紅三葉種子對納米鐵的響應(yīng)研究

李羽超莫海鳳王田祁兆奔劉權(quán)

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.平?jīng)鍪修r(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000)

前言

近年來，納米材料在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛[1]。許多研究表明施用納米肥料能促進種子萌發(fā)、減少化肥施用、提高作物抗性、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)[2-4]。納米鐵對植物生長的影響主要是通過提高光合速率和增強植物抗氧化能力兩條途徑[5]。Waqas等[6]發(fā)現(xiàn)，納米鐵能通過提高干旱脅迫的亞麻植物中光合色素水平，增強抵抗干旱脅迫的能力。納米鐵氧化物能通過提高玉米細胞中鐵含量，增強植物抗氧化能力，顯著促進生長，增加地上部可溶性蛋白含量[7]。有研究認為納米鐵作為種子引發(fā)劑，能提高柳枝稷種子活力并促進幼苗生長，是通過縮短吸漲后的滯后時間、活化發(fā)芽相關(guān)的酶活性、增加萌發(fā)代謝物的積累、修復(fù)種子損傷和滲透調(diào)節(jié)5個方面實現(xiàn)種子萌發(fā)的促進作用[8]。Rakesh等[9]證實了用50ppm納米Fe3O4代替?zhèn)鹘y(tǒng)鐵源，能顯著提高水稻種子的發(fā)芽率、活力指數(shù)、含水量和干重。

紅三葉(Trifolium pratense L)，是一種利用價值很高的牧草，其產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)良，在國內(nèi)外分布廣泛，是家畜的優(yōu)良飼料。紅三葉具有很高的藥用價值，其提取物中的異黃酮具有防止乳腺癌，提高機體免疫功能，抑制前列腺增生，預(yù)防骨質(zhì)疏松，緩解更年期綜合癥等作用[10,11]，而且是該植物種群競爭和環(huán)境適應(yīng)的主要物質(zhì)之一[12]。紅三葉是建植混播草地的優(yōu)良草種，但實踐表明紅三葉存在幼苗不易順利出土[13]，苗期生長緩慢的問題[14]，需要采取一些措施來提高紅三葉種子活力。

利用納米鐵作為種子引發(fā)劑，提高紅三葉種子萌發(fā)效率和幼苗生長活力的相關(guān)研究尚未見報道。本研究所用的納米鐵材料為由Fe3O4包裹的鐵單質(zhì)，同時具有單質(zhì)鐵和氧化鐵的特性。設(shè)置4個濃度的納米鐵(0mg·L-1、20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1)處理，觀察對2個品種紅三葉種子萌發(fā)和幼苗生長特性的影響，旨在探究納米鐵在紅三葉種子萌發(fā)時期對其影響及作用機制，為牧草種植管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：本試驗所用400 mg·L-1納米鐵(粒徑43.5nm)來自甘肅谷碩納米農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司。“海發(fā)”(HF)、“瑞德”(RD)紅三葉種子購買于蘭州種子市場。

1.2 種子發(fā)芽試驗

先用清水清洗種子5min，用2%次氯酸鈉溶液浸泡30min，再用蒸餾水清洗，待用。

用蒸餾水將400mg·L-1納米鐵溶液稀釋至20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1，用吸管取20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1的納米鐵溶液5mL放入鋪有2層濾紙、內(nèi)徑為9cm的一次性培養(yǎng)皿中，標記各處理。將紅三葉種子擺放入培養(yǎng)皿，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照條件為12h·d-1。每日向培養(yǎng)皿添加適量蒸餾水，保持濾紙濕潤。以未添加納米鐵溶液的作為對照。每個處理重復(fù)3次，每個培養(yǎng)皿放置100粒紅三葉種子。

將培養(yǎng)得到的植物幼苗全株于60℃下烘干，粉碎得到植物樣品。取10mg植物樣品，加入300μL40%乙醇溶液，在50℃下超聲提取30min，得到待測液，進行異黃酮和多糖的測定[15]。

