主要農作物種子中轉基因成分篩查策略

張海波 陳 西 楊娟妮 劉 冰 張 田 周 波 陳國瑛 張 英

（陜西省種子工作總站，西安 710018）

農作物種子的選育，分為自然留種、遺傳育種和分子育種等幾個階段，目前農作物種子主要通過遺傳育種的方式選育。轉基因技術作為新型分子育種技術，為農作物的遺傳改良提供了廣闊的前景[1-2]。全球轉基因作物的商業化種植面積，在2019 年已經達到了1.904 億hm2，1996-2019 年轉基因作物的累計種植面積已經達到27 億hm2[3]。

我國農作物種子市場巨大，為使種子質量逐年提高，種子監管必不可少。農作物種子的監管包括實驗室研究、品種審定、企業加工、市場營銷、種植和進出口等環節，通過這些環節的監管，產生的轉基因檢測樣品非常多。為了提高檢測效率、降低檢測成本，急需科學高效的轉基因篩查檢測方法，為轉基因成分的政府監管提供有力的技術支撐。

目前轉基因成分分子檢測方法有蛋白質檢測和核酸檢測兩大類。以PCR技術為基礎的轉基因產品檢測根據其特異性的不同可以分成3 類，包括篩查檢測法（Screening PCR）、基因特異性檢測法（Gene-specific PCR）和轉化體特異性檢測法（Event-specific PCR）[4]。篩查法是針對轉基因產品中通用元件的檢測，包括啟動子、終止子或標記基因等元件，如CaMV 35S啟動子、NOS終止子等。該方法的原理是，首先統計分析已經商業化的轉基因作物的轉化體外源基因和元件插入序列情況[4]，其次是選擇使用頻率高并且可以覆蓋全部已知轉基因轉化體的最少數外源元件作為檢測對象。有其中的任何一個元件檢出為陽性，則表明該樣品中可能含有轉基因成分。若檢測的每個元件的結果都為陰性，則說明該樣品中未檢出已知商業化的轉基因作物的成分[4]。不同農作物的商業化轉化體不同，其所用基因元件的種類和頻次也不同，每個作物需根據具體轉化體的情況，采取不同的篩查策略進行篩查檢測[5]。本文以我國五大主要農作物玉米、水稻、小麥、大豆和棉花為研究對象，對主要農作物的轉基因篩查方法進行了分析研究。

1 玉米種子中轉基因成分篩查策略

1.1 玉米的轉基因作物研發推廣情況玉米屬于禾本科玉米屬，起源于中南美洲熱帶和亞熱帶高原地區，在我國已有400 多年的種植歷史。玉米的商業化轉基因玉米轉化體有27 個，主要分抗蟲和耐除草劑兩種類型。我國目前頒發了部分轉基因玉米的安全證書，但是未批準轉基因玉米商業化種植。進口的國外轉基因玉米也只能用作加工原料。截至2021 年底，獲準作為加工原料進口到中國的轉基因玉米轉化體有15 個，分別是1 個耐旱玉米MON87460，1 個品種改良玉米Event 3272，3 個耐除草劑玉米GA21、T25、NK603，6 個抗蟲耐除草劑玉米TC1507、Bt11、Bt176、MON88017、59122、Bt11×GA21，4 個抗 蟲 玉米MIR604、MON89034、MIR162、MON810[6-7]。轉基因玉米的研究方向有抗蟲、耐除草劑、營養高效、高產等優良性狀的研究。

1.2 玉米的轉基因轉化體分析玉米有27 個轉基因轉化體，多樣的轉基因轉化體增加了對玉米中轉基因成分篩查的難度。根據轉基因檢測數據庫（GMDD，http：//gmdd.shgmo.org/，下同）[6]、歐洲轉基因生物指南（http：//www.gmo-compass.org/eng/gmo/db，下同）[7]和美國環境風險評估中心轉基因作物數據庫（CERA，http：//www.cera-gmc.org/，下同）[8]，以轉基因玉米商業化的轉化體作為行，以基因元件作為列，構建玉米轉基因轉化體信息和分子特征矩陣（表1）。在表1 中的27 個玉米轉化體中，出現頻次最高的元件是CaMV 35S啟動子，出現23次；其次是NOS終止子，17 次；之后是Bar基因和CP4-EPSPS基因，各7 次；pat基因出現5 次；FMV 35S啟動子1 次[9]。

