富集纖維素降解菌群過程中微生物群落多樣性分析

王彥偉，祝其麗，吳 波，譚芙蓉，胡國全，何明雄，高立洪

(1.農業部沼氣科學研究所 秸稈資源化利用科技創新團隊，四川 成都 610041；2.農業農村部農村可再生能源開發與利用重點實驗室，四川 成都 610041；3.農業廢棄物資源化利用技術與設備研發重點實驗室，重慶 404100)

木質纖維素是地球上儲量最大的可再生的生物質資源，但木質纖維素結構非常復雜，使其難以快速被微生物降解，這便限制了纖維素資源化的有效利用[1-3]。獲得能高效轉化纖維素的微生物是纖維素資源高值化利用的基礎。利用微生物共培養(復合菌系)進行纖維素降解與生物轉化是實現其高值化利用的有效途徑。實現纖維素廢棄物的高效利用，已成為緩解能源緊張、提高環境質量、促進經濟和社會可持續發展的有效方法[4-5]。但微生物共培養體系復雜，不同種類的微生物如何在共培養體系發揮作用，仍然是急需解析的問題之一。

微生物在自然界中的纖維素降解中起主要作用，纖維素降解微生物很容易在不同的生境中找到，如土壤、農業廢棄物、昆蟲內臟、糞便和反芻動物的瘤胃等[6]。瘤胃是一種具有多種微生物種群的天然纖維素降解系統，通過微生物相互作用降解纖維素材料[7]。Xing[8]等報道牛瘤胃微生物促進小麥秸稈生物降解了96%～97% 的纖維素和半纖維素。Li[9]等在瘤中發現2個微生物組可以促進青儲秸稈糖的轉化。但是利用單一菌株進行木質纖維素降解時，由于底物抑制和反饋抑制作用的存在，使得木質纖維素降解水平低下[10-12]。近些年來，人們發現混合的菌群對復雜的有機污染物及天然難降解物質如多氯聯苯、多環芳烴和合成燃料等有較強的降解能力[13-15]。大多數情況下，多菌的降解能力都遠遠高于單菌，因而纖維素降解復合菌系已越來越受到人們的重視。

復合菌系降解木質纖維素時能夠避免單一菌株降解時產生的底物抑制和反饋抑制作用，因產酶更加多樣，從而能夠有效地降解木質纖維素。Kato[16]等通過研究復合菌系中主要菌株間的關系，從中分離主要菌株，并將厭氧的纖維素降解菌和好氧的非纖維素降解菌株組合在一起，發現非纖維素降解菌對纖維素降解起了非常重要的作用。本研究以連續傳代的纖維素降解復合菌系為研究對象，利用16S rRNA 及ITS基因擴增子高通量測序方法，分析不同傳代復合菌系降解纖維素過程中各微生物分類單元的群落組成及其相對豐度變化，探究復合菌系群落結構的動態變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料

接種物：取自四川省金堂縣農村合作社新鮮屠宰的山羊瘤胃內溶物，4℃保存于無菌的血清瓶中。配制赫奇遜無機鹽培養基(g·L-1)：KH2PO41.0，NaCl 0.1，MgSO4·7H2O 0.3，NaNO32.5，FeCl30.001，CaCl20.1，pH值7.2。DNeasy Power Soil Kit。

1.2 樣品的傳代培養

以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，配制赫奇遜無機鹽培養基，將培養基分裝至三角瓶中，裝液量為40%(體積比)，1×105Pa、121℃滅菌15 min。接種底物為瘤胃內溶物，接種量為10%(體積比)，30℃ 150 rmp·min-1搖床培養，連續傳代培養，每隔6 d傳一代，共傳代20次，每一代取樣保存至-80℃冰箱。

