亞麻DMP 基因家族的全基因組鑒定與分析

李雯，趙麗蓉，張建平，劉自剛1，齊燕妮，李聞娟，謝亞萍

（1. 甘肅農業大學農學院，甘肅省干旱生境作物重點實驗室，甘肅省作物遺傳改良與種質資源創新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省農業科學院作物研究所，甘肅 蘭州 730070）

膜蛋白在細胞增殖與分化、信號轉導與識別及物質運輸等眾多生物過程中發揮重要作用［1-4］。Mori 等［5］發現定位于精子膜的擬南芥（Arabidopsis thaliana）蛋白GEX2 對精子附著并最終完成雙受精是必需的。DMPs（domain of unknown function 679 membrane proteins）家族成員是一種綠色植物特有的膜蛋白，通常含有4 個跨膜結構域，具有胞質氨基端和羧基端，參與植物生殖發育及衰老等各種生理過程［6］。目前，已經在擬南芥全基因組水平上鑒定到10 個DMP基因家族成員，不同成員在不同組織器官中具有獨特的表達模式，其中AtDMP1，AtDMP2，AtDMP3，AtDMP4和AtDMP7參與不同類型的程序性細胞死亡，包括器官衰老，角果開裂及花器官和角果的脫落，而AtDMP8和AtDMP9在雙受精過程中促進配子融合［7］。Zhong 等［8］利用圖位克隆鑒定到玉米（Zea mays）DMP基因，并且發現DMP突變植株可誘導母本單倍體的產生。雙子葉植物擬南芥AtDMP8和AtDMP9功能缺失也可誘導母本單倍體的產生，而且ZmDMP-like 蛋白在許多雙子葉植物中都很保守，序列同源性高達74%，這說明DMP基因突變可以在雙子葉植物中觸發單倍體誘導［9］。Zhu 等［10］在棉花（Gossypiumspp）中對DMP家族進行了系統分析，發現棉花DMP基因參與植物衰老及生殖過程，其中GhDMP8-A/-D和GbDMP8-A/-D可作為棉花單倍體誘導的候選基因。

亞麻（Linum usitatissimum）屬于亞麻科亞麻屬，是一種古老的韌皮纖維作物和油料作物［11］。作為人類最早栽培利用的農作物之一，亞麻在全世界被廣泛種植，主要的種植國家有中國、加拿大、美國、阿根廷等［12］。按其經濟性狀與用途可將亞麻分為油用、纖維用和油纖維兼用等3 種類型［13-15］。油用亞麻又稱胡麻，富含α-亞麻酸、木酚素、膳食纖維、蛋白質等多種營養物質，其中α-亞麻酸含量達到55%左右，是人類攝取ω-3 脂肪酸的最好來源之一。

隨著測序技術的發展，玉米［16］、高粱（Sorghum bicolor）［17］、亞麻［18］、大豆（Glycine max）［19］等多種作物完成了全基因組測序，而基因家族分析也成了挖掘功能基因的有效手段。目前，LBD（lateralorgan boundaries domain）蛋白［20］、天冬氨酸蛋白酶（aspartate protease，AP）［21］、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）［22］等基因家族在很多物種中都被鑒定出來，并進行了系統分析，而DMP基因家族在各種作物中的研究還相對緩慢，亞麻作為重要的油料及經濟作物，目前尚無相關報道。本研究旨在鑒定亞麻DMP基因，并對其進行生物信息學及表達模式分析，從而為亞麻育種及功能基因組研究提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用甘肅省農業科學院育成的胡麻品種“隴亞10 號”“黑亞14 號”“隴亞15 號”（豐產性、抗病性等綜合性狀優良）［23］作為試驗材料。供試材料于2021年3 月種植于甘肅省農業科學院蘭州試驗基地（36°03′N，103°40′E，海拔1500 m）。在開花期進行標記，分別取開花后10、20、30、40 和50 d 的種子及未成熟花藥和成熟花藥。在培養皿中萌發隴亞15 號種子，10 d 后選取生長一致的幼苗移至1/2 MS 液體培養基中，3 d 后進行脅迫處理同時更換新的培養基。分別對亞麻幼苗進行鹽脅迫（150 mmol·L-1氯化鈉）、干旱處理（20%聚乙二醇PEG）、吲哚乙酸處理（15 μmol·L-1IAA）、萘乙酸處理（5 μmol·L-1NAA）、赤霉素處理（5 μmol·L-1GA3）、高溫脅迫（45 ℃處理3 h）及低溫脅迫（4 ℃處理3 h），分別在處理后0、3、6、9、12、24、48、72 h 及恢復后48 h 取其葉片。所有樣品用液氮速凍后均保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 亞麻LuDMP 基因家族的鑒定與克隆

