五味子對產(chǎn)蛋期藏雞腸道微生物菌群的影響

楊曉志，顧文婕，吉俊玲，董 飚，袁旭紅，卞富智

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州 225300)

近年，由于抗生素濫用導致機體耐藥性增加，腸道菌群紊亂，嚴重影響雞的生產(chǎn)性能。因此，尋找能調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物多樣性的平衡、綠色環(huán)保的添加劑具有重要的生產(chǎn)意義。相關(guān)研究表明，中藥作為飼料添加劑，可通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物多樣性的平衡，為共生菌在維持禽體健康，提高消化吸收能力、抵抗致病微生物，從而間接改善機體狀況[1-3]，并通過腸道菌群代謝產(chǎn)生直接對機體有影響的活性物質(zhì)發(fā)揮生理作用[4-7]。此外，中藥還具有無藥物殘留、無抗藥性及綠色環(huán)保等特點[8]，因此，相關(guān)研究備受國內(nèi)外關(guān)注。五味子是我國林業(yè)特產(chǎn)之一，為木蘭科多年生落葉木質(zhì)藤本植物五味子的干燥成熟果實[9]，五味子含有多種化學成分，據(jù)文獻報道，主要含有木脂素、多糖、揮發(fā)油、有機酸等。其中，以木脂素類的化學成分含量最高，可達8%[10]，其中，木脂素類的主要活性化學成分是五味子乙素[11-13]。在蛋雞生產(chǎn)中有研究表明，五味子能促進蛋雞子宮平滑肌興奮，并且保肝解毒、促進肝糖元分解及抗應激，可提高代謝效率[14]、機體免疫力及生長性能[15]，并且促進卵泡發(fā)育和排卵，從而提高蛋質(zhì)量及產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，延長產(chǎn)蛋期[16-17]。前期相關(guān)試驗表明飼料中添加0.5%的五味子有利于產(chǎn)蛋期蛋雞的健康。目前，有關(guān)五味子在家禽生產(chǎn)中的研究主要集中在添加量對生產(chǎn)性能的研究，對其作用畜禽腸道微生物機理的研究較少。因此，本試驗通過五味子添加飼喂試驗，分析中草藥五味子對產(chǎn)蛋期藏雞腸道微生物多樣性和菌群不同層級物種豐度的影響，探討其與家禽腸道微生物的作用機制，為五味子在家禽生產(chǎn)上的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 選取健康無病、產(chǎn)蛋情況正常的40周齡產(chǎn)蛋期藏母雞為試驗對象，試驗動物由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術(shù)學院家禽生產(chǎn)實訓中心提供。

1.1.2 五味子 五味子是木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，習稱“北五味子”，購于北京同仁堂大藥房。試驗前將五味子烘干粉碎至40目備用。

1.1.3 飼料 飼料采用產(chǎn)蛋期雞飼料，購于南通正大飼料有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗將60羽藏母雞隨機分為對照組(CGB)、試驗組(WWZ)，每組3個重復，每個重復10羽，對照組飼喂全價產(chǎn)蛋日糧，試驗組飼喂添加0.5%五味子的全價產(chǎn)蛋日糧。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗于2020年12月在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院家禽生產(chǎn)實訓中心開展，試驗雞均為單籠飼養(yǎng)，自由采食飲水，試驗期28 d。

1.2.4 DNA提取、PCR擴增和測序 運用CTAB法提取樣品DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測基因組DNA濃度及純度。將DNA溶液稀釋至 1 ng/μL 作為測序模板。使用16S rRNA基因的高度可變區(qū)域V3～V4區(qū)域擴增引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化、定量和均一化操作后建立測序文庫用于測序。測序基于 Illumina HiSeq 測序平臺，測序后序列進行拼接、過濾、除嵌合體，得到 Tags 序列。

