水稻種子活力性狀全基因組關聯分析研究進展

楊 彬，周嘉潤，沈玉婷，孫曼嘉，呂 凡，黃偉聰，鄭奕雄，萬小榮

(仲愷農業工程學院/廣州市特色作物種質資源研究與利用重點實驗室，廣東廣州 510225)

水稻直播栽培技術因其具有節省勞力、成本低和易于規模化等優點，近年來在我國得到大量的推廣[1]。然而，直播稻生產上常面臨種子發芽或成苗不整齊、幼苗長勢差等問題，嚴重影響了水稻產量和品質[2]。種子是農業最基本也是最關鍵的生產資料，高質量種子對于保障糧食生產尤為重要[1]。種子活力是評鑒種子質量的重要指標之一[1-2]。種子活力是指種子在田間條件下具備快速萌發、整齊發芽及發育成健壯幼苗的潛力[3-4]。水稻直播栽培技術對種子活力這一重要播種性狀具有較高的要求，需要選用在不同脅迫條件下仍具有高種子活力的水稻品種[5]。因此，挖掘種子活力相關基因并解析其遺傳調控機制，對今后選育適合直播的高活力水稻品種具有重要意義。

1 水稻種子活力的衡量指標

通過查閱相關文獻，水稻種子活力常用的評價標準包括種子萌發期相關性狀、幼苗早期生長相關性狀、逆境抗性相關性狀及生理生化相關性狀等4類。研究人員通過鑒定得以上指標，基于連鎖分析的方法鑒定到大量的水稻種子活力相關數量性狀基因座(quantitative trait loci，QTLs)。

1.1 種子萌發期相關性狀

種子萌發期相關性狀包括發芽率、發芽指數、活力指數、成苗率、胚根長及胚芽長等。例如，Wang等以粳稻大關稻、秈稻IR28及其構建的150個重組自交系(recombinant inbred lines，RILs)為試驗材料，通過鑒定萌發3 d的發芽率和發芽指數等指標，定位到10個種子活力相關QTLs[6]；Liu等以粳稻韭菜青、秈稻IR26及其構建的150個RILs為試驗材料，分別在不同發育階段(抽穗后38、42 d)收獲種子，并鑒定種子在3 d的發芽率和發芽指數等指標，定位到33個種子活力相關QTLs[7]；Xie等以秈稻珍汕97、明恢63及其構建的120個RILs為試驗材料，通過鑒定萌發2 d和3 d的胚根長和胚芽長等指標，定位到8個種子活力相關QTLs[8]；Dimaano等以雜草稻WTR-1、秈稻Y-134及其構建的167個BC1F5群體為試驗材料，通過調查萌發2 d和7 d的發芽率等指標，定位到43個種子活力相關QTLs[9]。

1.2 幼苗早期生長相關性狀

幼苗早期生長相關性狀包括芽長、根長、苗長(高)、胚芽鞘長、中胚軸長、芽鮮/干質量、根鮮/干質量及苗鮮/干質量等。例如，Abe等以粳稻Kakehashi、Dunghan Shali及其構建的250個RILs為試驗材料，通過考察萌發14 d的苗高，檢測到4個幼苗活力相關QTLs[10]；Zhang等以秈稻93-11、PA64s及其構建的132個RILs為試驗材料，通過鑒定萌發15 d的芽長、根長、苗鮮質量和苗干質量等指標，定位到65個幼苗活力相關QTLs[11]；Singh等以秈稻Swarna、粳稻Moroberekan及其342個回交3代子3代(BC3F4)為試驗材料，通過鑒定8 d和20 d的苗高、根長、根鮮質量和芽鮮質量等指標，檢測到6個幼苗活力相關QTLs[12]；Xu等以秈稻CG133R、粳稻Javanica22及其構建的166個RILs為試驗材料，通過鑒定萌發5、10、15、20、25 d的苗高、根長、根鮮質量和芽鮮質量等指標，對多個幼苗活力連鎖的分子標記進行表型驗證與位點組合分析[13]。