亞麻基因組序列從NCBI 下載（登錄號為QMEI02000000），其他基因組注釋文件下載地址為https：//doi.org/10.6084/m9. figshare.13614311.v3。利用文獻［10］報道的玉米、水稻（Oryza sativa）、葡萄（Vitis vinifera）、大豆及擬南芥DMP基因ID 號，進而通過各自基因組蛋白序列提取相應的DMP 序列，利用Blastp 在亞麻基因組中進行同源比對，并采用Pfam（http：//pfam. sanger. ac. ck/）對結構域進行確認，獲得亞麻DMP-like基因。將LuDMP 序列與玉米和擬南芥單倍體誘導相關DMP 蛋白序列進行比對，選擇同源性最高的基因作為亞麻單倍體誘導的候選基因并對其進行克隆。以隴亞10 號基因組DNA 和成熟花藥的cDNA 為模板分別進行PCR 擴增，PCR 擴增體系為50 μL：Buffer 25 μL；dNTP 10 μL；高保真酶KOD 1 μL；正向引物（10 μmol·L-1）1.5 μL；反向引物（10 μmol·L-1）1.5 μL；cDNA 模板（100 ng·μL-1）2 μL；無RNase 水9 μL。PCR 反應條件：94 ℃2 min；98 ℃10 s，60 ℃30 s，68 ℃50 s，35 個 循環；72 ℃7 min。擴增產 物經1% 瓊脂糖凝 膠電泳后 酶切回 收，之后 用Zero Blunt? TOPO? PCR Cloning Kit 連接至T 載體并轉化DH-5α，將陽性菌液進行測序。測序結果經比對分析后，將正確的基因序列上傳至NCBI 數據庫。

1.3 亞麻LuDMP 家族序列特征分析

利用ExPASy ProtParam（http：//web.wxoasy.org/protparam/）預測LuDMP 蛋白的分子量和等電點；并使用Plant-mPLoc（http：//www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/plant-multi/）和ExPASy ProtScale（https：//web. expasy.org/protscale/）分別預測LuDMP 蛋白的亞細胞定位和親疏水性，利用TMHMM-2.0（https：// services.healthtech. dtu. dk/service. php？TMHMM-2.0）預測LuDMP 蛋白的跨膜結構域。LuDMP 蛋白結構預測采用SOPMA（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page=/NPSA/npsa_sopma. html）和SWISSMODEL（https：//swissmodel. expasy. org/interactive）。利 用MEME（http：//alternate. meme-suite. org/tools/meme）分析LuDMP 蛋白的保守基序。利用PlantCARE 數據庫（http：//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）對LuDMP基因啟動子的順式作用元件進行預測。

1.4 亞麻LuDMP 家族成員的染色體分布及復制分析

LuDMP基因染色體定位及可視化采用Map Gene to Chromosome 在線軟件。利用MCScanX 分析LuDMP基因的復制事件，之后采用DnaSP 6 計算基因對之間的非同義替換率（nonsynonymous mutation rate，Ka）、同義替換率（synonymous substitution rate，Ks）和Ka/Ks，利用Ka/Ks 分析選擇壓力。用MYA=Ks/（2×6.1×10-9）×10-6計算基因對之間的分歧時間（million years ago，MYA）［24］。