1.2.5 構(gòu)建樣品稀釋曲線 以隨機抽取的序列的物種數(shù)目為縱坐標，以抽樣序列數(shù)為橫坐標，構(gòu)建樣本稀釋曲線[18]。

1.2.6 OTU分析 在97%相似度水平下使用Usearch軟件[19]對Tag進行聚類、獲得OTU，繪制出樣品組間Venn圖[20]，比較試驗組與對照組樣品間共有、特有的OTU數(shù)目。基于OTU分析結(jié)果和Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學數(shù)據(jù)庫對樣品進行分類學注釋。

1.2.7 物種注釋及分類學分析 將組內(nèi)每個樣本門、綱、目、科、屬、種不同水平對應物種的絕對豐度加和，再計算每個物種的相對豐度。對豐度水平前十的物種進行組間比較分析。

1.2.8 多樣性分析 α多樣性分析：對樣品的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)統(tǒng)計分析，研究單個樣品內(nèi)部的物種多樣性。β多樣性分析：采用Bray-Curtis和Weighted Unifrac這2種加權(quán)算法通過非度量多維標定法(NMDS)分析來比較不同樣品在物種多樣性方面存在的差異大小[21]。

1.2.9 組間差異顯著性檢驗 根據(jù)設定的Biomarker篩選標準(LDA score>4)采用Lefse分析篩選出符合條件的Biomarker，分析對照組與試驗組間相對豐度具有顯著差異的物種[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過對20羽產(chǎn)蛋期藏雞腸道內(nèi)容物進行16S rDNA V3～V4區(qū)進行高通量進行測序，按照97%相似度對OTU進行分類，一共得到1 374 847對Read，對Read進行雙端拼接、過濾后共產(chǎn) 1 307 862 條 Clean tag，其中，Effective Tag(有效 tag)為1 210 021個。所測序列平均長度為 419 bp，GC含量平均為53%，且Q30均在96%以上，超過Q30>85%的質(zhì)量要求，說明樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可進行試驗數(shù)據(jù)分析。

經(jīng)濟性因素是海上風電場建設的重要因素，在滿足結(jié)構(gòu)安全性、可施工性因素后，各風機基礎(chǔ)方案中經(jīng)濟性最好的方案將確定為嵌巖區(qū)域的風機基礎(chǔ)推薦方案。在考慮經(jīng)濟性因素時，應綜合考慮各基礎(chǔ)方案的建造成本和施工成本，缺一不可。

2.2 樣品稀釋曲線分析

由圖1可知，當樣品隨機抽取的序列數(shù)超過 10 000 時，稀釋曲線趨于平緩并最終達平臺期，表明測序深度已足夠，大多數(shù)微生物多樣性信息已被測出，并且能夠反映出試驗組和對照組藏雞腸道微生物多樣性組成，可進行后繼數(shù)據(jù)分析。

2.3 樣品OTU分析

試驗對20個樣品按照97%相似度對OTU進行分類，共檢測出552個OTU，歸類于16門、24綱、33目、59科、149屬、171種，去除異常值后，對照組樣品平均OTU為443個，五味子組OTU為477個。對比對照組和五味子組中所有OTU種類，由圖2可知，五味子組和對照組有550個共有OTU，對照組有2個特有OTU，五味子組無特有OTU。組內(nèi)樣品間OTU分析結(jié)果，由圖3可知，對照組內(nèi)樣本間共有OTU數(shù)目為70個，五味子組內(nèi)樣本間共有OTU數(shù)目為269個。

2.4 物種注釋及分類學分析

2.4.1 基于門水平物種分類學分析 從門分類學水平進行腸道微生物群結(jié)構(gòu)分析，通過序列對比和注釋，最高歸屬為16個門。由圖4和表1可知，藏雞腸道微生物的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門，相對豐度總和在96%以上，其中，厚壁菌門均為2組的第一大優(yōu)勢菌門。相較于對照組，五味子組厚壁菌門的相對豐度有明顯降低，對照組高出試驗組19.78%。而擬桿菌門的相對豐度明顯升高，試驗組擬桿菌門的相對豐度高出對照組16.37%，但差異均不顯著(P>0.05)。

