44個紫花苜蓿品種的酸鋁適應性與耐受性評價

田政，楊正禹，陸忠杰，羅奔，張茂，董瑞

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

目前，全世界約有30%耕地是酸性土壤，全球范圍內有20%的玉米（Zea mays）、13%的水稻（Oryza sativa）生長在該區域，嚴重影響農業生產［1］。我國酸性土壤總面積達203 萬hm2，分布遍及南方15 個省區［2］。鋁（Al）是土壤中含量最多的金屬元素，其在地殼中平均含量約為8%［3］。鋁毒害被認為是酸性土壤中限制植物生長發育的主要因素。土壤中鋁的存在與土壤的酸堿度密切相關，當土壤pH 值低于5.5時，土壤中會溶出更多的［Al（H2O）6］3+或Al3+，影響植物的生長發育［4］。土壤酸鋁脅迫對植物的毒害癥狀主要表現為：主根伸長受到抑制，根尖、側根粗短且脆弱易斷，根冠脫落，根毛減少甚至消失，根尖表皮和外皮層細胞受到破壞等［5-6］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）被譽為“牧草之王”，是世界上栽培面積最廣的牧草，1999-2000年全世界種植面積3200 萬～3227 萬hm2［7］，我國種植面積約為135 萬hm2［8］。紫花苜蓿最適生長pH 為6.7～7.5，對酸性土壤中活性鋁極度敏感，高于0.1 mmol·L-1的鋁脅迫即可顯著抑制其發芽和生長［9］。任曉燕［10］發現鋁脅迫下紫花苜蓿幼苗的生長會受到抑制，根長、根系活力、地上生物量和地下生物量顯著降低。姜娜等［11］發現鋁對紫花苜蓿生長具有明顯的抑制作用，同時Al 處理下苜蓿會積累大量有機酸，而且不同紫花苜蓿品種間差異較大。對于鋁離子是如何激活植物中有機酸分泌，Ma 等［12］提出小麥（Triticum aestivum）和玉米有機酸陰離子的運輸是通過質膜中鋁激活的陰離子通道介導的，在葉子中積累鋁的植物，通過與有機酸形成復合物，從內部對鋁進行解毒。Barone等［13］研究發現檸檬酸合酶表達可能利于紫花苜蓿的耐鋁性。Sun 等［14］研究指出苜蓿品種對鋁的抗性表現出多樣性，敏感型的紫花苜蓿的根尖分泌檸檬酸和蘋果酸較少，而抗鋁品種會分泌較多的檸檬酸和蘋果酸。目前，植物根系有機酸的分泌被認為是植物抵御酸鋁脅迫最重要的機制之一。但這些研究多集中于小麥、玉米、水稻等糧食作物，對紫花苜蓿研究較少，關于鋁毒如何對紫花苜蓿有機酸代謝產生影響的機理仍不清楚。

因此，本研究以44 份紫花苜蓿品種為研究對象，對兩個地點紫花苜蓿產量進行分析，篩選出敏感型和耐受型品種，并以之為材料進行酸鋁脅迫試驗，測定其在脅迫前后的電導率、存活率、根系鋁含量及有機酸含量，以期為紫花苜蓿在南方酸性土壤條件下推廣提供基礎數據和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

貴州省貴陽市花溪區貴州大學試驗地（106°07′E，26°11′N，海拔1100 m），位于貴州高原中部，屬于亞熱帶季風濕潤氣候，具有明顯的高原氣候特點。年平均氣溫14.8 ℃，年均降水量1347.3 mm（數據來源于中國氣象網）。試驗地前期未種植農作物，主要以自然野生雜草為主。

貴州省銅仁市石阡縣花橋鎮北坪村試驗地（108°20′14″E，27°32′03″N，海拔614 m），位于貴州省東部，屬于中亞熱帶季風濕潤氣候，日照充足，雨量豐沛，年平均氣溫17.24 ℃，年均降水量1410.05 mm。試驗地前茬作物為玉米。