1.5 DMP 蛋白的系統進化分析

利用MEGA 7.0 軟件對亞麻、擬南芥、葡萄、大豆、水稻及玉米6 個物種的DMP 蛋白序列進行比對，比對結果采用鄰接法（neighbor-joining；參數：Bootstrap 1000）構建DMP 蛋白的系統進化樹。

1.6 LuDMP 基因的表達分析

用RNA 提取試劑盒（BIOMGA）提取RNA，具體操作步驟按照說明書進行。經NanoDrop-2000 進行濃度和質量檢測后，利用TaKaRa 反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA。qRT-PCR 采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（TaKaRa）熒光定量試劑盒。PCR 反應體系為20 μL：2×mix 10 μL；上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL；cDNA 模板2 μL；無RNase 水6 μL。qRT-PCR 程序為50 ℃2 min；95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，40 個循環。每個樣品3 次重復，選取GAPDH為內參基因，運用2-ΔΔCt方法［25］計算基因的相對表達量。本研究所用轉錄組數據從NCBI 下載（登錄號為PRJNA505721），利用TBtools 繪制熱圖，本研究所用引物均見表1（由于LuDMP-1與LuDMP-7序列相似性很高，故二者所用引物相同）。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this research

2 結果與分析

2.1 亞麻LuDMP 基因家族的鑒定與系統進化分析

通過Blastp 比對，并利用Pfam 數據庫進行結構域分析，最終在亞麻基因組中鑒定到17 個DMP成員（表2）。根據LuDMP基因在染色體上的位置，將其依次命名為LuDMP-1～LuDMP-17。為深入了解LuDMP 與其他物種DMP 之間的進化關系，本研究將擬南芥、大豆、葡萄、玉米及水稻等5 個物種的DMP 蛋白序列與LuDMP 蛋白序列進行多序列比對并構建系統進化樹。結果顯示，6 個物種的DMP 蛋白可分為I、II、III、IV 和V 5 個亞族（圖1），第III 亞族DMP 數量最多，包含28 個基因，其中LuDMP 11 個，其次為第V、IV、I 亞族，分別含17、14、14 個基因，其中LuDMP 分別為0、2、2 個，第II 亞族DMP 數量最少，包含7 個基因，其中LuDMP 為2 個，每個亞族均含有單子葉與雙子葉植物DMP，而且各亞族中的DMP 蛋白具有單子葉或雙子葉特異性聚類模式。和其他雙子葉植物相比，亞麻DMP基因發生了顯著擴張。此外，第IV 亞族中的LuDMP-1和LuDMP-7與單倍體誘導基因AtDMP8、AtDMP9和ZmDMP［8-9］具 有很近的親緣關系，位于同一個 進化分 支，而 且LuDMP-1 和LuDMP-7 與AtDMP9 及ZmDMP 蛋白的同源性達到67%以上（與AtDMP8 的同源性為57%），這表明它們可能具有相同的功能，可以作為亞麻單倍體誘導的候選基因，而其余LuDMP 成員與ZmDMP 和AtDMP8 的同源性低于46%（表3）。

表3 LuDMP 基因同源性比對Table 3 LuDMP gene homology comparison

圖1 DMP 蛋白系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of DMP proteins

表2 亞麻LuDMP 成員基本特征Table 2 Basic characteristics of flax LuDMP members

2.2 亞麻單倍體候選基因LuDMP-1/7 的克隆

對LuDMP-1和LuDMP-7基因進行擴增，只擴增得到LuDMP-1基因的DNA 序列和蛋白質編碼區（coding sequence，CDS）序列，大小均為699 bp，與參考序列大小相符（圖2），將LuDMP-1基因序列上傳至NCBI，GenBank 登錄號為OM234689。

圖2 LuDMP-1 基因全長擴增Fig.2 Full-length amplification of LuDMP-1M：DL1000 marker；1：陰性 對 照；2：DNA 擴 增；3：cDNA 擴 增。1：Negative control；2：DNA amplification；3：cDNA amplification.

