連翹苷對(duì)體內(nèi)外鼻咽癌血管新生的影響

李紹霄， 李邦亮

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬平陽醫(yī)院耳鼻喉科，浙江溫州 325400；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬瑞安醫(yī)院耳鼻喉科，浙江溫州 325299）

鼻咽癌作為一種好發(fā)于我國南方、東南亞和北非地區(qū)的惡性腫瘤，近20%的鼻咽癌患者在確診時(shí)出現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移[1]。鼻咽癌血供豐富，其血管分布密度與鼻咽癌的多種惡性生物學(xué)行為相關(guān)，從而導(dǎo)致鼻咽癌患者的預(yù)后較差[2-3]。目前，已有諸多抗血管生成靶向藥物如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）單抗——貝伐珠單抗、重組人血管內(nèi)皮抑制素、抗血管生成蛋白——阿柏西普等應(yīng)用于鼻咽癌臨床化療，但鼻咽癌患者對(duì)此類靶向藥物多存在一定的毒性反應(yīng)和耐藥現(xiàn)象，鼻咽癌患者總體生存率提高緩慢[4-5]。

鼻咽癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“鼻淵”“真頭痛”“石上疽”等范疇，肺熱痰火及肝膽熱毒上擾為鼻咽癌發(fā)病主要原因。連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果實(shí)，味苦，性微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱功效，用于癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、溫?zé)崛霠I、高熱煩渴、神昏發(fā)斑、熱淋澀痛等病證。連翹苷作為中藥連翹中的標(biāo)識(shí)性成分，其分子結(jié)構(gòu)為木脂苷，分子式為C27H34O11，分子量為534，具有抗菌、抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)功效[6-8]。研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，連翹苷具有抗子宮癌、前列腺癌和肺癌的作用；但連翹苷抗鼻咽癌效應(yīng)尚不明確。本研究通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)觀察連翹苷對(duì)鼻咽癌的治療作用及機(jī)制，以進(jìn)一步探明連翹苷的抗腫瘤機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購自美國Sciencell 公司；人鼻咽正常上皮細(xì)胞系NP69和鼻咽癌細(xì)胞系HNE1和SUNE-1購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性BALB/c 裸鼠10 只，7 周齡，體質(zhì)量18 ～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0022，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42010200003257。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，恒溫（25±3）°C，60%濕度環(huán)境，光暗循環(huán)12 h/12 h，自由獲取食物和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬平陽醫(yī)院倫理委員會(huì)審核（編號(hào)：20210024）。

1.3 藥物、試劑與儀器 連翹苷（四川維克奇生物公司生產(chǎn)，批號(hào)：478-41-2）。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA，美國Sigma 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、含EDTA 胰蛋白酶和胎牛血清（杭州四季青公司）；Matrigel膠（美國BD公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）（上海 Biyuntian 公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、放射免疫分析沉淀（RIPA）裂解物試劑盒（北京中山生物工程有限公司）；兔抗血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）抗體、兔抗血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）抗體、兔抗Wnt 抗體、兔抗 β-catenin 抗體和兔抗 β-actin 抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國Abcam 公司）；CD34 抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CD34、VEGFA、Wnt免疫組織化學(xué)試劑盒及免疫組織化學(xué)二抗（上海雅吉生物科技有限公司）。MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司）；ECLIPSE Ts2 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國 Thermo 公司）；Transwell 小室（美國Corning 公司）；DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）；GelDocXR 型凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 體外實(shí)驗(yàn)

