川芎-赤芍治療下肢動脈硬化閉塞癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制

蔡金濤，李華剛

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230038

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliteran，ASO）以下肢涼、疼痛、麻木、間歇性跛行為臨床表現(xiàn)的疾病，病變部位多發(fā)生于大、中動脈，尤其為腹部主干血管以下的分叉起始端。其發(fā)病率與年齡成正相關(guān)，70歲以上發(fā)病率在15%-20%，男性患者多于女性[1]。中醫(yī)將該病稱為“脈痹”、“脫疽”，本病病因多為寒邪侵襲、外傷、飲食不節(jié)，病位在血脈，涉及肝、脾、腎，血脈瘀阻或氣血虧虛，導(dǎo)致下肢失養(yǎng)[2]。

我院國家級名老中醫(yī)周玉朱在臨床中運用自擬的“丹參化瘀湯”治療ASO，其對ASO的治療收到了較為滿意的效果。其方可活血化瘀，通絡(luò)止痛，但其具體機制尚不明確。

在丹參化瘀湯中，川芎辛溫香燥為血中氣藥，走而不守，能入血分，下行可達血海，適宜瘀血阻滯各種病癥。赤芍苦微寒，清熱涼血，活血祛瘀，二者相互配合而發(fā)揮重要作用。因此，本研究選取藥對川芎、赤芍，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析其治療下肢動脈硬化閉塞癥的作用機制，以期為丹參化瘀湯相關(guān)臨床應(yīng)用提供潛在機制。

方 法

1 川芎-赤芍藥對有效成分篩選

TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）挖掘，檢索標準設(shè)定為口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，篩選川芎、赤芍的潛在有效成分，并檢索文獻補充。通過輸入2味中藥的名稱，篩選得到有效藥物成分所對應(yīng)的靶點。通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進行靶點蛋白-人類基因名稱轉(zhuǎn)換，從而得到川芎、赤芍兩味中藥的作用靶點。

2 下肢動脈硬化閉塞癥相關(guān)靶點篩選

以“arterial occlusive”為關(guān)鍵詞，在 GeneCards數(shù)據(jù)庫、 OMIM 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫、PharmGkb數(shù)據(jù)庫以及 DrugBank 數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得疾病相關(guān)靶點。將各個數(shù)據(jù)庫所得到的的靶點信息導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，并用 R軟件（https：//cran.r-project.org/mirrors.html）構(gòu)建疾病相關(guān)基因合并的venn圖。再將川芎、赤芍成分作用靶點和下肢動脈硬化閉塞癥相關(guān)的疾病靶點利用R軟件進行映射構(gòu)建venn圖，篩選出中藥-疾病的共同靶點。

3 化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物有效化學(xué)成分與疾病的共同靶點基因?qū)隒ytoscape3.8.0軟件，進行圖像可視化處理。

4 川芎-赤芍藥對治療下肢動脈硬化閉塞癥的核心靶點篩選

將藥物關(guān)鍵化學(xué)成分與疾病的共同靶點，運用STRING 數(shù)據(jù) 庫（https：//string-db.org/），在“Multiple Proteins”中將篩選出的共同靶點輸入“l(fā)ist of names”，其中種類設(shè)為“Homo sapiens”，在設(shè)置中選擇“highest confidence（0.9）”。構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)模型，導(dǎo)出 png圖片和tsv文件。將tsv文件導(dǎo)入Cytoscape軟件中，通過Network Analyse功能分析其網(wǎng)絡(luò)，篩選節(jié)點度值（Degree）分布、接近中心性（Closeness centrality）、介數(shù)中心性（Betweenness centrality）均在中位數(shù)以上的作為“核心靶點”。通過篩選最后得到MAPK14、AKT14、RELA、TP5等共17個PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

5 基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

利用R軟件對上述得到的核心靶點進行entrezID的轉(zhuǎn)換，再將轉(zhuǎn)換的ID通過R軟件進行GO富集分析和KEGG富集分析，以此獲得川芎、赤芍治療下肢動脈硬化閉塞癥的GO富集分析及KEGG富集分析。將靶點基因、GO生物功能、KEGG信號通路導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，繪制核心靶點-信號通路-生物功能圖。

結(jié) 果

1 川芎-赤芍藥對有效成分及靶點的篩選

TCMSP平臺共收錄赤芍的主要化學(xué)成分為119個，川芎主要化學(xué)成分為189個，符合篩選條件的赤芍有效成分29個，川芎有效成分為7個，其中谷甾醇是兩者共有的成分，具體有效化合物的相關(guān)信息如表1所示。運用TCMSP中的Related Targets篩選到作用靶點赤芍682個、川芎1356個。篩選與有效成分相關(guān)的靶點并去除重復(fù)后共獲得靶點201個。

