腦膠質瘤組織中透明質酸合成酶2表達變化及其與臨床病理參數和預后的關系

薛正淳，孫強，孟祥龍，張健，張墨軒，衡雪源

1 濰坊醫學院研究生院，山東濰坊 261053；2 臨沂市人民醫院神經外科；3 北京市神經外科研究所 首都醫科大學附屬北京天壇醫院功能神經外科研究室

膠質瘤是最常見的顱內原發性腫瘤，約占顱內惡性腫瘤的81%［1-3］。目前手術切除聯合術后放化療是腦膠質瘤常用的治療方法［4］，但由于腦膠質瘤細胞生長迅速、侵襲性高、易復發或產生耐藥，治療效果仍不理想。研發新的治療策略是膠質瘤治療相關研究的重點［5-6］。近年來分子靶向治療研究進展迅速，許多與膠質瘤診斷、治療和預后相關的基因被篩選出來。透明質酸合成酶2（HAS2）定位于染色體8q24.13，是透明質酸合成酶家族中的一員。透明質酸連同其表面受體已被證實與惡性腫瘤進展（如侵襲和轉移）有關［7-8］。多項研究表明，HAS2 與結直腸癌、胰腺癌、子宮內膜癌的腫瘤分級和患者預后有關［9-11］。一項回顧性分析也顯示，HAS2 在浸潤性星形細胞膠質瘤中高表達［12］。本研究觀察了腦膠質瘤組織中HAS2 的表達變化，探討HAS2 表達與腦膠質瘤臨床病理參數及預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013 年7 月—2020 年7 月在臨沂市人民醫院行腦膠質瘤切除術患者的膠質瘤標本70 例納入病例組，患者男37 例、女33 例，年齡2 ～ 70 歲，WHO 分級1 ～ 2 級32 例、3 ～ 4 級38 例。納入標準：①經術后病理證實為腦膠質瘤；②患者具有手術指征，且自愿手術；③術前未進行放化療、免疫治療等。排除患有其他惡性腫瘤或二次膠質瘤手術的患者，病例資料缺失的患者，圍術期死亡者。另選同期行顱腦外傷減壓手術的腦外傷患者的正常腦組織10例納入對照組。對照組患者男6例、女4例，年齡16 ～ 72 歲。兩組患者一般資料差異無統計學意義，具有可比性。本研究獲得醫學倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 HAS2蛋白檢測

1.2.1 免疫組化法 標本組織獲取后經多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片，烘片機70 ℃烘烤45 min；切片經常規脫蠟水化，置于檸檬酸鹽修復液中進行抗原修復，冷卻至室溫移至濕盒；加入內源性過氧化物酶阻斷劑靜置15 min，PBS 沖洗3 次；滴加1∶100 稀釋的HAS2 抗體，孵育過夜后PBS 漂洗3 次；滴加反應增強液室溫孵育20 min，PBS沖洗3次；滴加抗鼠/兔IgG 二抗，室溫孵育40 min；加入新鮮配置的二氨基聯苯胺（DAB）顯色液，流動水沖洗；蘇木素復染，脫水，透明，干燥，中性樹膠封片。顯微鏡下（200×）觀察，每個切片隨機選取10 個視野，計數陽性細胞數。根據HAS2 染色程度和陽性細胞百分比評估結果：染色程度為無染色、淡黃色、棕黃色、褐黃色分別計0、1、2、3分，HAS2陽性細胞百分比為0、＜25%、25% ～ ＜50%、≥50%分別計0、1、2、3 分，二項評分乘積1 ～ ≤4為HAS2低表達，＞4為HAS2高表達。