2.3 亞麻LuDMP 基因序列分析

亞麻LuDMP 蛋白氨基酸長度為195～240 aa，分子 量 為20946～25830 Da，等 電 點（isoelectric point，PI）為4.76～9.71，所有LuDMP 蛋白的總平均親水性（grand average of hydropathy，GRAVY）均大于0，即所有LuDMP 蛋白均為疏水性蛋白（表2，圖3）。亞細胞定位預測結果表明，除LuDMP-5 和LuDMP-8 定位于葉綠體，其余蛋白均定位于細胞膜，其中LuDMP-1、LuDMP-7 和LuDMP-14 定位于細胞膜和細胞核，LuDMP-11 定位于細胞膜和葉綠體（表2）。此外，LuDMP 蛋白均具有跨膜結構域，數量2～5 個不等（表2）。LuDMP 蛋白二級結構預測結果表明，所有LuDMP 蛋白均含有α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲以及延伸鏈（圖4）。LuDMP 蛋白種內進化關系如圖5A 所示，對LuDMP進行基因結構分析，除LuDMP-9、LuDMP-16和LuDMP-17外，其余LuDMP成員均不含內含子（圖5）。對17 個LuDMP 蛋白的保守基序進行分析，共鑒定到8 個motif，其中motif1、motif2、motif3 和motif4 在17 個LuDMP 成員中高度保守，然而一些特定的基序只存在于特定的基因中，如motif5只存在于LuDMP-4、LuDMP-6、LuDMP-13、LuDMP-15、LuDMP-16及LuDMP-17；motif7 只存在于LuDMP-4、LuDMP-6、LuDMP-13及LuDMP-15；motif6 存在于除LuDMP-2、LuDMP-3、LuDMP-10及LuDMP-12之外的所有成員中；而motif8 只存在于LuDMP-1和LuDMP-7中，推測該基序與單倍體誘導相關。

圖3 LuDMP 蛋白親疏水性預測Fig.3 Prediction of LuDMP protein hydrophilicity and hydrophobicity

圖4 LuDMP 蛋白二三級結構Fig.4 Secondary and tertiary structure of LuDMP protein

圖5 LuDMP 基因系統進化、基因結構與保守基序分析Fig.5 Phylogenetic evolution，gene structure and conservative motifs of LuDMP

2.4 LuDMP 基因染色體定位和復制分析

對17 個LuDMP基因進行染色體定位，結果顯示LuDMP-1、LuDMP-7、LuDMP-8、LuDMP-9、LuDMP-10和LuDMP-11分別位于1、7、8、10、12 和14 號染色體，LuDMP-2和LuDMP-3位于2 號染色體，LuDMP-4、LuDMP-5及LuDMP-6位于4 號染色體，LuDMP-12～LuDMP-17均在15 號染色體（圖6）。對亞麻LuDMP基因進行復制分析（表4），結果顯示有3 對基因發生串聯復制事件（LuDMP-4/LuDMP-5、LuDMP-13/LuDMP-14、LuDMP-16/LuDMP-17），8 對 基 因 發 生 片 段 復 制（LuDMP-1/LuDMP-7、LuDMP-2/LuDMP-3、LuDMP-6/LuDMP-9、LuDMP-4/LuDMP-13、 LuDMP-8/LuDMP-9、 LuDMP-8/LuDMP-11、 LuDMP-9/LuDMP-11、 LuDMP-9/LuDMP-15）。通過判斷Ka/Ks 進行選擇壓力分析，由于LuDMP-6/LuDMP-9及LuDMP-9/LuDMP-15的Ks 值為n.a.，導致Ka/Ks 及分歧時間也為n.a.，n.a. 表示這兩對基因幾乎可發生同義突變的位點都發生了同義突變，表明序列分歧度相當大，進化距離很遠。其他發生復制的基因對Ka/Ks 均小于1，表明這些LuDMP基因在進化過程中受到純化選擇。

表4 LuDMP 基因復制分析Table 4 Duplication analysis of LuDMP genes

圖6 LuDMP 基因染色體定位Fig.6 Chromosomal locations of LuDMP genes橫線代表片段復制，方框代表串聯復制。The horizontal line represents segmental duplication，and the box represents tandem duplication. Chr：染色體Chromosome.