表1 門水平差異腸道菌相對豐度變化趨勢

2.4.2 基于屬水平物種分類學分析 通過序列對比和注釋，樣品間微生物歸屬于149個屬，2組樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)及相對豐度具體分析結(jié)果見圖5。由圖5可知，試驗組組中擬桿菌屬含量最高，相對豐度為20.87%，是第一優(yōu)勢菌屬，乳桿菌屬則是第二大優(yōu)勢菌屬，相對豐度為10.74%，其余依次是考拉桿菌屬，相對豐度為6.96%，理研菌科RC9腸道菌屬，相對豐度為6.08%。對照組中乳桿菌屬是第一大優(yōu)勢菌，相對豐度為31.53%，羅姆布齊亞菌屬為第二大優(yōu)勢菌屬，相對豐度為19.86%。其余依次是擬桿菌屬，相對豐度為11.02%，理研菌科RC9腸道菌屬，相對豐度為3.33%。

由表2可知，屬水平差異腸道菌變化趨勢可看出五味子組與對照組相比，乳桿菌屬、羅姆布齊亞菌屬、巨單胞菌屬相對豐度均有所下調(diào)，分別減少20.79%和16.86%，但差異不顯著(P>0.05)。擬桿菌屬、理研菌屬、考拉菌屬、梭桿菌屬、普拉梭菌屬、脫硫弧菌屬、瘤胃球菌屬相對豐度均有所上調(diào)，分別為9.85%、4.41%、2.76%、0.28%、2.93%、1.11%和0.72%，其中考拉菌屬相對豐度五味子組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

表2 屬水平差異腸道菌相對豐度變化趨勢

2.5 多樣性分析

2.5.1 α多樣性分析 Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，則表明樣品的物種多樣性越高[23-24]。由表3可知，五味子組Shannon指數(shù)高于對照組，Simpson指數(shù)低于對照組，說明五味子組藏雞腸道微生物多樣性高于對照組，但差異均不顯著(P>0.05)。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度的大小。由表3可知，五味子組Chao1和Ace均高于對照組，提示五味子組的樣品豐度要高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表3 樣本的α多樣性指數(shù)

2.5.2 β多樣性分析 NMDS圖(圖6)中點分別表示樣品，點與點之間的距離表示差異程度，當Styress小于0.2時，表明在坐標圖上距離越遠，差異程度越大。由圖6可知，對照組各點較為分散，樣品間微生物多樣性和豐度差異較大。五倍子組樣品更為聚集，說明微生物多樣性較為相似。

2.6 組間差異顯著性分析

由圖7可知，五味子組科水平上氨基酸球菌科相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)，屬水平上考拉桿菌屬的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)，種水平上未培養(yǎng)的考拉桿菌的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)。對照組各水平上未出現(xiàn)微生物的豐度顯著高于五味子組的菌屬。

3 討論

3.1 五味子對藏雞腸道微生物OTU的影響

通過對照組和五味子組藏雞腸道中OTU的數(shù)目分析可知，五味子對產(chǎn)蛋期藏雞腸道微生物種屬類別的影響幾乎可忽略。而對不同試驗組內(nèi)不同樣品共有OTU進行分析可知，飼料中添加五味子后組內(nèi)樣本間共有的OTU數(shù)目由70個增加至269個，說明對照組藏雞體內(nèi)腸道微生物OTU相似性較低，飼料中在添加五味子后藏雞腸道中的微生物相同OTU大幅度增加而且有變得更為相似的趨勢。

