組蛋白乙酰化對間充質干細胞成骨分化影響機制的研究

張思鈺 舒晴 賈紹輝 田峻*

1.武漢體育學院健康科學學院，湖北 武漢430079 2.武漢大學中南醫院康復醫學科，湖北 武漢430071

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種存在于骨髓、脂肪、臍帶血、肝等組織中的多功能祖細胞，具有自我更新、增殖和分化為多種細胞系的能力，可在體外擴增，分化為成骨、軟骨和脂肪細胞系[1]。由于其數量豐富、具有成骨分化潛能、免疫排斥反應小，比其他來源的干細胞具有更大的臨床應用潛力，成為骨組織領域的理想候選細胞[2]。就目前的研究來說，成體干細胞如骨髓源性間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)、脂肪源性間充質干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、牙來源間充質干細胞的相關研究最為廣泛。

骨由兩種類型的組織組成：皮質骨和松質骨。皮質骨位于外層，提供高機械強度，骨小梁呈力學特性排列，可提供抗壓強度[3]。參與骨形成的主要是成骨細胞、破骨細胞和骨細胞。骨的形成由成骨細胞分化開始，受多種轉錄因子和信號分子的調控，例如轉錄激活因子4(recombinant activating transcription factor 4, ATF4)、Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、Osterix蛋白(recombinant osterix, OSX)和骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)等[4]。而這些基因的表達又會受到很多因素的調控，其中組蛋白乙酰化水平在調節干細胞潛能和譜系分化中起著重要作用。更為重要的是遺傳、環境、化學物質和機械力[5]等很多因素可能影響組蛋白乙酰化的水平，從而觸發間充質干細胞分化為成骨譜系的最大效應。近年來，對于間充質干細胞修復骨缺損能力的研究主要集中于如何提高其成骨分化的能力，并且越來越多的學者開始從組蛋白乙酰化的角度對其進行研究。

1 組蛋白乙酰化的概述

表觀遺傳學是指不改變核苷酸序列就能影響基因表達的可遺傳的調控方式，主要的表觀遺傳調控包括組蛋白修飾、DNA甲基化和干擾RNA[6]。在這些機制中，組蛋白修飾對染色質構型的改變起著至關重要的作用。組蛋白是細胞核內序列高度保守的蛋白質，包括H1、H3、H2A、H2B和H4五種[7]。這些組蛋白形成八聚體復合物，包裹DNA以作為核小體嵌入細胞核內，在組蛋白尾部特定氨基酸殘基處經過翻譯后修飾，進而調控基因的表達[8]。組蛋白修飾多種多樣，包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、腺苷化等，它們可單獨或協同調控基因的轉錄。而組蛋白乙酰化是最重要的組蛋白修飾機制之一。

組蛋白乙酰轉移酶(histone acetylases, HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)是決定染色質乙酰化水平和相對活性的兩種酶。HATs負責將乙酰輔酶A上的一個乙酰基轉移到組蛋白賴氨酸殘基的氨基上，這一過程將瓦解組蛋白與帶負電荷DNA磷酸基團的相互作用，誘導染色質結構松散，暴露相應的基因結合位點促進轉錄[9]。相反，HDACs是催化組蛋白和非組蛋白賴氨酸殘基中負責去除乙酰基團的酶，促進組蛋白與沉默子的相互作用，抑制基因的轉錄[10]。HDACs催化組蛋白去乙酰化是一個動態的過程，根據功能和序列的同源性，可分為四個蛋白家族：Ⅰ類( HDAC1、 HDAC2、 HDAC3、HDAC8 ) 、Ⅱ 類 (HDAC4、 HDAC5、 HDAC6、 HDAC7、 HDAC9和HDAC10 )、Ⅲ類( NAD+依賴的HDAC的SIR2家族) 和Ⅳ類( HDAC11)。總之，HATs和HDACs被認為是骨重塑的關鍵調控酶，其在干細胞成骨分化過程中的調控作用得到越來越多的認識。

2 HATs對間充質干細胞成骨分化的影響機制

HATs包括HAT1、GCN5/PCAF、MYST、p300/CBP和Rtt109等5個亞族[11]，每種酶都有其獨特的作用。P300和CBP是結構同系物，在HAT結構域和溴結構域中共享高序列身份，也是RNA聚合酶II介導轉錄的調節劑，在成骨分化過程中定位于成骨基因的啟動子，導致成骨細胞中組蛋白H3[12]和H4[13]乙酰化。但實際上它們也具有不同的特異性，這些特異性取決于組蛋白或乙酰輔酶A是否具有限制性。例如對于限制性組蛋白H3和限制性乙酰輔酶A，p300的特異性比CBP高出一倍，而對于限制性組蛋白H4，CBP顯示出更高的特異性[14]。此外，GCN5作為P300/CBP相關因子同源物能靶向調節Wnt基因啟動子組蛋白H3的乙酰化水平，改善牙周炎的發展[15]以及減輕卵巢切除術小鼠的骨丟失[16]。N-乙酰基轉移酶10靶向于Runx2基因的N4-乙酰胞苷來促成骨[17]。KAT6A屬于MYST家族，可調節Nrf2/ARE信號通路并抑制老年人BMSCs中活性氧的積累，促進BMSCs的增殖分化[18]。因此，區分比較不同組蛋白乙酰轉移酶對組蛋白中賴氨酸的特異性，對闡明影響酶特異性的因素及其背后的調節機制至關重要。同時，監測組蛋白乙酰化靶標位點以及對其位點進行乙酰化定量有助于確定每個目標位點的動力學參數，便于進行量化的比較，其相關的實驗技術還值得繼續開發。