1.3 微生物組總DNA提取

選取20次樣品中的10個樣品，包含第一代及最后一代編號C1-C10，采用TIANamp公司的DNeasy PowerSoilKit進行抽提，采用熒光分光光度計(Quantifluor-ST fluorometer, Promega, E6090)，在260 nm和280 nm處分別測定DNA的吸光值，檢測DNA的濃度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。調整DNA溶液濃度，DNA工作液保存于4℃，儲存液保存于-20℃。

1.4 PCR擴增

以上述DNA 為模板，利用引物對各樣品基因組DNA V3～V4 區域及真菌ITS序列進行PCR擴增，將反應體系置于ABI Gene Amp?9700 型PCR 儀進行擴增，PCR產物參照電泳初步定量結果，將PCR 產物用QuantiFluorTM-ST 藍色熒光定量系統(購于Promega公司)進行檢測定量。利用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit 回收純化PCR 產物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將擴增產物送至上海派森諾生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 測序平臺進行測序，構建16S rRNA文庫及ITS文庫。

1.5 數據分析

首先對高通量測序的原始下機數據進行初步質量篩查；通過質量初篩的序列按照引物和Barcode信息，識別分配入對應樣品，并去除嵌合體等疑問序列；對獲得的序列進行OTU歸并劃分，每個OTU的代表序列用于分類地位鑒定以及系統發育學分析；根據OTU在不同樣品中的豐度分布，評估每個樣品的多樣性水平，并通過稀疏曲線反映測序深度是否達標；對各樣品(組)在不同分類水平的具體組成進行分析(并檢驗組間是否具有統計學差異)；通過多種多變量統計學分析工具，進一步衡量不同樣品(組)間的菌群結構差異及與差異相關的物種；根據物種在各樣品中的組成分布，構建互作關聯網絡；根據16S rRNA及ITS基因測序結果，預測各樣品的菌群代謝功能。

2 結果與分析

2.1 樣品測序量

對10個連續傳代樣品中細菌16S rRNA序列測定，獲得序列量在53885～67722之間，經過去除低質量、減噪等方法過濾，每個樣品的有效序列在46442～59133條，平均測序覆蓋率為99.2%。堿基長度分布于400～450之間。10個樣品的真菌ITS序列測定序列量在 78340～97643之間，經過去除低質量、減噪等方法過濾后，每個樣品的有效序列在71456～89874條，平均測序覆蓋率為99.6%。堿基長度分布于100～300之間。

2.2 樣品OUT分布情況

10個樣品中細菌屬水平測序比對結果豐富，其中樣品OUT比對結果在262～535個屬，隨著傳代次數增多，樣品中細菌屬逐漸減少，其中樣品C1(第1代)測序屬最多達到535，樣品C8(第16代)測序屬最少209可比對屬，隨著傳代進行C8，C9，C10復合系逐漸穩定，細菌構建完成(見圖1)。10個樣品中真菌種水平序列比對結果豐富，其中OUT比對結果在96～139個種之間，隨著傳代次數增多，樣品中真菌種逐漸增多，C10樣品測序屬種達到139個。C2樣品中可比對種最少為96個。樣品中真菌的可比對序列與細菌變化趨勢不同(見圖2)。

圖1 細菌OTU分布

圖2 真菌OTU分布

2.3 細菌，真菌群落豐富度和多樣性的影響

為了能較為全面的評估10個傳代樣品中微生物群落的Alpha多樣性，表1反映了10個樣品的多樣性差異，在細菌群落多樣性分析中，傳代后期樣品C8，C9，C10的 Chao1及Observed species數值較小，表明豐富度較前7代樣品差異顯著，后期傳代樣品C8的Shannon和Simpson數值較小，多樣性較其他樣品差異顯著，C8樣品的Pielou’s e指數小，樣品的均勻度較其他樣品差異顯著。前期樣品的細菌豐富度、多樣性及均勻度均好于后期傳代樣品。真菌多樣性分析中，前期傳代樣品C1，C2及C3的Chao1及Observed species數值較小，表明豐富度較后7代樣品差異顯著。樣品C10的Shannon和Simpson數值較小，多樣性較其他樣品差異顯著。C10樣品的Pielou’s e指數小，樣品的均勻度較其他樣品差異顯著，真菌群落多樣性分析中，前期傳代樣品中的豐富度較差，但是樣品的多樣性及均勻性高于后期傳代樣品。富集樣品的前期豐度較高，后期變少，可能是部分菌群在富集篩選過程中退化，作用降低，優勢菌群增加，豐度降低。