1.4.2 HUVECs、NP69、HNE1和SUNE-1的CCK-8實(shí)驗(yàn) 96孔板中每孔加入3×103個(gè)HNE1或SUNE-1細(xì)胞，96孔板中每孔加入5×103個(gè)HUVECs或NP69細(xì)胞，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L連翹苷作用24 h，對(duì)照組加入0 μmol/L連翹苷作用24 h。隨后每孔添加10 μL CCK-8 試劑，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.4.3 小管形成實(shí)驗(yàn) 將不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液和Matrigel 膠分別于4 ℃放置12 h，成膠凍狀后將 DMEM 培養(yǎng)液和 Matrigel 膠以 1∶2 的體積比例混合。24 孔板中每孔加入250 μL 混合后的Matrigel 膠，37 ℃放置 1 h 待 Matrigel 膠凝結(jié)成塊后，每孔加入0.1 mL密度為3×106個(gè)/mL的HUVECs懸液。將HUVECs 分為對(duì)照組、連翹苷組和聯(lián)合組。連翹苷組分別加入0.625、1.25、2.5 μmol/L連翹苷作用12 h，聯(lián)合組加入VEGFA 20 μg/L 聯(lián)合連翹苷 2.5 μmol/L 作用12 h，對(duì)照組加入0 μmol/L 連翹苷作用12 h。采用光學(xué)顯微鏡在200倍視野下觀察HUVECs小管形成狀況。

1.4.4 HUVECs細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 每個(gè)Transwell上室鋪有一層Matrigel 膠模擬體內(nèi)環(huán)境，收集HUVECs 懸液，經(jīng)冰PBS 緩沖液洗滌3 次，并將細(xì)胞懸液的密度調(diào)節(jié)至2×105個(gè)/mL。將20 μL 細(xì)胞懸液加至 Transwell 上室，再將 500 μL 的 DMEM 完全培養(yǎng)基加入Transwell 下室，將HUVECs 分為對(duì)照組、連翹苷組和聯(lián)合組。連翹苷組分別加入0.625、1.25、 2.5 μmol/L 連 翹 苷 ， 聯(lián) 合 組 加 入VEGFA 20 μg/L 聯(lián)合連翹苷 2.5 μmol/L，對(duì)照組加入 0 μmol/L 連翹苷。Transwell 小室置于 37 ℃中孵育過夜后加入1 ～2 滴結(jié)晶紫試劑，反應(yīng)15 min 后在光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移至Transwell 小室背側(cè)的細(xì)胞，在200倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的藍(lán)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HNE1、SUNE-1 細(xì)胞，HUVECs 中 Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2 通 路蛋白的表達(dá) 細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入0.625、1.2、2.5 μmol/L 連翹苷作用24 h，對(duì)照組加入0 μmol/L連翹苷作用24 h。采用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，總蛋白經(jīng)勻漿、離心、變性等操作后，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉進(jìn)行封閉操作。整體實(shí)驗(yàn)環(huán)境為4℃，維持12 h。硝酸纖維素膜經(jīng)過一抗（Wnt、β-catenin、VEGFA、VEGFR2均體積比1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，再經(jīng)二抗（體積比1∶15 000稀釋）室溫孵育1 h，100 g/L脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，利用顯影定影試劑盒完成最后的顯色和曝光操作。采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析各蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示。

1.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 建立鼻咽癌異種移植瘤模型 將HNE1 細(xì)胞（約2×106個(gè)）皮下接種到裸鼠右側(cè)腋下。注射腫瘤細(xì)胞8 d 后，腫瘤發(fā)展到大約100 mm3時(shí)，將小鼠分為2 組：對(duì)照組和連翹苷組，每組5 只。連翹苷組每周3 次（每周一、三、五）腹腔注射給藥，10 mg/kg，注射劑量為0.2 mL；對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。第30 天測(cè)定腫瘤質(zhì)量，然后收集腫瘤組織用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 SP免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)鼻咽腫瘤組織中CD34、VEGFA、Wnt 的表達(dá) 取腫瘤組織樣品用5%甲醛固定過夜，采用梯度乙醇脫水法將腫瘤組織脫水后石蠟包埋、切片。進(jìn)行SP 免疫組織化學(xué)染色，CD34 一抗（1∶500）、VEGFA 一抗（1∶1 000）和Wnt 一抗（1∶1 000）按不同體積比稀釋在37 ℃孵育60 min，HRP二抗（體積比1∶2 000稀釋）在37 ℃孵育30 min，蘇木素復(fù)染。CD34陽性少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，大部分表達(dá)于細(xì)胞膜中；VEGFA 和Wnt 陽性表達(dá)大部分在細(xì)胞質(zhì)中。隨機(jī)選擇20個(gè)視野并在低倍鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析VEGFA和Wnt在樣本中的積分光密度（IOD）值。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)200 倍視野下CD34陽性細(xì)胞。