分別在上述兩個試驗地開展試驗，兩個試驗地均未種植過苜蓿屬植物。收集兩個試驗地地表約20 cm 的土壤，去除小石塊及其他雜物，烘干后磨碎過2 mm 篩，測定其土壤基礎營養組成成分和pH（表1）。

表1 兩個研究區土壤營養組成成分和pH 值Table 1 Soil physical and chemical properties in the two study areas

1.2 供試苜蓿品種

供試苜蓿品種分國內品種21 份，國外品種23 份，由蘭州大學草地農業科技學院王彥榮教授團隊提供，詳見表2。

表2 紫花苜蓿品種信息Table 2 Alfalfa species information

1.3 試驗方法

1.3.1 田間試驗 兩個地點均于2018年10 月種植紫花苜蓿，均采用隨機區組設計，兩個試驗點各品種均種植10 個單株，株行距均為50 cm，3 次重復。期間定期除草，不進行施肥和人工灌溉處理。于2020年刈割取樣，刈割時期均為初花期，測量每次刈割的干重產量以及紫花苜蓿刈割一年的總干重。測量：各品種隨機選取3 株刈割，將刈割的苜蓿植株105 ℃殺青，65 ℃烘干至恒重，電子天平稱重。

使用GenStat 7.1（2003）中基因與環境互作GGE 模型對兩個試驗點測量的44 份紫花苜蓿性狀進行綜合分析，得到44 份紫花苜蓿的綜合排名。

1.3.2 酸鋁脅迫試驗 材料為田間試驗篩選到的耐受型品種阿爾岡金和敏感型品種UC-1465。種子使用1.0%（v/v）次氯酸鈉滅菌5 min，蒸餾水沖洗5 次，25 ℃黑暗條件萌發3 d。待幼苗長至三葉期時，挑選長勢一致的幼苗，將其種植在裝有混合土壤（珍珠巖∶蛭石∶泥炭=1∶1∶2，v/v）的托盤中生長一個月，16 h/8 h（光/暗）。接著移到帶有漂浮板的Hoagland 營養液（pH 5.8）中，在25 ℃下生長兩周后，將幼苗移入不含AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2Hoagland 營養液（pH 4.3）中預處理12 h，隨后將預處理后的幼苗移入含有50 μmol·L-1AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2Hoagland 營養液（pH 4.3）中做鋁脅迫處理，對照組是不含AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2Hoagland營養液（pH 4.3），用于后續根尖結構觀察，細胞活力、鋁含量、有機酸含量測定。

1.3.3 電導率與存活率 將托盤中生長2 周的紫花苜蓿幼苗浸入不含AlCl3和含有1 mmol·L-1AlCl3（pH 4.3）的0.5 mmol·L-1CaCl2Hoagland 營養液中。每組50 株，重復3 次，連續處理6 周后計算存活率。電導率采用抽氣法測量，參照陳愛葵等［15］的做法，取葉片用蒸餾水沖洗干凈并擦干，將葉片切割成大小相同的葉塊，稱取0.1 g 于裝有6 mL 去離子水的注射器中，不斷抽提至葉片完全沉入水底，葉片在去離子水中處理3 h 后測定浸提液電導率（R1），然后金屬浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導率（R2），重復3 次。

1.3.4 根尖細胞活力及結構 脅迫處理8 h 后，收集幼苗根尖并用去離子水沖洗干凈，將一部分清洗干凈的幼苗根尖用2 μg·mL-1的FDA 溶液染色10 min，染好色的幼苗根尖用去離子水清洗附著染料，用帶有熒光裝置的立體顯微鏡（Axio Zoom.V16，德國）觀察幼苗根尖熒光強度。另一部分清洗干凈的幼苗根尖放入FAA 固定液（濃度為45%無水乙醇，6%乙酸，5%甲醛）中固定，做石蠟切片，觀察根尖橫截面結構。

