鹽城地區4 429例孕婦脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查及產前診斷

張慶娥,鄭建麗,李 敏,董晶晶,周月云,劉建兵,胡蘇瑋

(1.揚州大學，江蘇揚州 225002；2.江蘇省鹽城市婦幼保健院產前診斷中心 224001；3．揚州大學醫學院附屬揚州市婦幼保健院醫學遺傳中心，江蘇揚州 225002)

脊髓性肌萎縮癥(SMA)是一種常染色體隱性遺傳性疾病，其特征是脊髓前角細胞和腦干運動性腦神經核的運動神經元進行性退變。該病的臨床表現主要為進行性對稱性肌無力和肌肉萎縮。臨床癥狀在近端比遠端更嚴重，下肢比上肢更嚴重[1]。該病可分為4型：急性嬰兒Ⅰ型、慢性嬰兒Ⅱ型、青少年Ⅲ型和成人Ⅳ型。該病在人群中的發病率為1/6 000～1/10 000，致病性突變的攜帶頻率為1/60～1/40[2]。SMA在兒童致死性常染色體遺傳病中排名第二，約80%的患兒在4歲前死亡。

據研究，SMA是由位于5號染色體上的運動神經元存活基因1(SMN1)突變引起的。95%～98%為SMN1第7、8外顯子(E7、E8)缺失,包括E7、E8雜合缺失或僅E7純合缺失，SMN1點突變比例為2%～5%[3-4]。因此，針對SMN1基因E7和E8的拷貝數檢測已成為目前篩查SMA攜帶者的常用方法。鑒于該病致死率極高，致病基因明確，且人群中攜帶者頻率比較高，2008年美國醫學遺傳學會就提倡對所有育齡夫婦提供SMA篩查。若夫妻雙方均為攜帶者，可進行產前診斷判斷胎兒是否為SMA患兒。本研究采用熒光定量PCR技術對鹽城地區孕婦進行SMA攜帶者篩查，對于高危胎兒，結合多重連接依賴探針擴增技術(MLPA)進行產前診斷，可以有效阻止SMA患兒的出生，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月至2022年2月鹽城市婦幼保健院產前診斷中心就診的33 560例表型正常的孕婦為研究對象。所有孕婦進行SMA攜帶者篩查的宣教，其中自愿接受SMA攜帶者篩查4 429例，接受率約13.2%。孕婦年齡18～45歲，平均(27.9±4.7)歲；孕周11～20周，平均(15.5±2.9)周,且否認SMA家族史和生育史。本研究獲得醫院倫理委員會審查和批準，且接受攜帶者篩查的孕婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取

參與篩查的孕婦用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集外周靜脈血2 mL,應用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周血DNA，測定濃度調整至10～20 ng/μL。參加產前診斷的孕婦采集羊水10mL,應用微量DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取羊水基因組DNA。

1.2.2熒光定量PCR檢測

本研究應用SMN1外顯子缺失檢測試劑盒(上海五色石醫學科技有限公司)采用化學阻斷法阻斷SMN2，對提取到的基因組DNA先進行SMN1基因E7/E8擴增，再對拷貝數進行分析計算。按照試劑盒套組說明書操作：取出試劑盒，將試劑盒平衡至室溫，根據當次實驗所進行的反應數(標本DNA、1個空白對照、1個缺失對照及3個梯度正常對照)計算并移取相應試劑，按照試劑盒方案配制反應體系，按照以下條件進行PCR擴增，實時收集熒光信號，記錄并計算實驗結果。

1.2.3MLPA

應用MLPA P460試劑盒(荷蘭MRC公司)來驗證SMN1的E7和E8拷貝數變異的情況。MLPA P460試劑盒中探針包括SMN1和SMN2基因E7和E8。按操作流程DNA經過變性、探針雜交、連接反應和擴增后，得到的擴增產物通過ABI3500毛細管電泳，所得數據用Coffalyser V8.0軟件分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 SMA攜帶者篩查結果

鹽城地區孕產婦的SMA攜帶頻率為1/61，即61例孕婦中有1例SMA攜帶者。73例攜帶者接受了遺傳咨詢，60例配偶(82.2%)接受了SMA篩查，結果顯示2對夫婦同時為SMA攜帶者，見表1。

表1 SMA攜帶者篩查結果(n)

2.2 產前診斷結果

2例高風險孕婦運用MLPA行產前診斷，最終提示1例胎兒為SMN1基因E7/E8雙拷貝，即正常，孕婦繼續妊娠；另1例胎兒為SMN1基因E7/E8零拷貝，即SMA患者，孕婦終止妊娠。