由上可見，同一知識(shí)點(diǎn)每一螺旋的時(shí)間選擇和呈現(xiàn)方式需要結(jié)合知識(shí)的特點(diǎn)和學(xué)生的認(rèn)知發(fā)展而確定[18]，避免過低或過高地估計(jì)學(xué)生的知識(shí)理解能力．具體而言，可以依據(jù)相關(guān)的學(xué)習(xí)理論（如范希爾的幾何思維水平理論）來設(shè)計(jì)適宜的螺旋時(shí)間及相應(yīng)呈現(xiàn)方式．

1.5.3 血管造影 參照文獻(xiàn)研究[13]對(duì)裸鼠鼻咽癌異種移植瘤模型實(shí)施明膠-氧化鉛造影。麻醉裸鼠，開胸后在裸鼠心尖處行長約1 mm切口，隨即將24號(hào)留置針導(dǎo)管自切口插入，將明膠-氧化鉛溶液自導(dǎo)管灌入裸鼠全身動(dòng)脈，待明膠-氧化鉛溶液凝固后取出鼻咽腫瘤在X 線下攝像。采用Quantity One 4.6.2（BIO-RAD）軟件掃描X 膠片中腫瘤內(nèi)血管組織的光密度值，用排水法測(cè)定鼻咽腫瘤體積。腫瘤組織光密度值與腫瘤體積（cm3）比值為腫瘤組織平均體積血管密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用非配對(duì)雙側(cè)t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連翹苷對(duì)HUVECs及HNE1、SUNE-1、NP69細(xì)胞生長的影響 圖1 結(jié)果顯示：將0、0.625、1.25、 2.5、 5、 10 μmol/L 連 翹 苷 分 別 作 用 于HUVECs及HNE1、SUNE-1、NP69細(xì)胞（細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL）24 h 后，較低濃度連翹苷（0.625、1.25、2.5、5 μmol/L）對(duì)NP69 細(xì)胞及HUVECs 的生長無明顯抑制作用，HUVECs、NP69 細(xì)胞存活率與0 μmol/L 連翹苷組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。10 μmol/L連翹苷作用HUVECs和NP69細(xì)胞24 h 后，HUVECs、NP69 細(xì)胞存活率分別為（67.2±8.4）%、（73.4±8.7）%，明顯低于0 μmol/L連翹苷組（P＜0.05）。

圖1 連翹苷對(duì)HUVECs及HNE1、SUNE-1、NP69細(xì)胞生長的影響（）Figure 1 Effect of phillyrin on the growth of HUVECs and HNE1，SUNE-1 and NP69 cells（）

0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L 連翹苷處理HNE1 和SUNE-1 細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組（0 μmol/L連翹苷處理組）（P＜0.05）。

2.2 連翹苷對(duì)HUVECs 小管形成的影響 圖2 結(jié)果顯示，HUVECs 在布滿Matrigel 膠的培養(yǎng)板中孵育24 h后，細(xì)胞逐漸向兩端延長呈梭形，同時(shí)細(xì)胞延長端開始在Matrigel 膠中伸展，相鄰細(xì)胞開始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。0.625、1.25、2.5 μmol/L連翹苷作用HUVECs 12 h 后體外小管形成數(shù)分別為（23.8 ± 3.4）、（16.2 ± 2.4）和（13.5 ± 1.8）個(gè)，均低于0 μmol/L 連翹苷組的（38.6 ± 4.1）個(gè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VEGFA 20 μg/L 聯(lián)合2.5 μmol/L 連翹苷作用 HUVECs 12 h 后體外小管形成數(shù)為（41.5±5.2）個(gè)，高于2.5 μmol/L連翹苷組的（13.5± 1.8）個(gè)（P＜0.05）。