2.5 順式作用元件分析

對亞麻LuDMP基因進行啟動子分析，發現LuDMP基因啟動子區域除含有TATA-box 等基本作用元件之外，還含有多種與光響應、激素響應、非生物脅迫響應等相關的順式作用元件（表5）。所有LuDMP基因都含有厭氧誘導必需的作用元件ARE；每個LuDMP基因至少含有一個或多個光響應元件，如Sp1 等；除LuDMP-4和LuDMP-11外，其余15 個LuDMP基因均有一個或多個植物激素響應元件，如參與生長素響應的TGA-element，參與赤霉素響應的TATC-box 和GARE-motif，參與水楊酸響應的TCA-element，參與脫落酸響應的順式作用元件ABRE，以 及 參 與 甲 基 茉 莉 酸（MeJA）響 應 的TGACG-motif 和CGTCA-motif；除LuDMP-6、LuDMP-7、LuDMP-9、LuDMP-11、LuDMP-13、LuDMP-14和LuDMP-15外，其余LuDMP基因均含有參與玉米醇溶蛋白代謝調控的順式調控元件O2-site；參與種子特異性調控的順式調控元件RY-element 只存在于LuDMP-2中；除LuDMP-3、LuDMP-4、LuDMP-15、LuDMP-16和LuDMP-17外，其他基因均含有低溫響應元件LTR；參與脫水，低溫，鹽脅迫的順式作用元件DRE 只存在于LuDMP-3中；此外，LuDMP基因啟動子區域還存在其他逆境脅迫響應元件，如參與防御和應激反應的TC-rich repeats、參與干旱誘導的MBS。

表5 亞麻LuDMP 啟動子順式元件分析Table 5 Analysis of cis-elements of flax LuDMP promoters

2.6 LuDMP 基因表達模式分析

利用隴亞10 號和黑亞14 號轉錄組數據分析LuDMP基因在不同品種、不同組織中的表達模式（圖7），除LuDMP-9和LuDMP-15外，其他15 個基因均具有表達量數據。由圖7 可知，大多數基因在兩個亞麻品種中表現為組織特異性表達。其中LuDMP-2、LuDMP-4、LuDMP-5、LuDMP-6、LuDMP-8、LuDMP-11和LuDMP-16在兩個品種果實中的表達量高于在莖中的表達量，尤其是LuDMP-4和LuDMP-5在油用品種隴亞10 號中的表達量明顯高于纖 維 品 種 黑 亞14 號，而LuDMP-1、LuDMP-3、LuDMP-7、LuDMP-10、LuDMP-12、LuDMP-13、LuDMP-14和LuDMP-17在兩個品種莖中的表達量高于果實中的表達量，特別是LuDMP-10和LuDMP-12在黑亞14 號中的表達量高于隴亞10 號。

圖7 LuDMP 在不同組織中的表達量熱圖Fig. 7 Heat map of the expression of LuDMP in different tissues