1.3.5 根系鋁含量測定 脅迫處理72 h 時，將處理后的幼苗用去離子水將根沖洗干凈后，根據原子吸收法［16］并利用原子吸收光譜儀（4510F，上海）分析根系Al3+含量。

1.3.6 根系有機酸含量測定 分別取脅迫前和脅迫24 h 后各0.2 g 根尖用1 mL 0.5 mol·L-1HCl 研磨并取勻漿，將勻漿液在80 ℃下加熱20 min，偶爾搖動，冷卻后12000 r·min-1離心10 min。取上清液過0.22 μmol·L-1過濾器，采用高效液相色譜儀（HPLC，1200 Infinity LC，Agilent，美國）分析有機酸濃度。

1.4 數據統計與分析

應用Excel 2013 對試驗數據進行處理和圖表制作，應用SPSS 20.0 進行單因素ANOVA 分析。

2 結果與分析

2.1 44 份紫花苜蓿品種產量分析

由表3 可知，2020年在貴陽研究區干草產量最高的5 個苜蓿品種為WL363HQ、阿爾岡金、WL354HQ、Boja 、Trifecta，總干重分別為653.38、564.15、544.17、542.40、522.56 g；干草產量最差的5 個品種為UC-1465、Orca、隴東苜蓿、三得利、中蘭1 號苜蓿，總干重分別為84.31、153.22、173.73、190.76、192.54 g。在石阡研究區干草產量最高的5 個苜蓿品種為阿爾岡金、Trifecta、新疆大葉苜蓿、中牧1 號苜蓿、Vernal，總干重分別為464.91、429.94、378.21、351.74、350.40 g；干草產量最差的5 個品種為UC-1465、隴中苜蓿、CUF 101、中苜1 號苜蓿、隴東苜蓿，總干重分別為150.97、161.55、162.25、167.90、168.28 g。在兩個研究區產量最高的5 個品種與最低的5 個品種之間均達到顯著（P＜0.05）差異。

表3 44 份紫花苜蓿品種干重方差分析Table 3 Analysis of variance of dry weight of 44 alfalfa varieties（g·plant-1·a-1）

2.2 44 份紫花苜蓿綜合性評價

利用基因與環境互作GGE 模型對貴陽試驗地與石阡試驗地收獲的44 份紫花苜?？偢芍匦誀钸M行分析，排名前五的分別為阿爾岡金、新疆大葉苜蓿、Trifecta、Vernal、中牧1 號苜蓿，后五名分別為隴中苜蓿、東苜1 號苜蓿、隴東苜蓿、CUF 101、UC-1465（表4）。根據綜合分析結果，選擇阿爾岡金作為酸鋁脅迫耐受型品種，UC-1465 為酸鋁脅迫敏感型品種開展后續試驗。

表4 44 份紫花苜蓿田間試驗綜合排名Table 4 Comprehensive ranking of 44 alfalfa field trials

2.3 電導率與存活率分析

經AlCl3連續處理六周后UC-1465 電導率顯著（P＜0.05）高于阿爾岡金，分別為468.0 和253.5 mS·cm-1。對照組中的阿爾岡金和UC-1465 的存活率分別為92%和88%，經過AlCl3處理后的阿爾岡金存活率可達64%，UC-1465 的存活率僅為10%，阿爾岡金的存活率顯著（P＜0.05）高于UC-1465（圖1）。

圖1 鋁脅迫對紫花苜蓿相對電導率和存活率的影響Fig.1 Effect of Al stress on the relative conductivity and survival rate of alfalfa大寫字母代表不同鋁濃度脅迫間的差異性（P＜0.05）；小寫字母代表不同品種間的差異性（P＜0.05）。下同。The capital letters represent the differences（P＜0.05）among different aluminum concentration stress；The lowercase letters represent the differences（P＜0.05）among different varieties.The same below.