1.3 數(shù)據(jù)采集

1.3.1 種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的測定

分別于紅三葉種子培養(yǎng)第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第7天，統(tǒng)計種子發(fā)芽情況。利用第3天發(fā)芽情況計算發(fā)芽勢，第7天計算發(fā)芽率。于第4天、第5天、第6天、第7天和第10天，分別從每個培養(yǎng)皿取5株長勢良好的紅三葉幼苗，測定芽高、根長和生物量。

種子發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)的計算：

GI=Σ(Gt/Dt)

式中，Gt為發(fā)芽試驗終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽日數(shù)；Σ為總和。

活力指數(shù)的計算：

VI=GI×S

式中，GI為發(fā)芽指數(shù)；S為幼苗重量，g。

1.3.2 幼苗異黃酮含量的測定

紅三葉異黃酮含量的測定采用分光光度法。以芒柄花素為標準品，準確配制濃度為0.057mg·mL-1的標準溶液。分別準確移取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL、2mL、3mL于7個10mL容量瓶，用40%乙醇分別定容，搖勻后于275nm處測定吸光值，參比為空白試劑。取樣品提取液按上述方法于275nm處測定吸光值，計算樣品中的異黃酮含量。

1.3.3 幼苗多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸比色法[16,17]。用蒸餾水配制0.1mg·mL-1葡萄糖標準液，分別取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL的0.1mg·mL-1葡萄糖標準液于10mL的試管中，分別加入0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL和0mL蒸餾水，再依次向各試管中加入0.5mL濃度為5%的苯酚溶液和2.5mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置30min，測定每個樣品于490nm處的吸光值。取0.1mL的樣品溶液置于10mL試管，加入0.4mL蒸餾水，如上操作計算樣品中的多糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS Statistic 24.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗，顯著性水平為P<0.05。使用單因素(One-way ANOVA)和Duncan法進行方差比較和多重比較。

2 試驗結(jié)果

本試驗通過分析檢測納米鐵對紅三葉種子在不同天數(shù)發(fā)芽率的變化，以及幼苗芽高、根長、生物量和次生代謝物的影響，研究其對紅三葉種子萌發(fā)的影響情況。

2.1 納米鐵對種子發(fā)芽的影響

為了充分了解納米鐵的作用效果，本文選用了發(fā)芽率具有顯著性差異的2個紅三葉品種進行，“海發(fā)”種子在不同處理下的發(fā)芽率均顯著高于“瑞德”種子，約60%的“海發(fā)”種子在試驗第1天就已萌發(fā)，而“瑞德”種子在第1天的發(fā)芽率僅有約30%，在第2天才能達到60%左右的發(fā)芽率。如圖1所示，雖然納米鐵在第1天和第2天對2個品種的發(fā)芽率都有一定的促進作用，特別是高濃度處理，但整體而言，納米鐵對“瑞德”與“海發(fā)”種子的發(fā)芽率無顯著影響。

注：a、b分別為“瑞德”和“海發(fā)”種子的發(fā)芽率；D1、D2、D3、D4、D5、D7表示天數(shù)；0、20、50、100表示不同濃度的納米鐵處理。

2.2 納米鐵對幼苗生長的影響

2.2.1 芽高

如圖2所示，2個品種幼苗生長在第4天、第5天、第6天和第7天存在顯著差異，未添加納米鐵處理中“瑞德”品種的芽高均顯著低于“海發(fā)”。納米鐵處理后的“瑞德”在第4天芽高顯著增加，和“海發(fā)”幼苗無顯著性差異，但在隨后的時間里與未添加處理無顯著差異，“瑞德”芽高均小于“海發(fā)”。在第10天時，2個品種芽高已無顯著性差異。

綜合幼苗生長4～10d的情況來看，納米鐵對“瑞德”幼苗影響相對較大，特別是在第4天。而“海發(fā)”幼苗在施加20mg·L-1納米鐵的處理下芽高略高于其他處理。

