補骨脂酚對鏈脲佐菌素誘導的大鼠糖尿病心肌病保護機制研究

康永建 鄭權友 王兮

1.陸軍第九五八醫院麻醉科，重慶 400000；2.陸軍第九五八醫院泌尿外科，重慶 400000；3.陸軍第九五八醫院呼吸內科，重慶 400000

糖尿病是一種以長期高血糖為特征的慢性內分泌代謝性疾病，心臟損傷是其主要并發癥和死亡原因之一[1]。高血糖引起的糖尿病心肌病，是指在無高血壓、無明顯器質性疾病的情況下，心肌功能障礙的一種特殊形式[2]，其發展緩慢并隱匿，病理特征表現為心肌細胞凋亡，間質纖維化及左室功能障礙[3]。補骨脂酚是一種具有生物活性單萜苯酚，可從豆科植物補骨脂的種子獲得[4]。近來研究表明，補骨脂酚具有廣泛的藥理學作用，包括抑菌、抗感染、抗衰老、抗腫瘤等效應[5-9]。研究指出，補骨脂酚可抑制脂多糖引起的心肌細胞凋亡[10]，但其能否預防糖尿病心肌病引起的心肌凋亡鮮見報道。本研究采用糖尿病心肌病大鼠，探討補骨脂酚對糖尿病心肌病的保護作用及其信號通路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取45 只8 周齡雄性SPF 級SD 大鼠（體重180～220 g），由陸軍軍醫大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK（渝）20170002。經實驗動物福利倫理審查委員會審核通過（AMUWEC9031）。45%高糖高脂飼料（high sugar and fat diet，HFD）（南通特洛菲飼料科技公司）；BAK（Sigma-Aldrich-SMB00604）；鏈脲佐菌素（Sigma-Aldrich-S0130）；TUNEL（Roche-11 684809910）。DAPI（Sigma-Aldrich-D9542）。兔抗Bcl-2抗體（Proteintech-26593-1-AP），兔抗Bax 抗體（CST-14796），兔抗caspase-3 抗體（CST-9662），兔抗Cleaved caspase-3 抗體（CST-9661）及鼠抗β-actin 抗體（CST-3700），辣根過氧化物酶標記的二抗山羊抗兔（Proteintech-SA00001-4）、山羊抗鼠抗體（Proteintech-SA00001-1）。使用儀器包括：超高頻分辨小動物超聲成像系統（Visual Sonics，Vevo 2100），高分辨率顯微鏡（ZEISS，X-Cite SERIES-120Q）。蘇木精-伊紅染色試劑盒（C0105S）及4%多聚甲醛（P0099-500 ml）購于上海碧云天生物技術有限公司，Masson 染色試劑盒（BSBA-4079A）購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組和處理 將45 只大鼠按照隨機數字表法分為三組，每組15 只。①糖尿病組[11]：HFD 飲食4 周后每日腹腔注射鏈脲佐菌素（50 mg/kg），持續注射3 d 后，檢測隨機血糖≥16.7 mmol/L 認為建模成功，繼續HFD 喂養8 周；②補骨脂酚組：造模方法與糖尿病組相同，建模成功后，繼續HFD 飼料喂養8周，每天灌胃攝入補骨脂酚（60 mg/kg）至觀察終點；③對照組：正常飲食4 周后連續3 日腹腔注射生理鹽水，繼續正常飲食8 周。糖尿病組、補骨脂酚組動物均建模成功，干預期間三組動物未出現死亡。

1.2.2 糖耐量實驗 鏈脲佐菌素腹腔注射1 周后，三組空腹12 h 經口予葡萄糖（2 g/kg）。在0、30、60、90、120 min 記錄血糖值，繪制折線圖。

1.2.3 心臟超聲 三組行吸入麻醉（3%異氟烷）后備皮，仰面置于溫控臺，power Lab 數據采集分析系統監測心率。利用超高頻分辨小動物超聲成像系統Vevo 2100 評價三組心臟功能。