為進一步驗證LuDMP-1/7的功能，本研究分析了該基因在隴亞15 號不同發育時期的種子、未成熟花藥及成熟花藥中的表達模式。結果顯示，LuDMP-1/7基因在各組織中均有表達，但在花藥中的表達量明顯高于其他組織，尤其在成熟花藥中的表達量約為其他組織的6 倍以上（圖8）。此外，本研究發現LuDMP-1/7啟動子存在激素響應及逆境脅迫相關元件，因此分析了LuDMP-1/7在不同脅迫處理下的表達模式。結果表明（圖9），LuDMP-1/7在IAA 處理3 h 后略有降低，6 h 時表達量上升了1.4 倍左右，之后呈先降再升的趨勢，處理48 h 后表達量趨于穩定；NAA 處理后，LuDMP-1/7基因表達量呈先減后增再減的趨勢，在24 h 時表達量達到最高，較對照上升1.3 倍左右；GA3處理后，LuDMP-1/7基因表達量在12 h 時上升了約1.6 倍，之后有所降低，在恢復48 h 時又呈上升的趨勢；用NaCl 處理后，不同時期基因表達均低于對照；PEG 處理后6 h 表達量達到最高，約為對照的1.3 倍；在低溫（4 ℃）和高溫（45 ℃）處理下，LuDMP-1/7基因表達量與對照相比有顯著的提高，分別上升了約260倍和600 倍。

圖8 LuDMP-1/7 基因在種子及花藥中的表達模式Fig.8 Expression patterns of LuDMP-1/7 in seeds and anther不同小寫字母表示在0.05 水平具有顯著性差異。下同。Different small letters mean significant differences at the 0.05 level.The same below.

圖9 脅迫處理下LuDMP-1/7 的表達模式Fig.9 Relative expression patterns of LuDMP-1/7 under stress treatments恢復48 h：48 h after recovery.

3 討論與結論

DMP 蛋白是一種幾乎只存在于綠色植物中的膜蛋白，目前已經在擬南芥［7］和棉花［10］中對其進行了系統分析，此外，在水稻（20 個）、葡萄（6 個）、玉米（15個）、大豆（9 個）等多個物種中分別對其進行了鑒定［10］。本研究在亞麻基因組數據庫中篩選獲得了17 個DMP基因，不均勻分布于9 條染色體上。將亞麻DMP 蛋白與大豆、擬南芥、葡萄、水稻、玉米等5 個物種的DMP 成員一起構建進化樹，發現DMP 蛋白可分為5 個亞族，LuDMP 家族成員在5 個亞族中的數量差異很大，超過65%的LuDMP 成員（11 個）屬于第III 亞族。此外，DMP 家族在各亞族中呈現出單子葉或雙子葉特異性聚類模式，說明在單子葉植物和雙子葉植物分化前DMP基因具有共同的祖先，這與Zhu 等［10］的研究結果一致。串聯復制和全基因組復制/片段復制是基因加倍、基因功能特異性和多樣化的重要原因之一，也可能導致基因功能冗余［20，26-28］。DMP基因家族的高度擴張主要來源于幾次全基因組復制，4 個棉花種中只有3 對基因發生串聯復制，其余134 對基因都經歷了全基因組復制/片段復制［10］。LuDMP在亞麻進化過程中有3 對基因發生串聯復制，8 對基因發生片段復制事件，片段復制是促進LuDMP基因家族擴張的主要原因，這源于亞麻的兩次全基因組復制事件［18］。其中第III 亞族的擴張最明顯，有9 對基因發生了復制事件，基因占比為73.3%，而亞族I 和IV 各自僅有1 對基因發生了片段復制，說明這兩個亞族在進化中更為保守。亞麻中，發生復制的LuDMP基因對Ka/Ks 全部小于1，說明LuDMP基因在亞麻進化過程中經歷了純化選擇。對LuDMP 蛋白的亞細胞定位進行預測，發現大多數蛋白定位于細胞膜，與棉花DMP 蛋白預測結果相似［10］，擬南芥中DMP 蛋白定位于液泡膜及內質網［7］，這與DMP 蛋白的功能一致。此外，LuDMP-1、LuDMP-7、LuDMP-11 及LuDMP-14 除了定位于細胞膜，還分別位于細胞核和葉綠體，這說明DMP 蛋白還參與其他生物過程。基因結構分析顯示，大多數LuDMP基因不含內含子，與棉花DMP基因家族研究結果相似［10］，說明它們可能具有特殊的功能。保守基序分析結果表明，有4 個motif 存在于所有LuDMP 蛋白，而其他motif 只存在于特定的基因中，這些特有的motif 是導致LuDMP 蛋白功能分化的重要原因。亞麻LuDMP 蛋白具有1 個DMP 結構域及2～5 個跨膜結構域，與棉花中DMP 蛋白的研究結果相同［10］。有研究表明玉米DMP 蛋白第一個跨膜結構域發生單個氨基酸突變可誘導玉米單倍體的產生［8］。擬南芥中也有相似的研究結果，AtDMP8 和AtDMP9 蛋白第一個和第二個跨膜結構域發生突變可誘導擬南芥單倍體的產生［9］。因此，本研究推測與ZmDMP 及AtDMP8 和AtDMP9 親緣關系相近的亞麻LuDMP-1 和LuDMP-7 蛋白第一個和第二個跨膜結構域也具有相似的功能，可誘導亞麻單倍體的產生。由此可見，DMP 蛋白跨膜結構域在植物育性中起重要作用。