表1 玉米轉基因轉化體信息和分子特征矩陣

1.3 玉米的轉基因篩查策略在表1 的27 個玉米轉化體中，有23 個轉化體含有CaMV 35S啟動子。不含有CaMV35S啟動子的4 個轉化體中都含有NOS終止子。這說明，同時進行CaMV 35S啟動子和NOS終止子檢測，可以覆蓋所有的27 個玉米轉化體。用這兩個元件對27 個轉化體進行分類，同時含有CaMV 35S啟動子和NOS終止子的轉化體有13 個，只含有CaMV 35S啟動子的轉化體有10 個，只含有NOS終止子的轉化體有4 個。因此，聯合使用CaMV 35S啟動子和NOS終止子，可實現對玉米種子轉基因成分的篩查檢測。

1.4 玉米的轉基因成分檢測路線圖在對大量玉米樣品進行轉基因檢測時，首先聯合使用CaMV 35S啟動子和NOS終止子進行篩查，然后根據篩查結果，按照圖1 進行轉化體的進一步分析和確定。圖1 中鏤空箭頭表示篩選的路線，實線箭頭表示對應的篩選元件檢出，虛線箭頭表示對應的篩選元件未檢出。如果CaMV 35S啟動子和NOS終止子的檢測結果都為陰性，則認為樣品中未檢出轉基因成分。如果CaMV 35S啟動子和NOS終止子的檢測結果任何一個為陽性，則認為樣品中檢出轉基因成分。對于篩查出陽性的樣品，需要繼續進行其他元件的篩查，如Bar基因、CP4-EPSPS基因、pat基因、FMV 35S啟動子，或者直接使用轉化體特異性檢測方法進行確認。

圖1 玉米轉基因轉化體篩查路線

2 大豆種子中轉基因成分篩查策略

2.1 大豆的轉基因作物研發推廣情況大豆是豆科大豆屬一年生草本植物，在我國已有5000 多年的種植歷史，目前全國分為5 個大豆主產區。轉基因大豆主要種植在美國、阿根廷、巴西等美洲國家，以耐除草劑大豆為主[3]。我國目前批準了轉基因大豆的安全證書，但是沒有批準轉基因大豆的商業化種植。進口的國外轉基因大豆只能用作加工原料。截至2022 年底，中國批準的可以作為加工原料進口轉基因大豆轉化體共11 個，分別為1 個抗蟲耐除草劑大豆MON87701×MON89788，6 個耐除草劑大豆GTS40-3-2、A2704-12、CV127、A5547-127、MON87708、MON89788，1 個抗蟲大豆MON87701，2 個品質改良大豆MON87769、305423 和1 個品質改良耐除草劑大豆305423×GTS40-3-2[6-7]。轉基因大豆的主要研發方向為耐除草劑、抗蟲、抗病、品質改良等優良性狀的研究。

2.2 大豆轉基因轉化體的分析根據劉冰等[10]檢索轉基因網絡數據庫，構建的大豆轉基因轉化體信息和分子特征矩陣（表2）可以看出，表中列出的15個大豆商業化轉基因轉化體中，pat基因出現的頻次最高，共計7 次；花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子出現了6 次；然后是CP4-EPSPS基因、Bt基因、NOS終止子和FMV 35S啟動子，分別是4 次、3 次、2 次和2 次。

2.3 大豆的轉基因篩查策略大豆商業化轉化體中，pat基因、花椰菜花葉病毒的CaMV 35S啟動子、CP4-EPSPS基因、Bt抗蟲基因4 個靶標元件組合使用，可以實現對表2 中的已知12 個大豆轉化體的轉基因篩查檢測。其他3 個轉化體DP-305423、DP356043 和BPS-CV127-9，可使用專門的轉化體特異性檢測方法進行單獨檢測。

表2 大豆轉基因轉化體信息和分子特征矩陣[10]