注：小寫字母表示與對照組在P<0.05水平差異顯著；下同。

2.2.2 根長

如圖3所示，在幼苗生長的4～10d中，各處理下“海發(fā)”幼苗的根長均極顯著高于“瑞德”幼苗(P<0.01)。

與對照相比，不同濃度的納米鐵對“海發(fā)”幼苗的根長無顯著性影響。對于“瑞德”幼苗，僅在幼苗生長第4天時，20mg·L-1處理根長顯著高于對照。綜合幼苗生長4～10d的情況來看，“瑞德”幼苗在100mg·L-1的納米鐵處理下根長略高于其他處理，“海發(fā)”幼苗在50mg·L-1的納米鐵處理下根長略高于其他處理。

2.2.3 生物量

納米鐵對幼苗生物量的影響如圖4所示，幼苗生長第4天時納米鐵處理的“瑞德”幼苗生物量均顯著高于對照組，但幼苗生長5～10d時，“瑞德”各處理之間無顯著性差異。“海發(fā)”幼苗生長4～10d中，不同處理下幼苗生物量均無顯著性差異。2種品種相比，相同處理下“海發(fā)”幼苗生物量顯著高于“瑞德”。

從圖3中觀察可得，幼苗生長至第6天前，施加一定濃度的納米鐵的幼苗生物量略高于對照組，但在生長第7天后，施加納米鐵的處理生長速率放緩，對照組生物量略高于施鐵處理。

圖3 納米鐵對紅三葉根長的影響

圖4 納米鐵對紅三葉生物量的影響

從表1可知，2種品種相比，“海發(fā)”的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于“瑞德”，但同一品種不同處理之間種子的發(fā)芽指數(shù)無顯著差異，說明納米鐵對紅三葉種子發(fā)芽無顯著性影響。“瑞德”的活力指數(shù)遠低于“海發(fā)”，約為“海發(fā)”的1/2。納米鐵處理對紅三葉種子活力具有一定影響，“瑞德”100mg·L-1處理顯著高于對照，“海發(fā)”50mg·L-1處理顯著高于對照。

2.3 納米鐵對幼苗代謝的影響

植物的次生代謝反映了植物適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的結(jié)果，是植物用于提高自身抗性、調(diào)節(jié)植物生長的一個重要方式[28]。因為幼苗量少，所有其多糖和異黃酮的測定無法進行重復(fù)性試驗，但目前的數(shù)據(jù)結(jié)果仍能明確反映出納米鐵對幼苗生長階段的影響。

2.3.1 多糖含量的變化

種子萌發(fā)后幼苗的生長會消耗種子中儲存的營養(yǎng)物質(zhì)，從圖4中觀察可得，不同處理下種子萌發(fā)后第5天、第6天均有多糖含量迅速提升的階段。紅三葉幼苗多糖含量在生長過程中呈現(xiàn)下降趨勢，這可能與多糖作為種子中重要的能量存儲物質(zhì)有關(guān)。其中，“海發(fā)”的多糖含量大多高于“瑞德”，這與其幼苗生物量情況相符。“瑞德”100mg·L-1處理和“海發(fā)”50mg·L-1的多糖含量均表現(xiàn)為較低水平，而這2個處理的活力指數(shù)是在不同處理中最高。但值得注意的是，“海發(fā)”在第7天和第10天時，納米鐵處理明顯增加了幼苗多糖含量。

“瑞德”幼苗對照組4～10d的多糖含量經(jīng)歷先減少后增加再減少的過程，代表了種子生長消耗糖類、脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類、糖類再消耗用于生長的過程。100mg·L-1納米鐵促進了“瑞德”幼苗的萌發(fā)和初期生長，但發(fā)育到6～10d后，“瑞德”幼苗的多糖含量顯著低于其他處理，這可能是因為種子萌發(fā)和生長導(dǎo)致種子中儲存的營養(yǎng)物質(zhì)消耗較大，而50mg·L-1處理處理雖然在生長的7～10d也存在消耗較大的問題，但在7～10d多糖含量已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的上升趨勢。