表1 川芎-赤芍化合物相關(guān)信息

2 下肢動脈硬化閉塞癥相關(guān)靶點的篩選

輸入“arterial occlusive”，得到不同數(shù)據(jù)庫的疾病靶點基因，刪除每個數(shù)據(jù)庫中及相互之間的重復(fù)基因，最終得到疾病基因，其中GeneCards 1916個，OMIM 1 個，PharmGkb 76 個，TTD 70 個，DrugBank 2個，并繪制venn圖。見圖1。將其與藥物靶點基因進行對應(yīng)，得到藥物-疾病共同靶點基因共63個，并繪制venn圖。見圖2。五個數(shù)據(jù)庫共獲得靶點2065個，篩除重復(fù)靶點后最終獲得靶點數(shù)量1984個。

圖1 疾病靶點venn圖

圖2 川芎-赤芍治療ASO venn圖

3 川芎-赤芍藥對治療下肢動脈硬化閉塞癥的關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件將藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病-靶點基因網(wǎng)絡(luò)進行可視化處理。 圖中矩陣代表靶點，倒三角代表化合物，其中不同顏色代表化合物來源于不同的藥物。見圖3。

圖3 藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

4 PPI分析及核心靶點篩選

將藥物靶點與疾病靶點取交集后獲得治療靶點數(shù)量為63個，通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得靶蛋白相互作用信息，并導(dǎo)出tsv文件及png圖，如圖4所示。圖中共有節(jié)點46個，邊120條。將tsv文件導(dǎo)入Cytoscape中對網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點的拓撲參數(shù)篩選節(jié)點度值（Degree）分布、接近中心性（Closeness centrality）、介數(shù)中心性（Betweenness centrality）進行分析篩選，共得到核心靶點17個，見表2。包括絲裂原激活蛋白激酶 14（MAPK14）、p53 基因（TP53）、絲氨酸 /蘇氨酸激酶1（AKT1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）等。

表2 核心靶點拓撲分析表

圖4 川芎-赤芍治療下肢動脈硬化閉塞癥PPI圖

5 GO 富集分析和 KEGG 通路富集分析

使用R軟件對核心靶點分別進行GO富集分析與KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示，川芎、赤芍兩味中藥富集到的BP包括：活性氧代謝過程、活性氧代謝過程的調(diào)控、對類固醇激素的反應(yīng)等生物學(xué)過程，富集到的CC包括：RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等細胞成分，富集到的MF包括：脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核心啟動子序列-特異性DNA結(jié)合、脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性等分子功能。與ASO相關(guān)的KEGG通路主要包括流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路等信號通路發(fā)揮治療下肢動脈硬化閉塞癥的作用。見圖5和圖6。并通過Cytoscape軟件構(gòu)建成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖7。

圖5 川芎-赤芍治療ASO的GO富集分析

圖6 川芎-赤芍治療ASO的KEGG富集分析

圖7 成分靶點通路網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

下肢動脈硬化閉塞癥是由于下肢動脈粥樣硬化斑塊形成，引起下肢動脈狹窄、閉塞，進而導(dǎo)致肢體慢性缺血。其發(fā)病機制尚不明確，主要的包括損傷及平滑肌細胞增殖學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、血流動力學(xué)學(xué)說、遺傳學(xué)說、炎癥反應(yīng)等有關(guān)。中醫(yī)認為血瘀為該病的主要矛盾[3]，活血化瘀應(yīng)貫穿于整個治療過程之中，大部分醫(yī)家皆認可。

丹參化瘀湯是我院治療ASO的有效經(jīng)驗方劑[4]，其中川芎、赤芍的配伍是此方必不可少的藥對之一，川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，為血中之氣藥。赤芍活血化瘀止痛，兩藥相配伍，既可活血化瘀，又可行氣止痛。本次研究即是通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對川芎-赤芍藥對治療ASO的作用機制進行分析。

川芎中的有效成分可有效拮抗血小板聚集，改善血液黏稠度，還能擴張血管，能夠有效增加下肢血流量、腦動脈流量[5]。赤芍的有效成分可抑制人類成纖維樣滑膜的增殖，從而抑制炎癥，以及保護神經(jīng)、抗腫瘤、抗氧化等作用[6]。