1.3 逆境抗性相關性狀

逆境抗性相關性狀包括逆境條件下種子萌發期相關性狀、幼苗早期生長相關性狀及成活率等。例如，Wang等以粳稻韭菜青、秈稻IR26及其構建的150個RILs為試驗材料，通過鑒定鹽脅迫條件下 5 d 和10 d的發芽率等指標，定位到16個萌發期耐鹽相關QTLs[14]；Liu等利用秈稻GC2、粳稻IL112及其構建的F2∶3群體，通過鑒定低溫脅迫條件下幼苗的成活率，檢測到7個幼苗耐冷相關QTLs[15]；Jiang等以粳稻沈農625、麗江新團黑谷及其構建的144個RILs為試驗材料，通過鑒定低溫脅迫條件下6 d的發芽率，檢測到11個低溫發芽相關QTLs[16]；Najeeb等以雜草稻WTR-1、毫安弄及其構建的230個近交系(introgression lines，ILs)為試驗材料，通過鑒定低溫脅迫條件下2、4、6 d的發芽率及10、13、16 d 的根長和芽長等指標，定位到27個低溫發芽相關QTLs[17]；Jahan等以秈稻Basmati、Pokkali及其構建的129個F3為試驗材料，通過鑒定鋁脅迫條件下發芽率、發芽指數、根長、芽長及活力指數等指標，檢測到46個萌發期和幼苗期耐鋁相關QTLs[18]。

1.4 生理生化相關性狀

生理生化相關性狀包括α-淀粉酶活性、還原糖含量、根系活力和葉綠素含量等。例如，Cui等以秈稻珍汕97、明恢63及其構建的241個RILs為試驗材料，通過測定α-淀粉酶活性、還原糖含量和根系活力等指標，定位到14個幼苗活力相關QTLs[19]；同時，崔克輝等利用上述同一套材料測定了葉綠素a含量和總葉綠素含量，定位到3個幼苗活力相關QTLs[20]。

2 GWAS研究概述

全基因組關聯分析(genome-wide association study，GWAS)是近些年用于解析動植物復雜數量性狀的一種常見方法。GWAS是基于海量的單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphisms，SNPs)標記，以連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)為基礎，在全基因組范圍內系統地研究群體特定性狀與SNPs之間關聯的手段[21]。

2.1 GWAS研究的優點

相較于傳統的連鎖分析，GWAS具有諸多優勢[22-23]。第一，連鎖定位需要通過雙親進行多代雜交構建出分離群體，研究的時間和人力成本高，而GWAS所利用的自然變異群體，研究周期大幅度降低；第二，連鎖定位所用的分子標記在全基因組范圍內密度小、分辨率低，初定位檢測出的QTLs區間較大，而基于高密度SNPs的GWAS能快速實現精細定位；第三，連鎖分析只能檢測到每個基因座上最多的2個等位變異類型，而GWAS能鑒定到群體內同一位點上所有的等位變異類型[24]。

2.2 GWAS研究的技術路線

GWAS研究的流程一般包括下述6個步驟[25]。(1)關聯群體種質資源收集：選擇的群體需具備一定的數量，具有廣泛的遺傳多樣性，這對后續的關聯位點檢測至關重要；(2)關聯群體SNPs分型：SNPs是在動植物基因組上廣泛存在的遺傳變異，是GWAS研究中最常使用的分子標記，一般利用基因芯片技術和重測序技術對關聯群體SNPs進行分型；(3)群體結構及親緣關系評價：由于關聯群體內可能含有多個亞群，亞群間的等位基因型頻率存在差異，可能會導致后續的GWAS出現假陽性位點，通過群體結構及親緣關系分析可降低假陽性率；(4)GWAS：結合基因型數據和表型數據，選擇合適的關聯分析模型，如一般線性模型(general linear model，GLM)、混合線性模型(mixed linear model，MLM)等進行GWAS，檢測顯著關聯位點；(5)顯著關聯位點的候選基因篩選：根據LD衰減距離，劃定顯著關聯位點的候選基因所在基因組區域，進一步利用基因注釋、同源基因分析、轉錄組學相關表達譜數據和單倍型分析篩選獲得關鍵候選基因；(6)基因功能驗證：利用構建的基因過表達轉基因株系、基因干涉轉基因株系、基因點突變株系和差異單倍型轉基因回補株系對關鍵候選基因進行功能驗證。

