喂養(yǎng)不耐受的低出生體重早產(chǎn)兒腸道菌群動(dòng)態(tài)變化研究

邱玉芬，高曉燕，趙 丹，曾尚娟，陳玉君△

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院新生兒科，南寧 530007 2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/廣西兒科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心新生兒科，南寧 530010 )

喂養(yǎng)不耐受(feeding intolerance，F(xiàn)I)是早產(chǎn)兒常見胃腸道并發(fā)癥，在出生體重<2 000 g的早產(chǎn)兒中，F(xiàn)I的發(fā)生率為60%～70%[1]，本院2017年統(tǒng)計(jì)的發(fā)生率約為50%。FI使患兒腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)進(jìn)展緩慢，延遲的腸內(nèi)喂養(yǎng)產(chǎn)生與饑餓相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，包括黏膜萎縮、絨毛變平滑及細(xì)菌移位等，嚴(yán)重影響個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)于早產(chǎn)兒更有可能危及生命[2-3]。但FI的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，有研究提示其與胎兒的腸道菌群有關(guān)[4-5]，而通過微生態(tài)調(diào)整腸道菌群后，即使發(fā)生FI，全腸道喂養(yǎng)的時(shí)間可被縮短。可見，有益的腸道菌群構(gòu)成對(duì)于胎兒腸道功能的恢復(fù)有積極作用，但目前關(guān)于發(fā)生FI的低出生體重的早產(chǎn)兒腸道菌群的研究較少，尤其是動(dòng)態(tài)演變的觀察。本研究旨在分析發(fā)生FI的低出生體重早產(chǎn)兒腸道若干菌群的動(dòng)態(tài)變化，為臨床應(yīng)用微生態(tài)制劑治療該類患兒提供臨床依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院分娩且在新生兒科住院，并出現(xiàn)FI的65例低出生體重早產(chǎn)兒作為FI組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為剖宮產(chǎn)，生后均給予配方奶粉喂養(yǎng)；(2)胎齡<37周；(3)出生體重為1 500～2 500 g；(4)出現(xiàn)FI，F(xiàn)I診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：早產(chǎn)兒無法消化腸內(nèi)食物，鼻飼下胃內(nèi)殘余量超過喂入量的50%，伴有腹脹、嘔吐或二者兼有[6-7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腸道畸形；(2)嚴(yán)重感染；(3)壞死性腸炎；(4)有搶救窒息史。另選擇同期住院的與FI組胎齡、日齡、體重、剖宮產(chǎn)等相匹配，且未發(fā)生FI的65例早產(chǎn)兒作為對(duì)照(非FI組)。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。兩組出院后在本院兒童保健門診定期隨訪，并完成目標(biāo)菌群檢測(cè)。研究取得受試對(duì)象家長(zhǎng)的知情同意，且研究過程遵循醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 兩組兒童基線資料比較(n=65)

1.2 方法

1.2.1菌群采集

新生兒自然排便后，挑取糞便3～5 g盛于一次性無菌容器中送檢，如不易獲得糞便時(shí)或排便困難的患者及幼兒，可采用直腸拭子方法采集，取出后置于無菌容器內(nèi)送檢。所有糞便標(biāo)本應(yīng)立即送檢，如不能立即送檢，室溫下保存≤2 h。標(biāo)本運(yùn)送過程中必須保證其安全，防止溢出，避免細(xì)菌污染。

1.2.2鑒定方法

菌落鑒定使用珠海迪爾生物細(xì)菌測(cè)試藥敏板、梅里埃Vitek2鑒定卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定。糞便細(xì)菌DNA提取；糞便細(xì)菌DNA PCR擴(kuò)增；DNA變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)；DNA回收與純化；T-A克隆及測(cè)序結(jié)果比對(duì)，以及DNA豐度分析等方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]。FI組檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為出生后當(dāng)天，即住院第1天(t1)，以及FI改善后的第1、7、21、60、90天(t2～t6)；非FI組t1檢測(cè)時(shí)點(diǎn)也為出生后當(dāng)天(入院第1天)，以及此時(shí)間點(diǎn)后的第7、14、30、60、90天(t2～t6)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 雙歧桿菌相對(duì)豐度比較

t2～t6非FI組雙歧桿菌相對(duì)豐度高于FI組，且與前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

aP<0.05，與FI組比較；b：P<0.05，與同組前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較。圖1 兩組雙歧桿菌相對(duì)豐度比較

2.2 乳酸桿菌相對(duì)豐度比較

t1～t6非FI組乳酸桿菌相對(duì)豐度高于FI組，且t3～t6與前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

aP<0.05，與FI組比較；b：P<0.05，與同組前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較。圖2 兩組乳酸桿菌相對(duì)豐度比較

2.3 肺炎克雷伯菌相對(duì)豐度比較

t1～t5 FI組肺炎克雷伯菌相對(duì)豐度高于非FI組，且t2～t6與前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

aP<0.05，與非FI組比較；b：P<0.05，與同組前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較。圖3 兩組肺炎克雷伯菌相對(duì)豐度比較

