒對于多種病因引起的心律失常均有明顯的治療效果，能快速緩解癥狀，改善病人生活質量[18]。穩心顆?？烧{控CX43的表達分布，改善心律失常[7]。探索穩心顆粒改善縫隙連接蛋白表達與自噬水平的變化，有助于為心肌梗死后心律失常的治療提供新的方向。

本研究結果顯示，建立模型4周后，模型組大鼠左心室前壁變薄，室內徑增大，左室射血分數明顯降低，心臟結構和功能改變，心肌細胞形態紊亂，以上病理改變為心肌梗死后心律失常的發生提供了條件；此外，本研究還觀察到心肌組織CX43表達及分布的異常，與心肌梗死后大鼠發生心律失常的結局直接相關。已有研究證實，心肌梗死后心肌細胞CX43分布以及表達量的異常，使得由縫隙連接蛋白構成的縫隙連接通道關閉，導致心肌電傳導障礙從而誘發心律失常[19]，這與本研究中模型組大鼠心室顫動閾值明顯降低、心律失常易感性明顯增加的實驗結果相一致。

本研究進一步深入觀察發現，心肌梗死病理條件下，LC3、Beclin1明顯增加，P62明顯減少；LC3是自噬標志蛋白，其C端被半胱氨酸蛋白酶ATG4B切割后形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE)結合形成LC3Ⅱ，參與自噬體膜的延伸，因此，LC3Ⅱ表達量增加時，表明自噬被激活；Beclin1作為自噬特異性蛋白，可調節自噬體形成，Beclin1基因活性的明顯上調表明自噬激活；P62是一種具有多種結構域的自噬底物蛋白，通過其C端的LC3互相作用區(LIR)與LC3結合，聚集待降解的蛋白，在蛋白積累過程中，P62表達增加，隨著自噬溶酶體酶解反應的開始，P62表達降低[20-22]。以上結果表明心肌梗死后4周模型組大鼠心臟自噬水平過度激活。而自噬參與了縫隙連接蛋白的降解過程[23]。因此，本研究推測心肌梗死后自噬的過度激活介導了CX43經自噬途徑降解的增加，這是導致心肌梗死后心律失常不容忽視的潛在機制。而穩心顆粒治療4周后，與模型組比較，心臟結構和功能得到明顯改善，心律失常易感性降低，心肌過度自噬得以減輕，CX43表達在一定程度上恢復，這是穩心顆粒防治心肌梗死后心律失常的新機制。

綜上所述，穩心顆?？梢哉{節梗死心肌細胞過度激活的自噬水平，保護CX43表達，預防心肌梗死后心律失常的發生，為臨床應用穩心顆粒防治心肌梗死后心律失常提供實驗證據。