3 水稻種子活力GWAS研究進展

近年來，隨著基因組測序技術的更新迭代，測序成本逐漸降低，GWAS廣泛應用于解析水稻表型多樣性遺傳變異基礎。目前，GWAS已在水稻種子活力相關基因的挖掘方面取得一定的研究進展。

3.1 種子萌發期相關性狀和幼苗早期生長相關性狀GWAS

Wang等通過鑒定307個水稻品種第14天的側根數、根長和芽長等性狀，利用GWAS檢測到6個顯著關聯位點，并通過基因表達分析和測序比較分析對位于11號染色體上的位點qTIPS-11進行候選基因篩選，明確1個編碼糖基水解酶的基因為該位點的關鍵候選基因，命名為Tips-11-9；進一步利用轉移DNA(T-DNA)插入突變體進行驗證，發現Tips-11-9突變體的根系活力顯著低于野生型[26]。Guo等通過鑒定200個水稻品種萌發2 d的發芽率及7 d的發芽率、發芽指數及活力指數等性狀，利用GWAS檢測到19個顯著關聯位點，其中有6個位點與前人報道的種子活力相關QTLs共定位；此外該研究以粳稻02428和秈稻YZX構建的192個RILs為試驗材料，通過鑒定上述4個性狀，利用連鎖分析定位到12個QTLs，其中有7個位點與前人報道的種子活力相關QTLs共定位；比較發現，有6個位點在GWAS和連鎖分析共定位；結合種子萌發期轉錄組數據，進一步篩選獲得7個關鍵候選基因Os06g0108600、Os06g0110200、Os06g0253100、Os06g0282000、Os07g0583600、Os07g0592600和Os09g0432300[27]。Zhao等通過對178個水稻品種的根長進行表型鑒定，利用GWAS在3、6、7、11號染色體上檢測得到qRL3、qRL6、qRL7和qRL11等4個位點，其中有2個位點與前人報道的根系活力相關QTLs共定位；通過轉錄組分析、單倍型分析及基因表達分析進一步對其中一個主效位點qRL11進行候選基因篩選，確定1個編碼吲哚乙酸糖基轉移酶的基因(OsIAGLU)為該位點的關鍵候選基因；基因功能分析研究發現，OsIAGLU通過調控生長素、茉莉酸、脫落酸和細胞分裂素等多種激素水平來控制水稻根系生長[28]。Li等通過對174個水稻品種3 d的發芽率進行鑒定，利用GWAS在3、8、11號染色體上檢測到qGR3.1、qGR3.2、qGR8和qGR11等4個位點，這些位點均與前人報道的種子活力相關QTLs共定位；通過轉錄組分析和單倍型分析進一步對其中一個主效位點qGR11進行候選基因篩選，確定1個編碼2-酮戊二酸/蘋果酸轉運蛋白的基因(OsOMT)為該位點的關鍵候選基因；基因功能分析研究發現，OsOMT通過調控氨基酸水平、糖酵解代謝和三羧酸(TCA)循環來控制水稻種子活力[29]。