1.2.2 Western blotting 法 兩組組織在液氮作用下研磨，全蛋白提取試劑混勻后提取總蛋白，BCA蛋白定量；配置10%分離膠，4%濃縮膠上樣電泳，濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，恒流280 mA轉膜70 min；將轉膜后的聚偏氟乙烯膜放入新鮮配置的牛奶中封閉2 h，后加入1∶1 000 稀釋的HAS2 抗體，放置4 ℃冰箱孵育過夜；次日PBST 洗膜3 次，加入抗兔酶標記二抗，搖床孵育2 h，PBST 洗膜；吸取顯影液均勻滴于膜上進行化學發光顯影，得到Western blotting條帶；用Image J軟件分析條帶，得到條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH 蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS26.0 軟件及Graph-Pad Prism9 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以-x±s表示，組間比較采用t檢驗。計數資料用百分比（%）及頻數表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Logistic 回歸模型分析HAS2 表達的影響因素。采用Kaplan-Meier 曲線描述患者生存情況，生存期差異比較采用Log-Rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組HAS2 蛋白表達比較 免疫組化法檢測結果顯示，HAS2 主要在細胞質中表達，為淡黃色至黃褐色顆粒。見圖1。病例組HAS2 高表達38 例（54.2%，38/70），其中1 ～ 2 級、3 ～ 4 級腦膠質瘤組織HAS2 高表達分別為11 例（34.4%，11/32）、37 例（71.1%，27/38）；對照組HAS2 高表達1 例（10%，1/10）。病例組HAS2高表達率高于對照組，且3 ～ 4級腦膠質瘤組織中HAS2高表達率高于1 ～ 2級腦膠質瘤組織（P均＜0.05）。Western blotting 檢測結果顯示，病例組、對照組HAS2 相對表達量分別為0.803 ± 0.286、0.243 ± 0.108，其中1 ～ 2 級、3 ～ 4 級腦膠質瘤組織HAS2 相對表達量分別為0.355 ± 0.109、0.765 ± 0.081。病例組HAS2 相對表達量高于對照組，且3 ～ 4 級腦膠質瘤組織中HAS2 相對表達量高于1 ～ 2級腦膠質瘤組織（P均＜0.05）。

圖1 兩組HAS2表達情況（免疫組化法）

2.2 HAS2 表達與腦膠質瘤臨床病理參數的關系 WHO 分級3 ～ 4 級、突變型p53、Ki-67 高表達腦膠質瘤組織中HAS2 高表達率分別高于1 ～ 2 級、野生型p53、Ki-67 低表達的腫瘤組織（P均＜0.05）。HAS2 表達與患者年齡、性別、腫瘤位置、O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（MGMT）表達無相關性。見表1。將WHO 分級、Ki-67 表達、p53 分型、年齡、性別、腫瘤部位和MGMT 表達作為自變量，將HAS2 表達作為因變量，納入Logistic 回歸模型分析，結果顯示WHO 分級、Ki-67 表達與p53 分型是腦膠質瘤患者HAS2表達的獨立影響因素（P均＜0.05）。見表2。

表1 HAS2與腦膠質瘤患者臨床病理參數的關系［例（%）］

表2 HAS2表達影響因素的Logistic回歸分析結果

2.3 HAS2 表達與膠質瘤患者生存時間及預后的關系 隨訪至2020 年12 月，病例組70 例患者死亡37例、存活33例，存活率為47.1%。HAS2高表達患者的平均生存時間（33.6 個月）、總生存率（28.9%）低于HAS2 低表達患者（分別為43.5 個月、62.5%），P＜0.01。見圖2。

圖2 HAS2低表達與高表達患者預后比較

3 討論

原發性中樞神經系統腫瘤的發病中位年齡約為60 歲，其中膠質瘤約占26%［13］。盡管膠質瘤有很多治療方案，包括手術治療、化療、放療和免疫治療，但膠質瘤患者的生存率仍然很低。可能原因是腫瘤的異質性和表觀遺傳學的復雜性使膠質瘤的治療靶點難以確定，生理性血腦屏障的存在也限制了藥物的效果。此外，腫瘤的高浸潤性也使手術治療的效果有限。現已明確腫瘤標志物可作為膠質瘤診斷和治療的分子依據［14］。