圖2 連翹苷對(duì)HUVECs小管形成的影響（×200）Figure 2 Effect of phillyrin on tubule formation in HUVECs（×200）

2.3 連翹苷對(duì)HUVECs 侵襲的影響 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。連翹苷可明顯減少侵襲出 Matrigel 基質(zhì)膠的 HUVECs 數(shù)量，0.625、1.25、2.5 μmol/L 連翹苷作用 HUVECs 24 h 后侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（52.3±2.8）、（44.5±5.8）、（31.6±4.5）個(gè)，均低于0 μmol/L 連翹苷組（76.4 ± 6.2）個(gè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VEGFA 20 μg/L 聯(lián)合2.5 μmol/L 連翹苷作用 HUVECs 24 h 后侵襲細(xì)胞數(shù)為（83.8 ± 9.5）個(gè)，高于 2.5 μmol/L 連翹苷組（31.6± 4.5）個(gè)（P＜0.05）。

圖3 連翹苷對(duì)HUVECs侵襲的影響（×200）Figure 3 Effect of phillyrin on the invasion of HUVECs（×200）

2.4 連翹苷對(duì) HNE1、SUNE-1 細(xì)胞，HUVECs 中Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2 通 路 蛋 白 表 達(dá) 的影響 圖4-A、表1～表2 結(jié)果顯示，0.625、1.25、2.5 μmol/L 連翹苷作用 HNE1、SUNE-1 細(xì)胞 24 h后，Wnt、β-catenin 和 VEGFA 的表達(dá)水平隨連翹苷濃度的升高而下降。圖4-B、表3 結(jié)果顯示，0.625、1.25、2.5 μmol/L 連翹苷作用 HUVECs 24 h后，可呈濃度依賴性下調(diào)HUVECs中VEGFR2表達(dá)水平。

表1 各組HNE1細(xì)胞中Wnt、β-catenin、VEGFA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 1 Comparison of the relative protein expressions of Wnt，β-catenin and VEGFA in HNE1 cells among various groups （）

表1 各組HNE1細(xì)胞中Wnt、β-catenin、VEGFA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 1 Comparison of the relative protein expressions of Wnt，β-catenin and VEGFA in HNE1 cells among various groups （）

注：①P＜0.05，與連翹苷0 μmol·L-1組比較

連翹苷濃度/（μmol·L-1）0 0.625 1.25 2.5 VEGFA 1.00±0.12 0.69±0.08①0.33±0.04①0.16±0.02①Wnt 1.00±0.14 0.34±0.04①0.16±0.02①0.14±0.02①β-catenin 1.00±0.16 0.72±0.11①0.67±0.09①0.26±0.03①

表2 各組SUNE-1細(xì)胞中Wnt、β-catenin、VEGFA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 2 Comparison of the relative protein expressions of Wnt，β-catenin and VEGFA in SUNE-1 cells among various groups （）

表2 各組SUNE-1細(xì)胞中Wnt、β-catenin、VEGFA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 2 Comparison of the relative protein expressions of Wnt，β-catenin and VEGFA in SUNE-1 cells among various groups （）

注：①P＜0.05，與連翹苷0 μmol·L-1組比較

連翹苷濃度/（μmol·L-1）0 0.625 1.25 2.5 VEGFA 1.00±0.18 0.63±0.08①0.24±0.03①0.08±0.01①Wnt 1.00±0.11 0.71±0.12①0.34±0.03①0.19±0.02①β-catenin 1.00±0.12 0.89±0.13 0.52±0.07①0.12±0.02①