2.4 大豆的轉基因成分檢測路線圖在對大量大豆樣品進行轉基因檢測時，按照CaMV 35S啟動子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和轉化體特異性檢測的順序進行篩查，如圖2 所示。如果CaMV 35S啟動子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和轉化體特異性檢測結果都為陰性，則認為樣品中未檢出轉基因成分。如果CaMV 35S啟動子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和轉化體特異性檢測結果任何一個為陽性，則認為樣品中檢出轉基因成分[10]。

3 水稻種子中轉基因成分篩查策略

3.1 水稻的轉基因作物研發推廣情況水稻是禾本科稻屬一年生栽培作物，在我國有悠久的種植歷史，主要種類有秈稻和粳稻兩種。美國最早在2009年批準耐除草劑轉基因水稻的商業化種植。我國在2009 年批準了2 種抗蟲轉基因水稻生產應用安全證書，但目前并沒有商業化種植。轉cry1Ab、cry1Ac抗蟲基因水稻華恢1 號及其Bt 汕優63 雜交種，是抗鱗翅目害蟲的轉基因水稻品系，外源基因表達產物可以控制二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲，減少殺蟲劑的使用。富含β-胡蘿卜素的轉基因黃金大米是一種品質改良水稻，β-胡蘿卜素可在人體內轉化為維生素A，補充體內缺乏的維生素A，從而減少貧困地區兒童夜盲癥和失明的發病率。目前轉基因水稻的研究方向是抗病、抗蟲、耐除草劑等的研究。

3.2 水稻轉基因轉化體分析和篩查策略目前已知的水稻轉化體包括轉cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻華恢1 號、Bt 汕優63，轉pat基因耐除草劑水稻LLRICE601、LLRICE06，代謝途徑調節的轉基因黃金大米轉入的基因包括psy基因、SSUcrtI基因和hpt基因。根據轉基因檢測數據庫[6]、歐洲轉基因生物指南[7]和美國環境風險評估中心轉基因作物數據庫[8]，抗蟲水稻Bt 汕優63 和除草劑水稻LLRICE601、LLRICE06 都使用了CaMV 35S啟動子，而抗蟲水稻華恢1 號和Bt 汕優63、耐除草劑水稻LLRICE601、轉基因黃金大米都使用了NOS終止子。由此看出，合并使用花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子和NOS終止子，可實現對水稻中已知的轉化體進行篩查檢測。為了防止研發階段或未公開的水稻轉化體非法擴散，可對水稻種子同時聯合cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因進行篩查。

3.3 水稻轉基因成分檢測路線圖在對大量水稻樣品進行轉基因檢測時，按照CaMV 35S啟動子、NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因進行篩查，然后根據篩查結果，按照圖3 進行轉化體的進一步分析和確定。如果CaMV 35S啟動子、NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因和pat基因等元件的檢測結果都為陰性，則表明樣品中未檢出已知的轉基因轉化體。如果CaMV 35S啟動子、cry1Ab/cry1Ac基因、NOS終止子和pat基因等元件的檢測結果任何一個為陽性，則認為樣品中檢出轉基因成分。

圖3 水稻轉基因轉化體篩查路線

如果檢出CaMV 35S啟動子、NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因，可能含有華恢1 號轉化體；檢出NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因，則可能含有Bt 汕優63 轉化體；檢出CaMV 35S啟動子、NOS終止子、pat基因，可能含有LLRICE601轉化體；檢出CaMV 35S啟動子、pat基因，可能含有LLRICE06 轉化體；只檢出NOS終止子，可能含有黃金大米轉化體；檢出CaMV 35S 啟動子、NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因中任一個，而未檢出上述轉化體，則可能含有研發階段或未公開的水稻轉化體。

4 棉花種子中轉基因成分篩查策略

4.1 棉花的轉基因作物研發推廣情況棉花為錦葵科棉屬一年生雙子葉植物。全球轉基因棉花的種植面積僅次于大豆和玉米，位列第三，主要種植在美國、阿根廷、巴西等國。我國2015 年轉基因抗蟲棉種植面積為333.3 萬hm2（5000 萬畝），占全國棉田面積的93%，其中國產抗蟲棉占95%以上。我國仍是全球最大的棉花進口國，截至2022 年底，獲準作為加工原料進口到中國的轉基因棉花轉化體有11 個，分別為5 個抗蟲棉花15985、COT102、531、DAS-24236-5 和DAS-21023-5，4 個抗除草劑棉花LLCotton25、GHB614、MON88913 和1445，2 個 抗蟲耐除草劑棉花GHB119 和T304-40。目前轉基因棉花的研究方向是抗病蟲、抗旱、耐除草劑、耐鹽堿和品質改良等優良性狀的研究。