近年來與惡性腫瘤相關的細胞外基質成分備受關注。在細胞外基質成分中，透明質酸在腦組織的含量較其他組織豐富，且透明質酸在腦膠質瘤中表達較周圍正常腦實質更為豐富，其高表達與膠質瘤患者不良預后密切相關。生理狀態下，透明質酸由于其黏性和保水能力，對組織的平衡、生物力學和結構的完整性有重要意義［15］。但在病理狀態下，透明質酸在損傷部位表達更加豐富。在膠質瘤中，透明質酸一方面作為機械基質為膠質瘤細胞的侵襲和遷移提供環境基礎；另一方面，透明質酸還作為一種信號成分，通過其同源受體（如CD44、透明質酸移動受體、細胞黏附分子1等）為 膠質瘤細胞的侵襲提供條件［16］。因此，探望為腦膠質瘤的靶向治療研究提供新的方向。

本研究分別通過免疫組化法和Western blotting法檢測了腦膠質瘤組織和正常腦組織中的HAS2，結果顯示，免疫組化檢測結果與Western blotting 檢測結果均顯示，病例組HAS2 表達高于對照組，且3 ～ 4 級腦膠質瘤組織中HAS2 表達高于1 ～ 2 級腦膠質瘤組織，提示HAS2 與腦膠質瘤發病和惡性程度有關。進一步分析結果顯示，WHO 分級3 ～ 4 級、突變型p53、Ki-67 高表達患者腦膠質瘤組織中HAS2 高表達率分別高于1 ～ 2 級、野生型p53、Ki-67低表達的腫瘤組織；WHO 分級、Ki-67 表達與p53 分型是腦膠質瘤患者HAS2 表達的獨立影響因素。我們還發現，野生型p53、Ki-67 低表達的腦膠質瘤患者生存率為61.5%，突變型p53、Ki-67高表達的腦膠質瘤患者生存率為36.0%，而突變型p53、Ki-67 高表達、HAS2 高表達的腦膠質瘤患者生存率為僅為28.5%，表明突變型p53、Ki-67 高表達和HAS2 高表達的腦膠質瘤惡性程度更高。上述結果進一步提示，HAS2表達可能與腦膠質瘤惡性程度有關。

有研究表明，HAS2 參與上皮—間充質轉化（EMT）過程［17］。EMT 表現為細胞極性、黏附性和緊密性喪失，導致細胞易從基底膜脫落，有助于向遠處侵襲轉移。野生型p53 可通過幫助細胞保持上皮基因特征來抑制EMT，并且可以通過增強抑制EMT 的miRNA 表達來抑制EMT 核心轉錄因子的表達。野生型p53缺失在乳腺癌細胞中會引發EMT［18］。另有研究表明，在乳腺癌細胞中上調HAS2 表達會導致間質標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達增加，從而導致EMT［17］。Ki-67 作為腫瘤增殖相關因子，在G1中期到晚期出現，M 期達到峰值，其半衰期短，在細胞脫離增殖周期后迅速降解。除G0期外的細胞周期都可檢測到Ki-67，Ki-67與腫瘤的增殖、遷移和侵襲密切相關［19］。研究表明，Ki-67的促增殖作用可能與EMT 產生協同作用。肺癌相關研究顯示，Ki-67過表達者EMT 顯著增強，且患者預后更差［19］。本研究結果顯示，HAS2 高表達患者的平均生存時間、總生存率低于HAS2 低表達患者，提示HAS2 高表達者預后更差，HAS2 可能通過上述相關機制影響腦膠質瘤的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，HAS2 在腦膠質瘤組織中高表達，HAS2 高表達與腦膠質瘤惡性程度有關，并影響患者預后。HAS2 有望作為腦膠質瘤的潛在治療靶點。HAS2 在腦膠質瘤發生發展中的具體作用機制和相關通路仍需進一步研究。