與傳統育種方法［29-30］相比，雙單倍體育種可在兩個世代內獲得穩定的二倍體純系，從而在很大程度上節約時間和成本。利用CRISPR 技術對單倍體誘導相關基因PLA1/MATL和DMP進行編輯可誘導單倍體的產生，這種方法已經成功應用于玉米［31-33］、水稻［34］、小麥（Triticum aestivum）［35］、擬南芥［9］等多個物種。玉米單倍體的產生主要受ZmPLA1/MTL/NLD和ZmDMP的調控［8，31-33］。水稻中OsMATL基因突變可誘導水稻單倍體的產生［34］，AtDMP8和AtDMP9突變可在擬南芥中誘導母本單倍體的產生［9］。在本研究中，亞麻LuDMP-1/7 與AtDMP8、AtDMP9 和ZmDMP 具有很近的親緣關系，位于同一進化分支，而且序列同源性達到67%以上，這說明它們可能具有相同的功能，參與植物的授粉和受精過程且能夠誘導單倍體的產生。此外，利用qRT-PCR 分析LuDMP-1/7基因在亞麻不同組織中的表達模式，發現它們在成熟花藥中的表達量最高，進一步說明它們可作為亞麻單倍體誘導的候選基因，但還需進一步對其單倍體誘導功能進行研究。

基因表達通常受到其上游啟動子區順式元件的調控。這些位于基因轉錄起始位點上游非編碼DNA 中的順式元件調節不同環境下基因的應激表達或組織特異性表達行為。因此，對參與LuDMP基因調控的順式元件進行分析，有助于了解LuDMP基因的調控機制，并預測其潛在功能。在LuDMP基因啟動子區存在許多與生長、逆境脅迫和植物激素響應相關的順式元件，其中大部分順式元件參與非生物脅迫和激素信號傳導，這與棉花DMP基因順式作用元件預測結果相似［10］。通過分析基因表達模式可初步預測基因功能。組織特異性分析結果表明，有7 個LuDMP基因在果實中的表達量高于莖中的表達量，特別是LuDMP-4和LuDMP-5在油用品種中的表達量顯著高于纖維品種，說明這些基因可能與果實發育或含油率相關；而其他8 個基因在莖中的表達量較高，尤其是LuDMP-10和LuDMP-12在黑亞14 號中的表達量高于隴亞10 號，推測它們可能參與莖的生長發育（株高、纖維合成等）。此外，由于LuDMP-1/7基因啟動子具有激素響應及非生物脅迫相關元件，推測其可能參與亞麻激素響應及逆境脅迫等生理過程。本研究中除NaCl 脅迫外，其他處理下LuDMP-1/7基因表達量均有不同程度的提高，其中基因表達量對低溫和高溫的響應最明顯，分別較對照提高了約260 倍和600 倍，表明該基因參與調控亞麻對激素和逆境脅迫的響應，但具體的功能還需進一步驗證。