Menard等通過檢測684個水稻品種在室內環境下 5 d 的芽長、根長、根表面積、中胚軸長和胚芽鞘長和在田間環境下不同播種深度(4、8、10 cm)下30 d的中胚軸長、幼苗出苗率、地上部干質量、根干質量和側根數等活力相關性狀，利用GWAS檢測到超過 1 000 個顯著關聯的SNPs；比較發現，在7號染色體的短臂上存在1個主效位點，該位點在中胚軸長、出苗率和地上部干質量等3個性狀中共定位[30]。Yuan等通過對貯藏不同時間的252個水稻品種的發芽率進行鑒定，利用GWAS在1號和9號染色體上檢測到3個顯著關聯位點，同時結合粳稻日本晴和秈稻9311構建的染色體片段置換系對位于1號染色體上的位點進行精細定位，確定該位點的候選基因為OsGH3-2，該基因編碼1個吲哚乙酸氨基化合成酶；基因功能研究發現，該基因通過調控脫落酸通路和胚胎晚期富集蛋白來控制水稻種子老化[31]。Yang等在2年環境下通過對263個水稻品種萌發3、5、7 d 的發芽率和發芽指數進行表型分析，利用GWAS定位到19個種子萌發相關QTLs，其中有14個QTLs與前人報道的種子活力相關QTLs共定位，有11個QTLs位于選擇消除區域；利用種子萌發期轉錄組和功能SNPs位點分析進一步對其中一個穩定表達的位點qSG11.1進行候選基因篩選，確定1個編碼丙酮酸激酶基因OsPK5為該位點的關鍵候選基因；基因功能分析研究發現，OsPK5通過參與調節赤霉素、脫落酸及糖酵解代謝等通路來控制水稻種子萌發[32]。Peng等通過對202個水稻品種的成苗率進行鑒定，利用GWAS檢測1個位于3號染色體的顯著關聯位點qSP3，該位點的峰值SNP位于一個編碼含Cupin結構域蛋白基因OsCDP3.10的編碼區內；基因功能研究發現，該基因通過影響甲硫氨酸、谷氨酸、組氨酸和酪氨酸等氨基酸水平及過氧化氫含量來調控種子活力[33]。Sun等鑒定了510個水稻品種的中胚軸長度，利用GWAS在5號染色體上檢測到1個與中胚軸長度顯著關聯的位點，并在峰值SNP附近發現1個參與油菜素內酯信號通路的基因OsGSK3，該基因編碼1個類 GSK3/SHAGGY 蛋白激酶；基因自然變異分析發現，OsGSK3基因編碼區的錯義SNP與OsGSK3激酶活性存在關聯；分子試驗證明了油菜素內酯通過抑制OsGSK3對細胞周期蛋白CYC U2的磷酸化來促進水稻中胚軸的伸長，而獨腳金內酯信號通路相關基因SLs/D3通過降解磷酸化的CYC U2來抑制中胚軸的伸長[34]。