2.4 根尖細胞活力及結構

未經脅迫的阿爾岡金和UC-1465 根尖熒光均較強，脅迫后兩者根尖熒光強度均降低，且UC-1465 的根尖熒光強度弱于阿爾岡金（圖2Ⅰ）。未經脅迫的兩個品種根尖表皮細胞結構完整，無細胞增大及破損現象，脅迫后阿爾岡金根尖表皮細胞較完整，細胞壁較對照出現增厚；UC-1465 根尖表皮細胞破損，細胞增大（圖2Ⅱ）。

圖2 紫花苜蓿鋁脅迫前后根尖細胞活力及結構Fig.2 Cell changes of alfalfa before and after Al stressⅠ：熒光強度，標尺0.2 mm Fluorescence intensity，ruler 0.2 mm；Ⅱ：根尖橫截面結構，標尺50 μm Root cross-sectional structure，ruler 50 μm.

2.5 根系鋁含量

在對照組中阿爾岡金和UC-1465 的Al 含量分別為36.37 和50.01 μg·g-1；經過50 μmol·L-1AlCl3處理后的阿爾岡金和UC-1465 的鋁含量分別為72.71 和112.70 μg·g-1，處理組中UC-1465 和阿爾岡金根系的Al 含量均顯著（P＜0.05）增加，且UC-1465 的根系Al 含量顯著（P＜0.05）高于阿爾岡金（圖3）。

圖3 鋁脅迫對UC-1465 和阿爾岡金根系Al 濃度的影響Fig. 3 Effect of Al stress on Al concentration in roots of UC-1465 and Algonquin

2.6 根系有機酸含量測定

與對照相比脅迫后兩個品種的有機酸含量均有增加，如圖4 所示：脅迫前阿爾岡金和UC-1465 的草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、反丁烯 二 酸 含 量 分 別 為248117.16 μg·mL-1、705.03 μg·mL-1、70.84 μg·mL-1、441.87 μg·mL-1、162.44 μg·mL-1、99.58 μg·mL-1、3111.92 μg·mL-1、984.60 μg·mL-1和114474.70 μg·mL-1、176.66 μg·mL-1、33.36 μg·mL-1、408.16 μg·mL-1、65.32 μg·mL-1、58.27 μg·mL-1、2309.79 μg·mL-1、818.70 μg·mL-1，脅迫后草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、反丁 烯 二 酸 含 量 分 別 為308731.41 μg·mL-1、5475.61 μg·mL-1、290.29 μg·mL-1、702.96 μg·mL-1、249.93 μg·mL-1、3122.88 μg·mL-1、3119.34 μg·mL-1、1346.66 μg·mL-1和303701.88 μg·mL-1、5047.51 μg·mL-1、143.81 μg·mL-1、572.42 μg·mL-1、206.91 μg·mL-1、2371.91 μg·mL-1、2366.58 μg·mL-1、1178.73 μg·mL-1，相比于酸鋁處理前兩個品種的草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、反丁烯二酸含量均顯著增高（P＜0.05），乳酸含量雖有增加，但不顯著；在酸鋁脅迫24 h 后，阿爾岡金的蘋果酸含量顯著（P＜0.05）高于UC-1465。

圖4 紫花苜蓿根系鋁處理0、24 h 的有機酸含量Fig.4 The content of organic acids in alfalfa roots treated with aluminum at 0 and 24 h

3 討論

3.1 紫花苜蓿適應性評價

李文英等［17］研究表明不同經緯度種植的蒙古櫟（Quercus mongolica）其表型性狀與地理氣候因子存在顯著或極顯著的相關關系，說明植物的生長主要受到基因及環境的綜合作用。關于基因與環境的互作，不同作物品種都有其最適宜的種植和推廣區域，本研究對紫花苜蓿兩地一年多品種產量進行綜合評價，能真正反映不同品種的適應性，從而獲得準確的結果。本研究對貴陽和石阡44 份紫花苜蓿品種測量的總干重綜合評價，得到5 個產量高且適應性強的紫花苜蓿品種，分別為阿爾岡金、新疆大葉苜蓿、Trifecta、Vernal 和中牧1 號苜蓿；這與劉明秀［18］、莫本田等［19］、柳海鷹［20］的研究結果有差異，這可能與品種特性、生境條件、種植密度、栽培方式和刈割次數的不同有關。