2.4 大腸桿菌相對(duì)豐度比較

除t4外，t1～t6 FI組大腸桿菌相對(duì)豐度高于非FI組，且t2、t3、t5、t6與前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

aP<0.05，與非FI組比較；b：P<0.05，與同組前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較。圖4 兩組大腸桿菌相對(duì)豐度比較

2.5 腸球菌相對(duì)豐度比較

除t2外，t1～t6非FI組腸球菌相對(duì)豐度高于FI組，且t2～t5與前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

aP<0.05，與FI組比較；b：P<0.05，與同組前一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較。圖5 兩組腸球菌相對(duì)豐度比較

3 討 論

本研究低出生體重早產(chǎn)兒發(fā)生FI的中位時(shí)間為出生后第2天，F(xiàn)I改善的中位時(shí)間為第9天。在時(shí)間上，本課題組設(shè)定6個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，t1 FI組還未發(fā)生FI，檢測(cè)結(jié)果反映的是低體重出生的早產(chǎn)兒其腸道目標(biāo)菌群是否存在差異。結(jié)果顯示，除雙歧桿菌外，F(xiàn)I組乳酸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、腸球菌相對(duì)豐度與非FI組有差異(P<0.05)，提示低出生體重早產(chǎn)兒在FI出現(xiàn)前，如有腸道菌群紊亂，某種益生菌不足，以及條件致病菌過多可能導(dǎo)致FI。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)兒腸道菌群的定植模式異常，可導(dǎo)致FI[10-11]。因此，對(duì)于發(fā)生FI的低出生體重早產(chǎn)兒，能預(yù)防性使用益生菌干預(yù)，是否能減少其FI的發(fā)生，值得進(jìn)一步研究。

雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌是腸道益生菌[7]。其中，雙歧桿菌是人腸道中最重要的益生菌之一，在維持腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫中起重要作用。其腸道水平提升可修復(fù)損傷腸壁，降低受損腸壁的通透[12-13]。乳酸桿菌可通過產(chǎn)生乳酸、細(xì)菌素及過氧化氫等抗菌物質(zhì)抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而起到保護(hù)腸道的作用[14-15]。而腸球菌可通過與腸上皮細(xì)胞相互作用，減輕宿主的炎性反應(yīng)，保護(hù)腸道[8,16]。根據(jù)本研究結(jié)果，從入院第7天(t2)開始，未發(fā)生FI的低出生體重早產(chǎn)兒腸道雙歧桿菌水平高于前一時(shí)間點(diǎn)，而發(fā)生FI的低出生體重的早產(chǎn)兒腸道雙歧桿菌水平直到FI改善后第90天均未增加，更未達(dá)到未發(fā)生FI者的水平。兩組腸道該菌群的動(dòng)態(tài)變化及差異提示，發(fā)生FI的低出生體重早產(chǎn)兒腸道部分益生菌水平的恢復(fù)需較長(zhǎng)時(shí)間。

肺炎克雷伯菌和大腸桿菌屬于消化道的條件致病菌。其中肺炎克雷伯菌可影響腸-腦軸的調(diào)節(jié)，擾亂腸道微生態(tài)平衡，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞損傷，抑制早產(chǎn)兒的消化吸收功能，易導(dǎo)致腸炎[17]。大腸桿菌也可通過與人體細(xì)胞發(fā)生特異黏附、進(jìn)而定居繁殖和產(chǎn)生腸毒素發(fā)揮致病作用[8]。根據(jù)本研究結(jié)果，從t2開始，F(xiàn)I組腸道肺炎克雷伯菌總體水平呈下降趨勢(shì)，但直到t6才與非FI組水平無差異。而在大腸桿菌水平上，雖然FI組總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但直到t6仍高于非FI組。這些均提示發(fā)生FI的低出生體重早產(chǎn)兒腸道條件致病菌水平的下降需要較長(zhǎng)時(shí)間，考慮原因?yàn)榘l(fā)生FI的低出生體重早產(chǎn)兒住院時(shí)間長(zhǎng)，缺乏各種益生菌的非母乳腸道營(yíng)養(yǎng)支持。對(duì)于該群體，如在發(fā)生FI后，使用益生菌干預(yù)可能會(huì)改善其腸道菌群構(gòu)成，減少其腸道營(yíng)養(yǎng)時(shí)間，更早的回歸正常喂養(yǎng)。

綜上所述，低出生體重早產(chǎn)兒在FI出現(xiàn)前，腸道菌群紊亂可能導(dǎo)致FI，而發(fā)生FI后，其腸道部分益生菌水平恢復(fù)及條件致病菌水平下降需要較長(zhǎng)時(shí)間。本研究不足之處在于：(1)僅檢測(cè)了具有代表性的5種細(xì)菌，未檢測(cè)腸道菌群多樣性，而有研究認(rèn)為腸道菌群的多樣性與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎及膿毒血癥有關(guān)[18-19]；(2)由于未能很好地控制影響因素，在整個(gè)動(dòng)態(tài)觀察期間，未能將研究對(duì)象腸道疾病與菌群水平進(jìn)行相關(guān)性研究。