3 HDACs對間充質干細胞成骨分化的影響機制

HDACs亞型在成骨分化過程中也扮演著重要角色，一般來說，它們的參與通常會導致成骨基因相對mRNA水平的降低。而HDACs是一個種類繁多的大家族，其影響間充質干細胞成骨分化的機制也相對復雜，因此了解HDACs的作用機制是控制骨量丟失的先決條件。

3.1 Ⅰ類HDAC對間充質干細胞成骨分化的調節

Killaars等[19]證實了HDACs的活性會受核力學傳導的影響，在骨關節炎或骨質疏松模型中，細胞骨架被破壞，核力學傳導受損，HDAC1、HDAC2、HDAC3的活性水平會相應升高。相反，增加核張力，能降低Ⅰ型HDACs的活性，增加Runx2轉錄因子的表達。同時，HDAC1在機械轉導過程中起內源性Notch信號通路衰減劑的作用，機械刺激在體內外都可直接誘導HDAC1表達的下調，促進其靶點JAG1啟動子的組蛋白H3乙酰化水平上調，參與骨形成[20]。由此推斷，HDAC1的治療性抑制可能增強機械刺激下骨的形成，部分挽救由機械卸載引起的骨質疏松癥。李曄等[21]報道下調 HDAC2的表達能促進BMSCs成骨分化，其機制可能與激活Hedgehog 信號通路有關。同時，HDAC2也可從調節破骨細胞分化的功能方面來治療骨質疏松。Akt在破骨細胞形成過程中抑制負調控因子FoxO1轉錄，HDAC2通過激活Akt促進破骨細胞形成，導致骨量減少[22]。提示沉默HDAC2能降低破骨細胞分化和骨吸收活性。Fu等[23]證實HDAC8可以通過直接與成骨關鍵調控因子Runx2結合或下調組蛋白H3K9的乙酰化水平兩種途徑來抑制BMSCs成骨分化。通過對cAMP-CREB1-HDAC8通路的干預可以在一定程度上逆轉骨性纖維增生的表型[24]，提示HDAC8是干細胞成骨分化的負性調節子。

3.2 Ⅱ類HDAC對間充質干細胞成骨分化的調節

骨吸收和骨形成過程中的平衡可能因為衰老而中斷，衰老的間充質干細胞具有較差的細胞骨架形態和較低的遷移速度，歸巢能力降低導致骨再生被抑制[25]。細胞的分化潛能也會隨著年齡增長和傳代而受損[26]。有研究[27]證明組蛋白乙酰化在年齡相關性骨質流失中有著重要作用，老年小鼠BMSCs成骨潛力的減弱可歸因于HDAC6介導的Runx2啟動子組蛋白低縮。衰老相關的骨量丟失還與BMSCs的自噬活性相關[28]，HDAC9通過控制自噬基因啟動子ATG7、BECN1和LC3a/b中H3K9乙酰化水平來調控BMSCs的自噬活性，將其轉化為更年輕的狀態，衰老相關蛋白的表達降低，部分恢復了譜系分化平衡。此外，干擾RNA和組蛋白乙酰化可協同調控成骨基因的轉錄，Ma等[29]闡明了miR-383-5p與HDAC9在調節人牙周韌帶干細胞成骨分化方面的相互抑制機制。Li等[30]報道miR-17和HDAC9形成的抑制回路會影響牙周膜干細胞在體內外的成骨分化，miR-19a-3p[31]和miR-29a[32]能靶向作用于HDAC4，抑制其表達，上調堿磷酶活性促成骨。miR-29a還能調節Wnt3a/β-catenin信號通路，增強軟骨下間充質干細胞的礦化活性[33]。由此可見，靶向干擾RNA調控組蛋白乙酰化的水平在骨質疏松的治療中也是可行的。

