桃細菌性穿孔病的接種方法與不同品種抗性鑒定研究

董京萍，范若渝，王友德，楊麗娜，朱峰，紀兆林*

(1.江蘇省揚州大學植物保護學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省揚州市儀征市陳集鎮人民政府，江蘇揚州 211408)

桃(Prunusperica)隸屬薔薇目(Rosales)薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)，是中國十分重要的經濟作物，因其獨特的風味和豐富的營養，深受人們的喜愛。中國是世界上最大的桃生產國，同時也是世界上最大的桃消費國，年產量和消費量均達1 300多萬t[1]。近幾年，桃樹上病蟲害的發生率逐漸增加，目前常見的病蟲害達到20多種[2]，其中桃細菌性穿孔病(peach bacterial shot hole)在各桃產區中均廣泛發生，嚴重影響當年的坐果率和果實品質[3]。

桃細菌性穿孔病也被稱為桃細菌性黑斑病(peach bacterial black spot)或桃細菌性斑點病(peach bacterial spot)，最早于1903年被Smith從北美的李(Prunussalicina)中發現[4]，病原為樹生黃單胞李致病變種(Xanthomonasarboricolapv.pruni, Xap)，被歐盟植物檢疫條例列為檢疫對象。它的寄主主要是桃、李、杏和櫻桃等李屬植物[5]。Xap可以潛伏在桃樹枝梢、腋芽和葉痕等組織中越冬，次年春季溫度升高，越冬后的細菌開始繁殖，并在越冬部位進行初侵染形成病斑，病菌經雨水從病部溢出，隨后借助風雨和昆蟲傳播到葉片、枝梢和果實上進行再侵染[6]。

為更加明確桃細菌性穿孔病的致病機理及防治方法，對桃樹葉片、枝條和果實等部位開展室內接種實驗。桃樹離體葉片接種方法主要包括傷口法、注射法、噴霧法等，在實際應用中哪種方法更有效尚無定論。為此，筆者對幾種常見的離體葉片接種方法進行比較，從而選出符合實驗室條件下接種桃細菌性穿孔病菌的最適方法；并利用該方法，明確江蘇省常見桃樹品種對細菌性穿孔病的抗性，為果農選擇桃樹品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株是從國內桃產區采集、分離、純化、鑒定獲得[7]，從中選擇6個作為供試菌株。表1為6個供試Xap菌株的來源和菌株編號。

表1 桃細菌性穿孔病病菌分離株的來源與編號

供試桃品種：春雪和中桃9號(屬早熟毛桃品種)、中油16號(屬早熟油桃品種)、中油18號(屬早熟黃肉油桃品種)、中桃5號(屬中熟毛桃品種)、湖景蜜露(屬中熟水蜜桃品種)、錦繡黃桃(屬晚熟黃桃品種)。除湖景蜜露采集于本實驗室溫室盆栽桃苗，其他品種均采集于儀征市友德家庭農場桃園。

供試培養基：牛肉膏蛋白胨培養基(NB)，蔗糖10 g、酵母粉1 g、牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨5 g，加入900 mL超純水攪拌至完全溶解，用5 mol/L的NaOH調節pH值至6.8，最后定容至1 L，高溫高壓(121 ℃，110 kPa)滅菌備用；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(NA)是在1 L NB培養基中加入15 g瓊脂后滅菌備用。

1.2 配置菌懸液

將上述菌株用接種針通過平板劃線法于NA培養基上活化，取單菌落加入至NB培養基中，置于180 rpm、28 ℃的振蕩培養箱中培養18 h，將菌液離心后棄上清，用無菌水將菌懸液濃度調為1×108cfu/mL[2]，以下試驗均為該濃度[8]。

1.3 接種方法

取中油16號、中油18號、中桃5號、中桃9號、湖景蜜露、錦繡黃桃、春雪7個品種生長狀況一致的桃葉片，于超凈工作臺中經75%酒精清洗1次、無菌水沖洗多次，無菌濾紙吸干水分備用。傷口接種法：用無菌注射器針頭在處理過的葉片上輕戳一下制造傷口，隨后在傷口處滴加20 μL菌懸液，待傷口表面菌懸液干燥；噴霧法接種：用無菌噴霧器噴灑60 μL菌懸液至葉片表面；剪葉法接種：用無菌剪刀蘸取適量菌懸液，于葉尖2～3 cm處剪下；注射法接種：用無菌注射器針頭在處理過的葉片上輕戳一下制造傷口，用去掉針頭的注射器輕抵住葉片正面，利用壓力將20 μL菌懸液通過傷口注射到葉片中；浸泡接種法：將葉片置于菌懸液中浸泡5 min，隨后用無菌濾紙吸去多余水分。用無菌水做上述相同的處理分別作為各自對照，處理后的葉片放于28 ℃恒溫恒濕培養箱中培養，每天觀察及統計發病情況。每種方法分別用6種菌株接種不同品種的葉片，每個品種各接種4張桃葉片，其中傷口接種法和噴霧法在每張葉片上沿主葉脈左右兩側對稱位置處各有一個接種點，共8個生物學重復。