表1 樣品Alpha多樣性指數表

2.4 傳代樣品的微生物群落組成分析

對各個物種的組內樣品豐度值進行歸一化后，再求樣品平均值，分析10個細菌屬水平，所展示樣品前20的細菌屬如圖3，10個樣品中各種屬展示如下。德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)占13%，纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)占12%，異根瘤菌屬(Allorhizobium)-新根瘤菌屬(Neorhizobium)-副根瘤菌屬(Pararhizobium)-根瘤菌屬(Rhizobium)占4%。在前期樣品(C1)中鏈霉菌屬(Streptomycessp.)大量存在，這可能與瘤胃液的微生物類群相關，隨著傳代的進行，德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)、纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)逐漸成為優勢菌群。其中在后期傳代樣品(C7)中纖維弧菌屬(Cellvibriosp.)、砂單胞菌屬(Arenimonassp.)占據了優勢地位，有別于其他后期樣品。C8、C9和C10樣品中群落結構趨于穩定。結果表明：厚壁菌門中的種屬占優勢地位，這和報道中的瘤胃微生物相似，牛瘤胃中厚壁菌門也是秸稈降解的優勢種群[17-18]，同時在測序分析中仍然有大量的微生物未被鑒定到屬。已有的研究也表明：自然資源中仍然有許多未被發現的微生物，可能具有重要的生物學功能。

圖3 樣品細菌屬分類水平物種組成

對各個物種的組內樣品豐度值進行歸一化后，再求樣品平均值，分析10個樣品真菌屬水平，所展示樣品前20的真菌屬如圖4所示，其中曲霉屬(Aspergillussp.)占8%，古根霉屬(Archaeorhizomycessp.)占6%，被孢霉屬(Mortierellasp.)占3%等。未鑒定到屬分類的真菌菌屬占比最高，大量的未培養的真菌仍然需要進一步挖掘。

圖4 樣品真菌屬分類水平物種組成

2.5 組間差異

為了比較樣品間的物種組成差異，實現對各樣品的物種豐度分布趨勢的展示，研究中，使用屬水平的分類單元組成作為分析對象，使用平均豐度前50位的屬的豐度數據繪制熱圖。細菌屬熱圖分析不同樣品的差異較為顯著，不同傳代樣品之間優勢種群存在顯著差異，纖維弧菌屬(Cellvibriosp.)和 砂單胞菌屬(Arenimonassp.)僅在C7樣品中較為豐富，纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)和假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonassp.)在C4、C9、C10樣品中較為豐富，在C1、C2、C3樣品中Pseudomonassp屬占有優勢，但隨著傳代的進行，在后面的傳代樣品中，逐漸被其他優勢菌群替代。類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)和 戈馬單胞菌屬(Gommatimonassp.)僅在C2中占有優勢。德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)和獨島桿菌屬(Dokdonellasp.)分別在C6、C9、C10樣品中顯示為優勢菌屬。熱圖分析顯示隨著傳代的進行，樣品中的細菌微生物群落逐漸改變，優勢菌群發生變化，樣品中的群落結構不穩定。

為了比較樣品間的物種組成差異，實現對各樣品的物種豐度分布趨勢的展示，研究中，使用屬水平的分類單元組成作為分析對象，使用平均豐度前50位的屬的豐度數據繪制熱圖。真菌屬熱圖分析表明不同樣品的差異較為顯著，C10樣品中僅存在曲霉屬(Aspergillussp.)優勢種群。C1、C2、C3、C4、C5樣品中優勢菌種較多，分別是Lactiflcussp.、peniollumsp.、紅酵母菌屬(Rhodotorulasp.)、Llyonectriasp.、附球菌屬(Epicoccumsp.)、星裂盤菌屬(phacidiumsp.)。C7，C9樣品中優勢菌群未被發掘，在C8樣品中黑團胞屬(Periconiasp.)占有優勢。