3.2 種子萌發期和成苗期逆境抗性相關性狀GWAS

Wang等通過對137個水稻品種的低溫發芽力進行鑒定，利用GWAS分別在10號和11號染色體上獲得48、55個低溫發芽候選基因；進一步通過基因注釋、序列比較分析和單倍型分析證實了2個關鍵候選基因(Os10g0371100和Os11g0104240)可能與低溫發芽力相關聯[35]。Wang等通過對187個水稻品種的低溫發芽力進行鑒定，利用GWAS共檢測到53個低溫發芽相關QTLs，其中有20個QTLs 與前人報道的位點共定位；進一步對一個編碼A20/AN1型鋅指蛋白(脅迫相關蛋白)的候選基因OsSAP16進行功能驗證發現，在低溫環境下該基因功能的缺失降低了水稻種子的萌發，而過量表達則增強了種子的萌發；基因表達分析發現，極端材料中OsSAP16的表達水平在低溫條件下存在顯著差異[36]。Yang等對375個水稻品種的低溫發芽力進行鑒定，利用GWAS共檢測到11個低溫發芽相關QTLs；與前人報道的QTLs比較發現，有3個新的基因(QTLsqLTG_sRDP2-3/qLTG_JAP-3、qLTG_AUS-3和qLTG_sRDP2-12)在該研究中首次報道；位于10號染色體的QTLqLTG_sRDP2-10a貢獻率最高，并利用單片段代換系驗證了該QTLs的真實性；進一步通過基因表達分析和序列比對分析，預測了LOC_Os10g22520和LOC_Os10g22484可能為低溫發芽主效QTLqLTG_sRDP2-10a的關鍵候選基因[37]。Yang等對200個秈稻品種的低溫發芽力進行鑒定，利用GWAS共檢測到159個與低溫發芽顯著關聯的位點，分布在水稻12條染色體上；比較發現，有23個位點在不同環境下穩定表達，并預測到了569個與低溫發芽相關的候選基因，結合轉錄組測序分析篩選獲得179個關鍵候選基因；進一步利用20個極端材料對其中一個顯著關聯位點的序列分析發現，3個差異表達基因Os07g0585500、Os07g0585700和Os07g0585900的自然變異和低溫發芽表型相關聯[38]。Wang等對339個水稻品種芽期耐冷性狀進行鑒定，利用GWAS檢測到4個與芽期耐冷相關的顯著關聯位點，分布在水稻1、2、3號染色體上，其中qCTB-1-1與調控耐冷性狀miRNAOsa-miR319b共定位，而其他3個位點為新位點；進一步在qCTB-1-2位點篩選得到1個候選基因OsRab11C1，該基因編碼1個Rab蛋白；轉基因驗證發現，與野生型比較，突變OsRab11C1基因可以顯著提高水稻芽期耐冷性，而過表達OsRab11C1則顯著降低了芽期耐冷性；基因功能分析發現，OsRab11C1可能通過抑制脫落酸信號通路和脯氨酸合成來調控水稻芽期耐冷性[39]。Su等在無氧環境下對209個水稻品種的胚芽鞘長度和胚芽鞘直徑進行鑒定，利用GWAS檢測到26個顯著關聯的SNPs位點，其中5個位點與前人報道的位點共定位；進一步利用轉錄組測序技術篩選獲得4個關鍵候選基因，分別是Os01g0911700(OsVP1)、Os05g0560900(OsGA2ox8)、Os05g0562200(OsDi19-1)和Os06g0548200[40]。Shi等在鹽脅迫下對478個水稻品種的萌發期脅迫敏感指數進行鑒定，利用GWAS檢測到包含22個顯著SNPs的11個位點，其中位于1、5、6、11、12號染色體上的7個位點與前人報道的脅迫相關位點或基因共定位，例如高親和性硝酸鹽轉運蛋白OsNAR2.1和OsNRT2.2；單倍型分析鑒定到了OsNRT2.2稀有優異單倍型，且發現了該基因在水稻亞群存在分化[41]。Castano-Duque 等在旱季和雨季環境下分別對 1 500、2 700個水稻品種在無氧條件下的發芽率進行鑒定，利用GWAS鑒定到1個候選基因CLASSY1(OsCLSY1)，該基因參與了RNA介導的DNA甲基化途徑；在淹水條件下，突變體clsy1的苗高顯著高于野生型，表明在水稻發芽和幼苗建成階段，RNA介導的DNA甲基化途徑在響應淹水脅迫中至關重要[42]。

基于GWAS鑒定的水稻種子活力相關基因詳見表1。

表1 基于GWAS鑒定的水稻種子活力相關基因

4 研究展望

盡管現階段利用GWAS解析水稻種子活力相關性狀的自然變異取得了一定的進展，但還存在一定的局限性。第一，種子活力性狀受環境影響較大，很多研究并未在多年多個環境下進行種子活力檢測；第二，GWAS研究中獲得的位點可能出現假陽性，并未用其他技術手段對獲得的位點進行輔助驗證，比如可構建雙親群體進行連鎖分析，結合GWAS鑒定關鍵位點；第三，遺傳驗證缺少證據，GWAS研究中對候選基因進行驗證往往構建基因突變體株系、基因過量表達轉基因株系和基因干擾轉基因株系等，而未對差異單倍型進行遺傳回補驗證。

高活力的種子具有更高的生產潛力及生長優勢，對保障糧食高產、穩產和優質生產具有重要意義。因此，科研人員需要在現有基礎上進一步開展高活力水稻種質資源收集與鑒定、高活力優異等位變異挖掘與育種利用、種子活力相關基因定位及種子活力相關基因不同等位變異的功能解析，以期為未來培育高活力水稻新品種提供重要基礎。