3.2 兩個品種的抗鋁性評價

王運琦等［21］研究發現，紫花苜蓿的存活率會隨著脅迫濃度的增大而變小；Tamás 等［22］觀察到Al 處理24 h 后大麥（Hordeum vulgare）根尖相對鋁含量呈上升趨勢；Silva 等［23］觀察到小麥根尖Al 處理24、72 h 后耐鋁品種和敏感品種根尖鋁含量均上升，且敏感型大于耐受型。本研究發現，鋁脅迫前后兩個品種根尖結構發生變化，敏感型細胞結構被破壞，導致其根系喪失對重金屬離子的防御功能，電導率顯著增大，這與前人研究結果一致［14，24-25］。

3.3 有機酸在鋁抗性中的作用

大量研究表明，鋁脅迫下根系分泌有機酸是植物耐受鋁的主要機制之一。Liao 等［26］的研究得出檸檬酸、蘋果酸、草酸是植物抵御鋁脅迫的重要機制。根系分泌的有機酸可絡合鋁離子，有機酸是關鍵的鋁解毒劑［27］。檸檬酸和蘋果酸是大多數植物根尖適應鋁毒性所分泌的主要有機酸［28-30］。Silva 等［23］對不同基因型大豆（Glycine max）進行Al 處理，前6 h 所有基因型的檸檬酸和蘋果酸外排均增加，但只有耐鋁基因型的檸檬酸和蘋果酸外排持續時間較長。Ling 等［31］研究發現鋁脅迫會促進黑麥（Secale cereale）分泌檸檬酸，鋁脅迫濃度越高，時間越長，檸檬酸分泌量越大。Miyasaka 等［30］研究表明，鋁脅迫下耐受型菜豆（Phaseolus vulgaris）品種分泌的檸檬酸是對照組的70 倍，且耐受品種分泌的檸檬酸含量較敏感品種高10 倍。Yang 等［32］研究也發現，鋁脅迫下，耐受型品種分泌的檸檬酸比敏感品種高。本研究中，Al 處理下阿爾岡金與UC-1465 的根系檸檬酸、蘋果酸、乙酸、酒石酸、反丁烯二酸、草酸和琥珀酸分泌均顯著（P＜0.05）增加，表明紫花苜?？赏ㄟ^分泌有機酸來緩解鋁毒。同時，阿爾岡金與UC-1465 根系檸檬酸分泌量增加最為明顯，說明檸檬酸可能是紫花苜蓿緩解鋁毒的主要解毒劑，這與Takashi等［33］、Wu 等［34］、Dai 等［35］、Liu 等［36］、Yang 等［37］的研究結果一致。

此外，本研究發現脅迫前后兩個品種間僅蘋果酸差異達到顯著水平。而Sun 等［14］對不同耐鋁性紫花苜蓿品種進行鋁脅迫研究，結果表明耐受型品種檸檬酸含量顯著高于敏感型品種，而蘋果酸無顯著（P＞0.05）差異，本研究結果與其不一致。結果表明，不同紫花苜蓿品種有機酸合成與分泌存在差異，且耐受型紫花苜蓿防御酸鋁脅迫策略不同為后續研究提供了新的思路。

4 結論

通過兩個試驗點的產量分析，從44 份紫花苜蓿品種中篩選出阿爾岡金、新疆大葉苜蓿、Trifecta、Vernal 和中牧1 號苜蓿5 個強適應品種。紫花苜蓿對酸鋁脅迫的響應主要通過檸檬酸、蘋果酸、乙酸、酒石酸、反丁烯二酸和草酸的顯著（P＜0.05）增加來體現，所以有機酸（尤其是蘋果酸）的合成和分泌增多可能是其耐酸鋁脅迫的重要原因。