圖5 細菌屬水平hotmap 分析

圖6 真菌屬水平heatmap分析

3 討論

本研究采用Illumina MiSeq 技術對連續傳代的復合系樣品的群落進行高通量測序，組間差異性分析顯示不同傳代樣品微生物群落結構存在明顯的差異，細菌，真菌熱圖分析表明不同傳代樣品中的細菌，真菌的優勢菌群不同，前期傳代樣品(C1，C2，C3，C4和C5)中的假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、生孢噬纖維菌屬(Sporocytophagasp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)，gemmatatimonassp.、短波單胞菌屬(Brevundimonassp.)、無色桿菌屬(Achromobactersp.)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobiumsp.)、鞘氨醇菌屬(Chitinophagasp.)等優勢種屬逐漸消失，前期傳代樣品中的優勢細菌屬逐漸被后期傳代樣品中的獨島桿菌屬(Dokdonellasp.)、纖維弧菌屬(Cellvibriosp.)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonassp.)等取代，前期傳代樣品(C1，C2，C3，C4，C5)中優勢真菌Lactifluussp.、青霉屬(Peniollumsp.)、llyonectriasp.等被黑團胞屬(Periconiasp.)、曲霉屬(Aspergillussp.)取代。以CMCNa為唯一碳源連續富集、限制性培養過程中，菌群結構一直處于變化的狀態，使隨機性過程增加。后期傳代樣品優勢細菌纖維弧菌屬(Cellvibriosp.)和假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonassp.)都被報道過具有纖維素降解能力的菌屬[19-22]，這類菌屬的保留，可能與其具有木質纖維素分解功能的或者輔助降解纖維素功能有關。測序結果分析表明復合菌系中存在與纖維素降解有直接關系的菌，也存在可能有未知的功能，或者因適應培養基選擇并保留，也可能在接下來的傳代培養中被“淘汰”。

通過分析10個樣品中的OUT分類，在細菌分類中unclassified_Microbacteriaceae，德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)和纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)3種類型的種屬占比較高，其中德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)被報道過存在于污泥秸稈堆肥體系、棉花秸稈堆肥體系和秸稈還田的土壤等不同的秸稈降解體系中[23-24]，其在秸稈降解復合菌系中發揮著重要的作用。纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)[25-26]是細菌屬中纖維素酶活力較強的菌株，該菌屬可通過分泌幾種胞外纖維素酶對秸稈進行水解，在細菌纖維素降解過程中有重要的研究意義。在真菌OUT分類中unclassified_fungi(49%)，未鑒定到屬的真菌占大部分，其作用有待于進一步解析。Aspergillussp.(8%)[27-28]及古根霉屬(Archaeorhizomycessp.)占6%[29-30]都具備降解纖維素的能力，在秸稈堆肥富集物中都被監測到是優勢菌群，被孢霉屬(Mortierellasp)占3%在復合系中的作用不明。在自然環境中，木質纖維素的降解是多種微生物共同作用的結晶，纖維素的徹底降解是通過多種微生物長時間相互作用的結果。對于純培養的單菌，不論是細菌還是真菌，很少有明確報道表明單菌具有較強的天然木質纖維素分解能力。

以CMCNa為底物富集纖維素降解菌系，測序分析表明復合系中存在大量的纖維素降解菌，在選擇性底物的作用下，特定的微生物得到了富集，但是連續傳代的樣品并沒有獲得穩定的復合系，這可能和培養時間、培養基組成等有關。要想獲得穩定的復合系，還需要進一步優化培養條件等。