微波消解-比色法快速檢測糧食中蛋白質(zhì)含量

江曉俊 袁士猛 宋寧宇

摘要：蛋白質(zhì)是糧食作物最重要的營養(yǎng)組成之一，是人類及動物等生命活動最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)含量是糧食作物品質(zhì)好壞的首要評價指標。傳統(tǒng)方法在檢測糧食中蛋白質(zhì)含量時存在消解時間長、檢測操作繁瑣、檢測結(jié)果波動性大等問題，難以應(yīng)用于糧食交易等需要快速檢測蛋白質(zhì)含量的場景。為了能夠快速準確測定糧食的蛋白質(zhì)含量建立了微波消解-比色快速檢測法。樣品處理環(huán)節(jié)采用多段微波消解方案，檢測環(huán)節(jié)采用新設(shè)計的全自動蛋白質(zhì)速測儀進行檢測。自動化程度高可節(jié)約人力避免危險，并且大幅度縮短實驗時間，由國標方法的6 h縮短為1 h。對快速法檢測值與國標法檢測值進行了T檢驗，t（d）=0.503

關(guān)鍵詞：多段微波消解；比色法；糧食；蛋白質(zhì)

中圖分類號：TS210.1 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230624

Rapid detection of protein content in grains by microwave digestion colorimetric method

Jiang Xiaojun1，2， Yuan Shimeng3， Song Ningyu3

（ 1. Chengdu Food Inspection and Research Institute， Chengdu， Sichuan 611130； 2. National Key Laboratory for Market Regulation （Nutrition and Health Chemometrics and Applications）， Beijing 100029； 3. Changchun Changguang Sipo Spectral Technology Co.， Ltd， Changchun， Jilin 130000 ）

Abstract： Protein is one of the most important nutritional components of food crops， which is the most important material foundation for human and animal life activities. Protein content is the primary indicator for evaluating the quality of food crops. Traditional methods for detecting protein content in grains have problems such as long digestion time， cumbersome detection operations， and high volatility of detection results， which makes it difficult to apply to scenarios such as grain trading requiring rapid detection of protein content. In order to quickly and accurately determine the protein content of grains， a microwave digestion colorimetric rapid detection method was established. The sample processing phase adopted a multi-stage microwave digestion scheme， and the detection phase adopted a newly designed fully automatic protein rapid analyzer for detection. A high degree of automation could save manpower and avoid danger， and significantly shorten the experimental time from 6 hours in the national standard method to 1 hour. A T-test was conducted between the rapid method and the national standard method， with t（d）=0.503

Key words： multi stage microwave digestion， colorimetric method， grain， protein

蛋白質(zhì)是糧食作物最重要的營養(yǎng)組成之一，是人類及動植物等生命活動的重要載體[1]，對機體的生長、發(fā)育具有不可替代的作用。糧食作物是人類獲取生命必需蛋白質(zhì)和氨基酸最主要和廉價的蛋白質(zhì)供體。蛋白質(zhì)含量已成為評價糧食作物（如大豆等）品質(zhì)好壞的首要指標，是高蛋白糧食作物交易定價的關(guān)鍵因素。能夠準確測定糧食的蛋白質(zhì)含量是糧食深加工、開發(fā)食品資源、進行深加工質(zhì)量管理和改良工藝的基礎(chǔ)。

測定蛋白質(zhì)的常用方法有：凱氏定氮法[2]、恒pH滴定法[3]、氣敏電極-濃度直讀法[4]、雙縮脲法[5]等。傳統(tǒng)的糧油檢驗蛋白質(zhì)含量是按國標法（GB 5009.6—2016）執(zhí)行的，采用的是凱氏定氮法，首先，國標法采用濃硫酸水解，水解時間4～6 h，使得檢測時間長，無法在理化檢驗中達到快速檢測的目的；其次，水解后采用定氮儀加人工滴定的方式進行檢測，測定的不確定度較大[6-7]，對實驗人員操作水平要求較高，較難做到不同實驗人員之間相互比對工作；再者，檢測時需要使用大量化學(xué)試劑（如濃硫酸、氫氧化鈉溶液和硼酸溶液等），不僅加大了檢測成本，而且嚴重污染環(huán)境，對實驗員健康存在潛在危害[8]。

微波消解法具有加熱速度快、用時短、加熱均勻、準確度高等顯著優(yōu)點[9]，蛋白質(zhì)快速測定儀測定樣品的蛋白質(zhì)含量時，使用的消解儀可設(shè)置多段消解方案。在設(shè)定消解方案時，采取消解條件先溫和后激烈的方案。溫和的消解條件用以破壞細胞組織，打散糖—油—蛋白包裹基團；劇烈的消解條件用以將蛋白質(zhì)消解為含氮物質(zhì)。樣品前處理采用微波分段式消解技術(shù)，用硫酸及過氧化氫作為消解劑，在微波高能高頻的作用下將樣品快速消解為銨根離子的形式游離在水解液中，縮短了消解的檢測流程[10]，采用專用試劑使用比色法對溶液中氮含量進行檢測，比色法代替人工滴定，提高了實驗操作的重復(fù)性和易用性。本文旨在利用微波快速消解法聯(lián)合比色法建立適合于糧油中蛋白質(zhì)含量的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

硫酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸、過氧化氫（均為分析純）：重慶川東化工（集團）有限公司；蛋白質(zhì)快速測定儀專用試劑：南京至匠匯創(chuàng)儀器有限公司。