表2 納米鐵對紅三葉幼苗多糖含量的影響

2.3.2 異黃酮含量的變化

異黃酮是紅三葉體內(nèi)重要的抗逆物質(zhì)，具有抗氧化等活性，幼苗階段植株對外界培養(yǎng)條件響應(yīng)敏感，因此波動較大。如表3所示，隨著幼苗生長，紅三葉體內(nèi)的異黃酮含量總體呈上升趨勢。納米鐵對2個品種異黃酮含量影響情況不同，對照的“瑞德”異黃酮含量保持在相對較高的水平上，而對于“海發(fā)”50mg·L-1處理下含量較高。20mg·L-1處理下，2個品種的異黃酮含量均處于較低水平。

2.3.3 相關(guān)性分析

從表4相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅三葉生長指標(芽高、根長、生物量)之間均為極顯著相關(guān)，異黃酮對紅三葉根長和生物量的發(fā)展具有顯著的促進作用。雖然多糖與各項指標之間無顯著相關(guān)性，但在生長過程隨著芽高、根長和生物量的增加，多糖呈現(xiàn)出負增長，與其作為能量物質(zhì)的特性相關(guān)。

表3 納米鐵對紅三葉幼苗異黃酮含量的影響

表4 紅三葉幼苗各指標間的相關(guān)性分析

3 討論

種子活力是優(yōu)質(zhì)種子的基本特點，其不僅包括種子的發(fā)芽能力，還涉及到種子幼苗的成活率和生長力乃至作物產(chǎn)量[18]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米鐵對紅三葉種子發(fā)芽率無顯著影響，但施加納米鐵能顯著提高種子的活力指數(shù)。

幼苗生長也是種子活力的表現(xiàn)之一，納米鐵對2個品種紅三葉的芽高、根長、生物量均無顯著影響。施加50mg·L-1納米鐵的“海發(fā)”幼苗的芽高和根長均較對照組略高，而不同濃度納米鐵對“瑞德”幼苗的生長指標均無促進作用，不過第4天時，施加納米鐵的“瑞德”幼苗芽高均顯著高于對照組，可能是因為納米鐵使得“瑞德”種子提前發(fā)芽。綜合“瑞德”與“海發(fā)”幼苗的生長情況，施加納米鐵能夠促進幼苗地上部分的生長，但對幼苗的根系發(fā)育無顯著影響。這與Sundaria等[19]的研究結(jié)果一致，用一定濃度的納米Fe2O3引發(fā)小麥可以顯著增加小麥的株高。這可能是由于納米鐵易被植物吸收，促進了植物中葉綠素的合成，從而加快了地上部分的生長。

異黃酮作為紅三葉的重要功能成分物質(zhì)，與根長和生物量積累具有顯著正相關(guān)，對于提高植物防御能力和種群競爭力都有重要意義。紅三葉種子的多糖作為能量存儲物質(zhì)，而且最新研究結(jié)果表明，紅三葉多糖還具有顯著的抗氧化活性[15]，與異黃酮一起對幼苗生長提高防御和保護。納米鐵處理對紅三葉中異黃酮和多糖含量未見顯著影響。

本文結(jié)果不夠顯著，可能是因為濃度較低。但是對于納米肥料而言，如果大量試用就不夠經(jīng)濟，也無法體現(xiàn)納米肥料綠色高效的特點。本研究結(jié)果表明，納米鐵肥對紅三葉種子發(fā)芽和幼苗生長的促進作用不夠顯著。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，納米鐵應(yīng)用于紅三葉種子種植過程中較為安全，不僅無顯著性抑制作用，還有一定的促進效果。100mg·L-1以內(nèi)的納米鐵處理對紅三葉種子發(fā)芽率影響較小，對幼苗生長有一定促進作用，但不同品種影響效果相差較大。此外，紅三葉異黃酮代謝與幼苗根長、生物量積累有著顯著正相關(guān)，納米鐵對不同品種紅三葉的影響效果也不同。本文結(jié)果將對紅三葉種植過程中納米肥料的精準施用提供理論指導(dǎo)。