本次通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，發(fā)現(xiàn)川芎赤芍藥對中的β谷甾醇、鞣花酸、（+）兒茶素、芍藥苷、黃芩素、楊梅酮等可能抗ASO的主要成分。

谷甾醇是川芎和赤芍的共有化合物，具有降脂、抗炎、清除自由基活性、參與免疫調(diào)節(jié)等。Yuan，Chuanxun[7]等研究發(fā)現(xiàn)提示β-谷甾醇和β-谷甾醇亞油酸酯（SELA）不同的載藥方式可以促進小鼠總脂質(zhì)和膽固醇的排泄。這可能是由于β-谷甾醇與膽固醇的分子結(jié)構(gòu)相似，在小腸腔內(nèi)取代了膽汁酸微膠束中的膽固醇，降低了膽固醇的吸收利用。Kasirzadeh[8]等觀察到用1mg/kg劑量的β-谷甾醇治療兩天導(dǎo)致CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠血清中的促炎細胞因子顯著減少。在用β-谷甾醇治療的大鼠中，TNF-α和NF-κBi的肝臟表達也降低了。β-谷甾醇靶向NF-κB作為細胞因子級聯(lián)的主要調(diào)節(jié)因子，并在很大程度上抑制炎癥反應(yīng)。Jiang，Yue-Hua[9]等研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇表現(xiàn)出優(yōu)異的直接內(nèi)皮保護作用，可顯著抑制細胞凋亡，增加細胞遷移，改善HAECs的線粒體功能。此外，β-谷甾醇減輕了細胞骨架，降低了VE-鈣粘蛋白的密度并改善了細胞形態(tài)。鞣花酸通過抑制ROS生成和調(diào)節(jié)PI3K/Akt/eNOS 信號通路在oxLDL刺激的內(nèi)皮細胞中引起抗凋亡作用[10]。在葡聚糖-兒茶素處理的HMEC-1細胞中，ATOX-1水平顯著下調(diào)[11]。證明了葡聚糖-兒茶素的強效抗血管生成特性。由此可以推斷β-谷甾醇、鞣花酸、兒茶素可以通過抑制炎癥反應(yīng)、降低了膽固醇的吸收利用、抗凋亡作用、強效抗血管生成來治療ASO。

本研究提示藥物的有效成分主要作用于MAPK14、AKT1、PPARG、TNF、RELA、TP53等靶點，參與的通路主要包括流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路等。

流體剪切應(yīng)力表示血液流動在血管壁的內(nèi)皮表面施加的摩擦力。血管暴露于剪切應(yīng)力，尤其是內(nèi)皮細胞似乎是主要的傳感器，因為它們位于血液和血管壁之間的內(nèi)表面。此外內(nèi)皮細胞暴露于剪切應(yīng)力會刺激內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）產(chǎn)生一氧化氮（NO），能引起細胞內(nèi)鈣的急劇而短暫的升高，增強鈣調(diào)蛋白與eNOS的結(jié)合，從而增加eNOS活性[12]。腫瘤壞死因子信號通路是宿主防御的一個非常重要的組成部分，在各種類型的損傷和刺激后會迅速釋放。TNF-α在激活內(nèi)皮細胞和上調(diào)粘附分子中具有重要作用[13]。TNF-α參與對病變中不同細胞類型的多種作用，例如粘附分子表達和泡沫細胞形成。通過TNF結(jié)合蛋白阻斷TNF-α或通過IL-1受體拮抗劑阻斷IL-1可部分保護apoE敲除小鼠免受動脈粥樣硬化的影響。在MAPK信號通路中，miR-26a過表達能抑制p38MAPK的激活并下調(diào)VEGF表達，而miR-26a的沉默具有相反的效果[14]。VEGF是最有效的血管生成因子之一，它增加血管通透性和血管內(nèi)皮細胞存活，p38MAPK的激活在調(diào)節(jié)VEGF水平中發(fā)揮作用。IL-17通過增強VEGF的表達，促進腫瘤內(nèi)血管新生和炎癥的發(fā)生[15]，從而參與調(diào)控血管新生的過程。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對丹參化瘀湯湯中的“川芎-赤芍”藥對進行分析，發(fā)現(xiàn)抗炎是該藥對治療ASO的主要方式，此次研究佐證了前期對川芎-赤芍藥對治療 ASO的研究結(jié)論，通過篩選得到的靶點和相關(guān)信號通路為后續(xù)的研究提供了研究方向。因本研究缺少相關(guān)的實驗驗證，具有一定的局限性，是否與上述靶點和信號通路有關(guān)，需要進一步驗證。