表3 各組HUVECs細(xì)胞中VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 3 Comparison of relative protein expressions of VEGFR2 in HUVECs cells among various groups （）

表3 各組HUVECs細(xì)胞中VEGFR2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 3 Comparison of relative protein expressions of VEGFR2 in HUVECs cells among various groups （）

注：①P＜0.05，與連翹苷0 μmol·L-1組比較

連翹苷濃度/（μmol·L-1）0 0.625 1.25 2.5 VEGFR2 1.00±0.15 0.27±0.04①0.15±0.01①0.16±0.02①

圖4 連翹苷對(duì)HNE1和SUNE-1細(xì)胞（A）和HUVECs（B）中Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2通路蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of phillyrin on protein expression of Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2 pathway in HNE1 and SUNE-1 cells（A）and HUVECs（B）

2.5 連翹苷對(duì)裸鼠鼻咽癌異種移植瘤生長和血管新生的影響 2組裸鼠體質(zhì)量比較結(jié)果顯示：給藥前，對(duì)照組和連翹苷組裸鼠體質(zhì)量分別為（19.5±3.2）、（20.4±2.1）g，2組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后，對(duì)照組和連翹苷組裸鼠體質(zhì)量分別為（18.7± 3.3）、（19.1± 2.6）g，2 組間比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

明膠-氧化鉛血管造影結(jié)果如圖5-A所示，對(duì)照組裸鼠鼻咽癌異種移植瘤內(nèi)血管分布較為密集，連翹苷組鼻咽癌異種移植瘤中血管數(shù)量減少。對(duì)照組和連翹苷組平均體積血管密度分別為（5.9±1.2）、（1.6±0.3），2組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

腫瘤組織大體形態(tài)如圖5-B 所示，對(duì)照組和連翹苷組鼻咽癌異種移植瘤平均質(zhì)量分別為（1.2±0.3）、（0.4 ± 0.1）g，2 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

CD34、VEGFA 和Wnt 免疫組織化學(xué)法結(jié)果如圖5-C 所示。對(duì)照組和連翹苷組腫瘤組織中CD34的IOD值分別為（38.5±5.6）、（14.2±2.3），2組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；VEGFA在對(duì)照組和連翹苷組腫瘤組織中的IOD 值分別為（297.1±39.5）、（126.8±19.7），2組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Wnt 在對(duì)照組和連翹苷組腫瘤組織中的 IOD 值分別為（365.8 ± 45.3）、（106.9 ± 16.7），2 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 連翹苷對(duì)裸鼠鼻咽癌異種移植瘤生長和血管新生的影響Figure 5 Effect of phillyrin on the growth and angiogenesis of nasopharyngeal carcinoma xenografts

3 討論

本研究首先使用濃度梯度增高的連翹苷分別作用于體外鼻咽癌HNE1和SUNE-1細(xì)胞、鼻咽正常上皮細(xì)胞系NP69 細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），發(fā)現(xiàn)較低濃度（0.625～5 μmol/L）的連翹苷對(duì)體外NP69 細(xì)胞和HUVECs 生長無明顯抑制作用，但HNE1和SUNE-1細(xì)胞對(duì)連翹苷的生長抑制效應(yīng)更加敏感，0.625 μmol/L的連翹苷即可有效抑制體外HNE1和SUNE-1細(xì)胞生長，同時(shí)該濃度范圍的連翹苷對(duì)體外HUVECs 小管形成具有明顯抑制作用。另外，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，最小有用劑量10 mg/kg 的連翹苷對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸鼠無明顯毒副作用，但對(duì)鼻咽癌異種移植瘤生長和血管新生具有明顯抑制效應(yīng)。本研究首次報(bào)道連翹苷域劑量對(duì)體內(nèi)外正常細(xì)胞無明顯毒副作用，但可通過阻斷腫瘤血管新生，進(jìn)而達(dá)到延緩腫瘤細(xì)胞的惡性增殖速度的效果。