3 討 論

SMA是一種致死性神經系統性疾病，主要表現為對稱性肌無力和肌萎縮，患者最終將死于呼吸衰竭和嚴重的肺部感染。治療SMA的藥物目前只有諾西那生鈉、索伐瑞韋和利司撲蘭3種。雖然這些藥物的上市給SMA患者帶來了希望，但價格非常昂貴，普通家庭無法承受。因此，通過攜帶者篩查和產前診斷技術來避免SMA患兒的出生，是一種經濟有效的預防該病的方法。

2007年，美國部分州即開始對新生兒和產前遺傳咨詢的婦女提供SMA篩查。2017年，美國婦產科學會便倡導對所有計劃妊娠或者已經妊娠者進行SMA篩查[5-6]。在中東，以色列于2008年引入SMA篩查，于2013年擴大到全部人口[7-8]。2005—2009年，我國臺灣地區有超過10萬例孕婦進行了SMA攜帶者篩查[9]。本研究對33 560例孕婦進行SMA篩查的宣教，其中4 429例孕婦自愿接受SMA篩查，接受率約13.2%。而張菁菁等[10]報道南京地區16 549例孕婦有34.9%進行了篩查。分析鹽城地區人群接受程度較低的原因主要與人們對于SMA不了解和經濟條件相關。因此，需要加強對孕婦進行SMA篩查知識的宣教，借助政府機構的相關政策的支持，將會提高接受SMA篩查的人群比例。

研究表明，SMA的攜帶頻率為1/60～1/40。本研究通過對鹽城地區4 429例孕婦進行SMA攜帶者篩查,共發現73例為SMA攜帶者，攜帶者頻率為1/61。據報道，以色列和澳大利亞的攜帶率分別為1/60和1/50[8,11]，我國上海地區的攜帶者頻率為1/52[12]，云南地區的攜帶者頻率為1/49[13]，本研究與前述報道較一致。此外，雖然SMN1基因E7/E8的缺失突變占SMN1的95%～98%，但當檢測陰性時，只能排除SMN1基因E7和E8的缺失突變，不能排除SMN1基因其他區域的點突變，以及一條5號染色體上有2個SMN1基因、另一條5號染色體上的SMN1基因E7和(或)E8缺失[14]。故本地區SMA的攜帶率應略高于1/61，該項研究為本地區進行此項篩查提供了數據支撐，便于臨床醫生對孕婦進行宣教和遺傳咨詢。

SMA屬于單基因遺傳病，具有親代向子代傳遞的特性，對于既往有過SMA患兒生育史的婦女或SMA基因攜帶者夫婦，其妊娠的胎兒患SMA的風險為25%，應進行SMA的產前診斷。目前，SMA的產前診斷方法主要對絨毛、羊水或臍血等標本運用限制性片段長度PCR、MLPA、熒光定量PCR、變性高效液相色譜和測序等分子生物學技術進行檢測。張柳娟等[15]于2016年通過MLPA診斷出3例胎兒均為SMN1 E7和E8雜合缺失。徐晨陽等[16]于2017年對14個SMA家系進行MLPA檢測，發現正常胎兒6例，攜帶者7例，SMA患者3例。本研究73例孕婦攜帶者中60例配偶接受SMA篩查，2對夫婦同時為SMA攜帶者，并對2例高風險孕婦采集羊水通過MLPA行產前診斷，最終提示1例胎兒為SMN1基因E7/E8雙拷貝(正常)，另1例胎兒為SMN1基因E7/E8零拷貝(SMA患兒)。此外，因為SMN2基因為SMN1調節基因，其拷貝數與SMA的病情嚴重程度呈反比，所以在檢測羊水時都檢測了SMN2基因作為參考。本研究中1例胎兒為SMA患者，SMN2基因的E7/E8均為3拷貝，但預測其出生后的臨床表型介于Ⅱ型和Ⅲ型之間，仍然非常嚴重。該夫婦經遺傳咨詢后選擇終止妊娠。

綜上所述，鑒于SMA疾病的嚴重程度、人群的高攜帶頻率和治療費用昂貴的現狀，針對育齡人群的攜帶者篩查顯得尤為重要。在臨床工作和科普活動中需要加大對育齡人群的宣教，進行規范化的遺傳咨詢及必要的生育指導，從而避免SMA患兒的出生，為社會和家庭減輕負擔，從而提高出生人口質量。