3.2 五味子對藏雞腸道微生物豐度的影響

通過對藏雞腸道主要微生物相對豐度的分析可知，藏雞腸道微生物以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門為主，占總菌群95%，這與相關(guān)文獻報道雞腸道微生物的組成、分布的研究結(jié)果[2，25-26]較為一致。本試驗中五味子組與對照組相比擬桿菌門相對豐度有明顯的上調(diào)，這主要與擬桿菌門下的擬桿菌屬和理研菌屬的相對豐度上升有關(guān)。這可能與五味子富含多糖類物質(zhì)，而多糖是擬桿菌的主要能量來源，它可將復雜的多糖轉(zhuǎn)化為可用化合物的能力，這就讓擬桿菌比必須依賴其他能源的細菌在雞腸道中更具競爭力。擬桿菌能夠通過預防可能定殖和感染腸道的潛在病原體感染來使宿主受益。同時，試驗結(jié)果還顯示，五味子還顯著提高了藏雞腸道微生物中毛螺菌科、普拉梭菌屬的相對豐度。毛螺菌科是厚壁菌門下梭菌目中最重要的優(yōu)勢菌群之一，其科內(nèi)的糞球菌屬是產(chǎn)丁酸的核心菌屬，可以將復雜多糖分解成揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丁酸等)。揮發(fā)性脂肪酸可以調(diào)節(jié)腸道pH值，緩解病原菌導致的腸道感染和炎癥，對腸道的健康有著極其重要的作用[27]。普拉梭菌屬也是丁酸的重要生產(chǎn)者之一，具有抗炎作用，維持細菌酶的活性，保護消化系統(tǒng)免受腸道病原體的侵害。

相關(guān)研究表明，五味子對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌[12]、表皮葡萄球菌、腸球菌等[28]、腸道致病菌及綠膿桿菌[29]、淋球菌[30]有較好的抑制作用。本試驗中五味子組與對照組相比厚壁菌門相對豐度下調(diào)較多，這主要是由厚壁菌門下的的乳酸桿菌屬和羅姆布齊亞菌屬的相對豐度下調(diào)較多引起的，但厚壁菌門下考拉菌屬與對照組相比相對豐度顯著增加，說明五味子對厚壁菌門下菌屬微生物的抑制不具有普遍性。同時相關(guān)研究報道五味子浸提液可明顯促進雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌體外生長[31]，本次試驗結(jié)果與之不一致，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的具體機理還有待進一步試驗分析。

3.3 五味子對藏雞腸道微生物多樣性的影響

由α多樣性分析可知，五味子組Chao1和Ace指數(shù)高于對照組，說明五味子使藏雞腸道物種豐度升高；五味子組的Shannon指數(shù)高于對照組、Simpson指數(shù)低于對照組，因此五味子藏雞組腸道微生物多樣性高于對照組。β多樣性分析表明，對照組樣品間微生物多樣性差異較大。因為對照組腸道微生物未經(jīng)過人為干預，五味子組樣品點更為聚集，說明微生物多樣性較為相似，表明五味子對藏雞腸道微生物產(chǎn)生了影響，而且作用效果相對一致。

3.4 五味子對藏雞腸道微生物組間差異的影響

通過組間差異顯著性分析，可以看出試驗組的氨基酸球菌科、考拉桿菌屬的相對豐度顯著高于五味子組。氨基酸球菌科可產(chǎn)生乙酸和丁酸，可緩解腸道驗證。考拉桿菌屬可以消耗琥珀酸鹽，使腸道中可利用的琥珀酸鹽減少，艱難梭菌是偽膜性腸炎和抗生素相關(guān)性腹瀉的病原菌，而艱難梭菌的生長十分需要琥珀酸鹽，因此考拉桿菌屬的增多可以抑制艱難梭菌的生長，從而減少此類疾病的發(fā)生。綜上可以看出五味子一定程度上提高腸道中有益菌的相對豐度，改善腸道的健康。

4 結(jié)論

與對照組相比，藏雞腸道微生物種類沒有減少，飼料中在添加五味子能增加藏雞個體間腸道微生物共有OUT數(shù)量，腸道微生物OTU變得更為相似。

在飼料中添加五味子后藏雞腸道微生物中的擬桿菌門豐度增加，厚壁菌門豐度降低。與沒有添加五味子相比，氨基酸球菌科、考拉桿菌屬的相對豐度差異顯著。

飼喂含五味子飼料后藏雞腸道微生物的多樣性升高，個體差異減小。

綜上所述，飼料中添加0.5%五味子可以改變藏雞腸道微生物結(jié)構(gòu)，有利于對藏雞腸道健康。