4.2 棉花的轉基因轉化體分析根據轉基因檢測數據庫[6]、歐洲轉基因生物指南[7]和美國環境風險評估中心轉基因作物數據庫[8]，以轉基因棉花轉化體為行，以常用基因元件為列，形成轉基因棉花轉化體信息和分子特征矩陣（表3）。在表3 中的13 個棉花轉化體中，出現頻次最高的元件是CaMV 35S啟動子，出現10 次；其次是NOS終止子，出現9 次；之后是Bt基因6 次；Bar基因和CP4-EPSPS基因3 次；FMV 35S啟動子2 次。

4.3 棉花的轉基因篩查策略在表3 的13 個棉花轉化體中，有10 個轉化體含有CaMV 35S啟動子。不含有CaMV35S啟動子的3 個轉化體中有2個含有NOS終止子（COT102和COT67B），1 個含有CP4-EPSPS基因（GHB614）。這說明，同時進行CaMV 35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS基因檢測，可以覆蓋所有的13 個棉花轉化體。

表3 棉花轉基因轉化體信息和分子特征矩陣

由于我國批準的轉基因安全評價證書中棉花作物都是轉cry1Ab/cry1Ac基因或轉cry1Ac基因抗蟲棉，因此，使用Bt基因可實現對國內棉花的高效率篩查。考慮到以上兩點，同時進行CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bt基因檢測，可以覆蓋國內外所有的棉花轉化體。

4.4 棉花的轉基因成分檢測路線圖在對大量棉花樣品進行轉基因檢測時，按照CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bt基因的順序進行篩查，如圖4 所示。如果CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bt基因檢測結果都為陰性，則認為樣品中未檢出轉基因成分。如果CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bt基因檢測結果任何一個為陽性，則認為樣品中檢出轉基因成分。

圖4 棉花轉基因轉化體篩查路線

5 小麥種子中轉基因成分篩查策略

5.1 小麥的轉基因作物研發推廣情況小麥是禾本科單子葉植物，起源于亞洲西部。美國2004 年批準了耐除草劑轉基因小麥MON71800 的商業化種植[6]，但截至目前種植面積很小。我國的轉基因小麥處于研發階段，目前沒有批準任何轉基因小麥的安全評價證書。目前轉基因小麥的研究方向是抗病、抗旱、耐除草劑和氮高效利用等優良性狀的研究。

5.2 小麥的轉基因轉化體分析和篩查策略小麥是我國北方的主糧，我國目前沒有批準轉基因小麥的安全證書和商業化種植。針對小麥轉基因的監管，其重點一是防止實驗室進行試驗研究的轉基因小麥違規擴散，二是防止進口小麥中混雜的轉基因小麥。轉基因耐除草劑小麥MON71800 轉入的基因有CaMV 35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS基因，而Bar基因也是耐除草劑小麥研發中經常使用的基因元件。因此，聯合使用CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bar基因，可實現對轉基因小麥種子的篩查。

6 總結

我國轉基因作物的發展方針為大膽研究，慎重推廣，目前只批準了棉花和木瓜的商業化種植。我國將按照非食用、間接食用、食用的路線圖推進轉基因作物的產業化。轉基因產業化在我國將成為趨勢。

隨著我國轉基因產業的逐步發展以及消費者對轉基因食品的持續關注，農作物種子的監管將有效遏制違規轉基因進入消費市場。因此，建立快速、準確、低成本的轉基因成分篩查檢測方法，能夠為我國轉基因監管提供有力的技術支撐。本研究針對我國主要農作物種子的轉基因成分檢測，提出了快速、準確和低成本的篩查方法，可實現對5 種主要農作物種子的大量樣品進行低成本、高效率的轉基因成分篩查檢測。