根據(jù)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)，靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞治療可改善惡性腫瘤患者預(yù)后[14-15]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD34、VEGFA的陽性表達(dá)水平評(píng)估組織的血管密度。結(jié)果表明，連翹苷可有效抑制腫瘤組織中CD34 及VEGFA 的陽性表達(dá)，從而在微觀層面表明連翹苷可有效抑制鼻咽癌血管新生。另外，本研究通過明膠-氧化鉛對(duì)裸鼠鼻咽癌異種移植瘤實(shí)施血管造影，從而獲得較為直觀的鼻咽腫瘤血管灌注影像。X光片可見，對(duì)照組鼻咽腫瘤血供極為豐富，而連翹苷組鼻咽腫瘤血供較為稀疏，從而在宏觀層面印證了連翹苷可有效抑制鼻咽腫瘤血管生長，與CD34及VEGFA的檢測(cè)結(jié)果相符，進(jìn)而對(duì)鼻咽癌異種移植瘤模型的血管灌注情況有了更為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果表明，10 mg/kg的連翹苷能通過抑制新生血管形成從而造成腫瘤處于“饑餓”狀態(tài)，進(jìn)而達(dá)到延緩腫瘤生長的作用，提示抑制新生血管形成在小劑量連翹苷抑制體內(nèi)鼻咽癌生長過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。

既往研究證實(shí)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在從細(xì)胞膜表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核過程中起關(guān)鍵作用，其可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、分化和增殖等多種生理學(xué)功能[16-18]。VEGF 作為一種可由正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞因子，在正常組織細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，且表達(dá)水平較為恒定，但VEGF在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞新生的最重要調(diào)節(jié)因子之一。VEGFA 作為VEGF家族中最重要的成員之一，可促進(jìn)新生血管形成并使血管通透性增加[19]。人肝細(xì)胞生長因子（rhHGF）可通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路上調(diào)腫瘤細(xì)胞中VEGFA 的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤組織中血管的生長[20]。在本研究中，連翹苷可抑制體外鼻咽癌細(xì)胞中Wnt 和β-catenin 表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)VEGFA 在體內(nèi)外鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)；另外，在體外實(shí)驗(yàn)中，連翹苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的抑制作用能被額外添加的VEGFA 所逆轉(zhuǎn)，證實(shí)連翹苷主要通過下調(diào)VEGFA 的表達(dá)從而發(fā)揮抑制血管新生作用；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，連翹苷可有效延緩體內(nèi)新生血管的生長，并降低體內(nèi)鼻咽腫瘤組織中VEGFA 的含量。因此，認(rèn)為連翹苷可能是通過下調(diào)Wnt/β-catenin/VEGFA 通路的表達(dá)從而抑制腫瘤血管生成，進(jìn)而干擾裸鼠腫瘤的惡性增殖。

VEGF自腫瘤細(xì)胞分泌后與位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR 相契合，有助于內(nèi)皮細(xì)胞募集和血管通透，并通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的降解、成熟、增殖和富集等過程，最終促進(jìn)新血管的形成[21-22]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們也觀察到連翹苷可有效抑制VEGFR2在HUVECs中的水平，結(jié)合連翹苷抑制裸鼠體內(nèi)鼻咽癌血管生長的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而表明連翹苷可有效調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響鼻咽癌細(xì)胞VEGFA 的表達(dá)，同時(shí)抑制VEGFR2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

綜上所述，連翹苷對(duì)體內(nèi)外鼻咽癌血管新生有顯著的抑制作用，其主要作用機(jī)制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin/VEGFA/VEGFR2 信號(hào)通路有關(guān)，可見其有一定的應(yīng)用前景，值得深入研究。