1.4 不同菌株的致病性測定

利用最適接種方法(注射法)將6種菌株分別接種到湖景蜜露相同數量、長勢一致的離體葉片上，每張葉片選擇3個部位接種菌懸液、1個部位接種等量無菌水，將接種后的葉片放入28 ℃恒溫恒濕培養箱中培養，每天觀察及統計發病情況。

1.5 不同桃樹品種抗病性測定

選用致病性最強9-4號作為接種菌株，利用篩選出的最適接種方法(注射法)對所有品種的離體葉片分別進行接種，每張葉片均設置3個菌懸液接種點和1個無菌水接種點對照，將接種后的葉片放入28 ℃恒溫恒濕培養箱中培養，每天觀察及統計發病情況。

2 結果與分析

2.1 桃細菌性穿孔病葉片接種方法分析

6個菌株接種不同品種桃葉片的結果中，9-4菌株對湖景蜜露的病害癥狀最明顯。接種的方法不同，葉片的發病情況也有所不同，表2為湖景蜜露不同接種方法的接種結果，接種10 d后發現僅傷口法、注射法和噴霧法接種的葉片上出現褐色水漬狀病斑，屬于典型的細菌性穿孔病癥狀。采用注射法接種點均發病，發病率達到100%，且發病癥狀最為明顯；傷口法和噴霧法接種的發病率均為25%，但病斑較小，噴霧法接種產生的病斑不明顯，易忽略。而常用的浸泡法和剪葉法的葉片一直未出現病斑。

表2 不同接種方法在湖景蜜露葉片的接種結果

2.2 桃細菌性穿孔病菌不同菌株的致病性分析

用6種菌株接種長勢相同的離體葉片，采用注射法接種湖景蜜露桃葉品種。所有葉片上選擇4個相同部位的點作為接種點，左上角的接種點注射無菌水作為對照，其他3個點接種菌株，每個菌株接種6張葉片，接種10 d后統計發病情況。結果顯示，僅9-4、15b和25-3菌株接種的湖景蜜露葉片出現褐色水漬狀病斑，而9-5、15a和35-6菌株接種的桃葉片上無明顯變化(圖1，圖2)。菌株25-3和菌株9-4接種后產生的病斑較大，菌株25-3引起的病斑略小，菌株9-4、15b和25-3的發病率分別為83.3%、16.7%和5.6%，而菌株9-5，15a和35-6發病率為0(圖1)。

圖1 不同菌株接種湖景蜜露葉片的發病結果

圖2 不同菌株對湖景蜜露離體桃葉片的發病情況

2.3 不同桃樹品種對細菌性穿孔病菌的抗性分析

選用9-4菌株接種長勢一致不同品種離體葉片，每張葉片選擇3個接種點，每個品種接6葉片，接種10 d后觀察表型(圖3)。結果發現僅中油16號的葉片沒有發病，其他品種的葉片上均有褐色水漬狀斑點，其中6張湖景蜜露葉片上的18個接種點均出現細菌性穿孔病的典型病斑，發病率達到100%，為最敏感品種；中油18號和中桃9號的抗性也較低，其發病率分別達到83.3%和77.8%；錦繡黃桃的發病率是38.9%，抗性一般；中桃5號和春雪的抗性較高，發病率僅分別為16.7%和5.6%。

圖3 9-4號菌株接種不同品種桃葉片的發病情況

3 小結與討論

采用不同的接種處理法篩選室內最適接種方法，明確注射法接種是桃細菌性穿孔病離體桃葉片室內接種的最佳接種方法，該方法具有葉片發病率高、對照性強、易觀察等特點。Smith[4]對桃細菌性穿孔病的早期發病葉片切片進行顯微觀察，發現病原體可以通過氣孔進入葉片。Xap細菌增殖的第一個位點為體下腔，然后是海綿狀薄壁組織，可能由于這些位點存在廣闊的自由空間。隨后，病原體在柵欄組織的細胞間隙中增殖[9]。注射法是直接將菌懸液注射入葉片組織液中，省去從氣孔侵入的過程，使侵入效率更高、致病率更強。

利用注射法對葉片接種Xap的不同菌株，結果表明分離株間致病性存在明顯差異，其中遼寧瓦房店的9-4菌株接種后葉片發病率最高，致病性最強，引起的癥狀最明顯。不同產地的菌株具有較高的同源性，地理位置不同可能引起Xap菌株的遺傳多樣性[3]，菌株致病力也不同。用9-4菌株接種不同品種的桃離體葉片，早熟桃品種春雪和中油16號抗病性較強，早熟桃品種中油18號和中桃9號抗病性較差，中熟桃品種湖景蜜露抗病性較差，中熟桃品種中桃5號抗病性較強。研究結果表明，桃樹品種的早熟晚熟特性與細菌性穿孔病的抗病性關聯性不大。但是在選育抗性品種時，早熟的特性可以作為推廣的一個重要因素[10]，鑒于選育各方面均佳的桃樹抗性品種時期較長，因此可通過對菌株的抗病性強弱確定適合當地種植的桃樹品種，如遼寧產區的果農可以優先選擇春雪、中桃5號和中油16號。 而湖景蜜露、中油18號和中桃9號對桃細菌性穿孔病較敏感，應慎重選擇。