3.3 Ⅲ類HDAC對間充質干細胞成骨分化的調節

在哺乳動物中，已經鑒定出7種Sirtuin蛋白(Sirt1-7)在多種活動中具有調節線粒體的功能，同時參與調控炎癥因子、衰老和氧化應激的水平。間充質干細胞長期以來被認為是在炎癥條件下促進功能恢復的關鍵群體，Sirt1通過調節NF-kB信號通路[34]和Wnt/β-catenin信號通路[35-36]，增強氧化代謝和炎癥消退。上調Sirt3能介導GSK-3β/β-catenin信號通路抑制NLRP3炎癥小體，顯著減弱Ti顆粒誘導的成骨抑制[37]。提示單獨去除炎癥刺激并不能阻止骨質流失的進展，因為炎癥可能從組蛋白乙酰化的角度損害成體干細胞成骨相關基因的轉錄。Sirt6與酵母沉默信息調節因子2 (Sir2)同源，能依賴于BMP和NF-kB信號通路[38]，參與骨形成。Zhang等[39]報道Sirt6表達受損的去卵巢小鼠表現出淋巴細胞和皮下脂肪顯著減少、前凸畸形和低骨髓密度，提示Sirt6可能是成骨分化的正調控因子。此外，Sirt1通過介導抗氧化關鍵轉錄因子Foxo3a的去乙酰化[40]以及減少熱量攝入[41]調節Runx2的轉錄活性，其激動劑白藜蘆醇的治療可以逆轉氧化應激下成脂/成骨譜系的失衡[42]。綜上，Sirtuin蛋白通過調節上下游信號通路，氧化應激的水平以及炎性細胞因子的分泌，參與骨代謝當中。

4 組蛋白去乙酰化酶抑制劑對間充質干細胞成骨分化的影響機制

組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor, HDACi)一開始被認為是治療腫瘤性疾病最有希望的藥物之一[43]。雖然這些藥物主要因其抗增殖和促凋亡活性而針對腫瘤疾病進行治療，但后來的研究表明，HDAC抑制劑可能對促進干細胞分化潛能有價值，因此被考慮用于骨再生和骨修復的治療。

不同的HDACi在促進成骨細胞分化方面顯示出不同的安全性和有效性。曲古柳菌素(trichostatin A, TSA)作為異羥肟酸的一種，是最先被發現的組蛋白去乙酰化酶抑制劑。Huynh等[44]指出，TSA通過抑制組蛋白去乙酰化酶的活性，減輕牙周炎引起的牙槽骨吸收，用TSA處理后的BMSCs不僅骨礦化能力增強，而且其衍生的細胞外囊泡因為富含促成骨的microRNA和轉錄調節蛋白，提高了骨再生效力[45]。Hu等[46]報道TSA的作用還與干細胞的類型、使用劑量及治療時間間隔有關。再者，干細胞在體內外的增殖和分化速率能相互影響。MI192選擇性作用于HDAC2和HDAC3，重新編程BMSCs[47]和牙髓干細胞[48]的表觀基因組，使細胞的生長周期停滯，成骨分化能力增強。Fan等[49]用較低濃度的丁酸鈉處理較短時間的人羊膜間充質干細胞會將細胞生長阻滯在G0/G1期，抑制其增殖，骨形成的礦化結節明顯增多；而較高濃度和較長時間的處理并沒有此作用，提示HDAC8的處理濃度和暴露時間可能與對H3K9的乙酰化調控有關。La等[50]表明丙戊酸通過誘導糖皮質激素受體GR和HDAC2結合來改善礦化基質的形成，這種調控作用可能與HDAC2的下調有關。同時，糖皮質激素類藥物常被臨床上用來進行抗炎、抗感染治療，能夠下調Runx2基因的H3K9乙酰化水平，降低成骨潛能[51-52]。因此，長期的糖皮質激素治療可能是骨質疏松癥的誘因之一，值得注意。

5 總結與展望

在骨組織工程領域中，骨修復以間充質干細胞的激活和成骨分化為主要特征。雖然間充質干細胞具有多向分化的潛能，但其成骨分化的程度與干細胞的狀態和所處微環境密切相關。例如細胞在體外培養的過程中會遇到復制性衰老的問題，從保持間充質干細胞原始性質的角度出發，重點優化干細胞的體外培養體系是必要的。同時，不同來源間充質干細胞的組蛋白乙酰化水平受外界調節的敏感度不同，可以考慮在細胞治療中使用各來源的間充質干細胞，以提高過程效率。其次，干細胞成骨分化的乙酰化水平與氧化應激和炎性因子的水平有著密切聯系，但其相互調節的分子機制還有待進一步挖掘。現有研究證實了參與成骨細胞分化調節的組蛋白乙酰化修飾酶的任何錯誤調節都可能導致嚴重的骨骼異常。因此，未來的研究需要監測更多組蛋白乙酰化的靶標位點以便對其進行量化比較，為間充質干細胞提供精確的分化條件，使其能夠向可控、可預測的方向分化。此外，不同的抑制劑藥物在藥理特性(功效、穩定性、毒性)上可能也存在差異，謹慎地對待長期藥物治療的副作用，在未來的藥物開發方面也可以作為一個關鍵點來考慮。