1.2.4 心肌蘇木精-伊紅染色、Masson 染色及TUNEL染色檢測 取大鼠心臟，PBS 洗凈后固定于4%多聚甲醛24 h。常規脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟。按蘇木精-伊紅染色和Masson 染色試劑盒步驟進行染色、封片，普通光鏡觀察并拍照。標本常規脫蠟后，按TUNEL試劑盒說明書行心肌凋亡檢測。20 倍鏡下隨機選擇5 個以上不重復的視野，統計心肌細胞凋亡指數。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白PBS 將大鼠心臟灌洗干凈，-80℃冰箱保存。取各組心臟組織研磨，加入裂解液，提取蛋白。BCA 法測定各組樣本蛋白濃度后加入緩沖液調整各組蛋白濃度一致。采用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉膜至PVDF 膜。牛奶封閉后，按1∶1 000 稀釋相關蛋白（Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、caspase-3）1∶5 000 稀釋β-actin 作內參孵育一抗12 h。TBST 洗脫后孵育二抗1 h，再使用TBST洗脫。最后通過蛋白質印跡法成像系統顯影。

1.3 統計學方法

選擇Prism Graphpad 軟件行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血糖及心功能指標比較

糖尿病組各時間點血糖曲線下面積高于對照組，心臟左室射血分數、左室短軸縮短率低于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。補骨脂酚組各時間點血糖曲線下面積低于糖尿病組，左室射血分數、左室短軸縮短率高于糖尿病組，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖1。

圖1 三組血糖及心功能指標比較（n=15）

2.2 三組心臟組織病理改變

糖尿病組心肌排列紊亂，血管周圍膠原纖維明顯增多，補骨脂酚組心肌紊亂現象改善，血管周圍膠原纖維明顯減少。見圖2。

圖2 三組心臟組織病理改變（bar=50 μm）

2.3 三組心肌細胞凋亡情況及相關蛋白表達水平比較

糖尿病組Bcl-2 低于對照組，心肌細胞凋亡指數、Cleaved caspase-3/caspase-3、Bax 表達水平高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。補骨脂酚組心肌細胞凋亡指數、Cleaved caspase-3/caspase-3、Bax、Bcl-2 表達低于糖尿病組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3～4。

圖3 三組心肌細胞凋亡指數比較（n=5）

3 討論

據測算，2045 年全球糖尿病患者將超過6億[12]，糖尿病心肌病為其重要致死性并發癥之一[13-14]。目前治療方案主要基于標準心力衰竭藥物和口服抗糖尿病藥[15]，臨床亟須針對糖尿病心肌病的藥物。補骨脂酚作為一種具有生物活性的提取物，可改善糖尿病引起的心肌組織氧化應激損傷[16-18]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠8 周后心功能降低，心肌出現纖維化，給予補骨脂酚可有效改善心功能，減輕心肌組織纖維化，具體保護機制與其抗心肌細胞凋亡有關。

細胞凋亡由兩種途徑組成，即外源性和內源性凋亡，心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病重要機制之一，因此抑制心肌細胞凋亡在糖尿病心臟保護領域極具意義[19]。研究發現，內源性凋亡在糖尿病心肌病的進展中發揮重要影響。內源性細胞凋亡是由線粒體外膜通透性啟動的[20-21]，線粒體外膜通透性受到Bcl 家族的嚴格控制，其中就包括了抗凋亡蛋白Bcl-2[22]、促凋亡蛋白Bax[23]，而抗凋亡機制的失衡最終會導致caspase-3 激活，出現凋亡形態小體[24-25]。抑制糖尿病心肌細胞過度凋亡，已成為治療糖尿病心肌病的重要干預策略。本研究進一步檢測發現，補充補骨脂酚可抑制糖尿病心肌細胞凋亡信號通路，降低Bax 及Cleaved caspase-3 蛋白表達，從而保護心功能。本研究存在一定的不足：①研究所采用的糖尿病模型，未設置陽性藥物組。②未設置補骨脂酚濃度梯度給藥組。本研究只采用了主流劑量給藥，雖得到陽性結果，但對不同濃度藥物的保護效果觀察存在缺失，后續將進一步完善實驗設計。

圖4 三組心肌凋亡相關蛋白表達水平比較（n=5）

綜上所述，本研究發現補骨脂酚可顯著抑制糖尿病引起的心肌細胞凋亡通路，減少凋亡，改善心功能，為補骨脂酚相關藥物的開發和臨床研究提供了實驗依據。