HCD -1100型蛋白質(zhì)快速測定儀、HCW -100型實驗快速消解儀：南京至匠匯創(chuàng)儀器有限公司；ME204E型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；8400型凱氏定氮儀：丹麥FOSS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水分測定

按GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》執(zhí)行。

1.2.2 樣品的蛋白質(zhì)測定

稱取0.1 g試樣置于干燥潔凈的消解罐中，加入3 mL硫酸、4 mL過氧化氫輕搖罐身使試樣分散，放入消解儀中消解。消解后放入恒溫冷卻器快速冷卻。向消解罐中加入3 mL水并搖勻。準確稱取0.5 g蛋白質(zhì)快速測定儀專用試劑1置于10 mL比色管中，向其中加入0.1 mL消解液，定容10 mL加入0.5 mL專用試劑2顯色10 min，使用蛋白質(zhì)快速測定儀進行檢測。

1.2.3 消解功率對蛋白質(zhì)含量測定的影響

取當年采樣的大豆，按實驗操作進行消解檢測。消解程序設(shè)定為兩個階段，采用不同的微波功率進行消解，并遵循國標方法進行蛋白質(zhì)含量的檢測。實驗共設(shè)4組，第一組為對照組，采用國家標準[2]方法測定蛋白質(zhì)含量；其余3組為消解1組、消解2組、消解3組，均利用微波消解儀進行消解，消解功率設(shè)定如表1所示。

待消解結(jié)束后，按照國家標準[2]測定樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 消解時間對蛋白質(zhì)含量測定的影響

取當年采樣的大豆，按實驗操作進行消解檢測。消解程序設(shè)定為兩個階段，固定功率采用不同的微波時間進行消解，并遵循國標方法進行蛋白質(zhì)含量的檢測。實驗共設(shè)4組，第一組為對照組，采用國家標準[2]方法測定蛋白質(zhì)含量；其余3組為消解1組、消解2組、消解3組，均利用微波消解儀進行消解，消解功率設(shè)定為：第一階段800 W、第二階段1 000 W。消解時間設(shè)定如表2所示。

待消解結(jié)束后，按照國家標準[2]測定樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 微波消解-比色蛋白快速檢測法的準確性評價

蛋白質(zhì)快速測定儀利用硫酸銨標準溶液繪制內(nèi)置標準工作曲線，聯(lián)合微波多段快速消解，減少了檢驗的工作量與操作誤差，提高了檢測效率。針對全自動蛋白質(zhì)速測儀能否準確地測定樣品的蛋白質(zhì)含量，進行了以下準確性評價實驗。選取10份當年新采集大豆樣品，按國標方法進行蛋白質(zhì)含量的測定。同時采用一臺蛋白質(zhì)快速測定儀，按照儀器操作規(guī)程進行檢測，評價快速法的檢測值與國標法檢測值的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

配制1 000 mg/L的硫酸銨儲備液，將儲備液稀釋為1、2、3、4、5、6 μg/mL 的標準溶液。將這些溶液按儀器的操作規(guī)程進行處理和檢測，得到儀器吸光度與該點標準濃度建立標準工作曲線，如圖1所示。標液質(zhì)量濃度在1～6 μg/mL時吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：y = 5.315 3x + 0.084 9（r = 0.999 4）。

2.2 消解功率對檢測結(jié)果的影響

如表3所示，消解1組的數(shù)據(jù)與對照組偏差較大，為3.78%～4.91%，說明略低的消解功率是無法將糧食的蛋白質(zhì)無法完全消解的。消解2組和消解3組與對照組結(jié)果十分接近，偏差為-0.25%～0.35%，符合國標方法[2]規(guī)定的精密度要求，但消解2組偏差更接近0，同時在效果相當?shù)那疤嵯孪鈨x保持長時間較低功率工作有助于消解穩(wěn)定。因此，消解功率設(shè)定為：第一階段800 W，第二階段1 000 W。

2.3 消解時間對檢測結(jié)果的影響

如表4所示，消解1組的數(shù)據(jù)與對照組偏差較大，偏差為6.16%～6.71%，說明較短的消解時間是無法將糧食中的蛋白質(zhì)完全消解的。消解2組和消解3組與對照組結(jié)果十分接近，偏差為-0.59%～0.53%，而消解2組的結(jié)果與國標法更為接近，符合國標方法[2]規(guī)定的精密度要求。因此，消解時間設(shè)定為：第一階段3 min，第二階段4 min，即微波消解糧食中蛋白質(zhì)的最優(yōu)消解條件為：第一階段消解功率800 W，消解3 min；第二階段消解功率1 000 W，消解4 min。

2.4 微波消解-比色蛋白快速檢測法檢測數(shù)據(jù)與國標法數(shù)據(jù)對比

如表5所示，全自動蛋白質(zhì)速測儀檢測值與國標法檢測值進行T檢驗，t （d） = 0.503，查t分布表，t （0.05，30） = 2.042，t（d） = 0.503

3 結(jié) 論

利用多段微波消解技術(shù)，可快速地消解樣品中的蛋白質(zhì)，試劑用量小，消解時間大大縮短，從國標方法（GB 5009.5—2016）規(guī)定的6 h縮減為1 h，縮短了實驗時間，提高了檢測效率，簡化實驗操作減少人為誤差，避免危險操作，有效地提高了實驗的準確性、重復(fù)性與再現(xiàn)性。微波消解-比色蛋白快速檢測法可更好地服務(wù)于糧食的收購、存儲、深加工的質(zhì)量控制和工藝改良等環(huán)節(jié)。

參 考 文 獻

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