ROP信號途徑在細胞極性發育中的研究進展

呂暢 周利明

(華北理工大學生命科學學院，河北 唐山 063210)

ROP(Rho-like GTPase from plants)是植物中介導信號傳導的Rho類小G蛋白(small GTPases)，參與調控細胞極性建成、細胞壁的合成、過氧化氫的生成、胞吞與胞吐等方面[1]。如圖1所示，ROP有結合GTP的活性形式和結合GDP的非活性形式2種狀態。當細胞接受上游信號刺激后，鳥苷交換因子(Guanine nucleotide exchange factor,GEF)通過鳥苷交換作用，將與GDP結合的非活性形式的ROP轉變為與GTP結合的有活性的形式。有活性的ROP通過與一個或多個效應子相互作用，以傳遞不同的分子信號。GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein,GAP)促進小G蛋白結合的GTP水解，從而將ROP轉變成非活性狀態。大部分ROP存在膜結合態和胞質游離態2種形式，二者形成動態平衡。但只有與膜結合的ROP才可以被鳥苷交換因子GEF激活。在胞質中，ROP與鳥苷解離抑制因子(Guanine nucleotide dissociation inhibitor,GDI)結合，被隔離于胞質中處于無活性的儲備狀態[2-4]。簡而言之，GDI和GAP是ROP的負調節因子，而GEF則被認為是ROP的正調節因子。ROP在胞質中和質膜上的循環以及活性和非活性形式的轉換，構成一個高度動態的平衡，使得各種信號都能得到靈敏的響應。ROP作為植物中一類重要的分子開關，可與多種上游調節因子和下游效應因子發生相互作用，產生了一系列復雜的信號網絡，以此調控多種細胞類型的生長過程[5]。

圖1 ROP的調控模式圖

1 植物細胞極性發育的模式系統

細胞極性是細胞發育的基本屬性之一，從廣義上講稱之為細胞的不對稱性，需要通過細胞骨架和囊泡運輸導致極性的建立和維持[2,6]。植物細胞極性是生命周期中每個階段發育、生長和形態建成的基礎。隨著擬南芥發展成為模式植物，擬南芥的單細胞系統(花粉管或根毛)或多細胞系統(葉片鋪板細胞)已成為研究植物細胞極性發育與形態建成的理想模式系統[7]，見圖2。

花粉管萌發和生長是一個復雜的動力學過程，需要快速生長(最快可達1cm·h-1)，是一類典型的單細胞極性生長系統[8]。大多數植物細胞在體外培養時會失去其固有的極性，而體外培養的花粉管仍舊保持其發育狀態和生長極性。體外培養的便捷性以及實時成像系統的不斷升級，使花粉管成為植物細胞極性研究中的理性模式系統[9]。目前，花粉管頂端生長機制的研究主要集中在2個相互關聯的方面：頂端聚焦的鈣離子梯度和ROP信號網絡。兩者都可以反饋調節肌動蛋白細胞骨架的動態，從而構成花粉管頂端生長過程中復雜的信號調控網絡[10]。

葉片鋪板細胞如同拼圖游戲中的模塊相互嵌合生長在一起，局部地區向外特定生長，形成凸起區域(lobes)。而另一相鄰區域則被抑制生長，形成凹陷區域(indentations)。具備凸起與凹陷結構特征的鋪板細胞的形成是一個復雜和動態的極性建成過程。另外，相鄰細胞之間的凸起和凹陷的精確匹配(一個細胞的凸起剛好嵌套在相鄰細胞的凹陷中)，見圖2，需要細胞間精巧的時空調節[11]。因此，葉片鋪板細胞不僅可以用于研究細胞內復雜的極性發育過程，也可作為研究細胞間協調的極性模式系統。

圖2 植物細胞極性生長模式系統

2 ROP在細胞極性發育中的功能多樣性

擬南芥中基因組中存在11個ROP，系統發育學將這些ROP分為4組，見圖3。I組只包括ROP8；II組包括ROP9、ROP10及ROP11；III組只包括ROP7；IV組包括ROP1～ROP6這6個ROP基因[12]。

2.1 ROP控制花粉管的延伸

ROP1、ROP3及ROP5在功能上存在著冗余性，CA-ROP1、CA-ROP5和過量表達的野生型ROP1或ROP5都可促進花粉管的去極化生長[13,14]。定位于質膜上的ROP1在花粉管頂端被激活，進而作用于下游的效應子RIC3和RIC4。前者可以引起花粉管頂端的鈣離子積累，進而促進微絲的解聚。而后者可促進頂端微絲的聚合。2條通路相互拮抗，調控微絲動態，最終達到影響花粉管極性建成的作用[15]。

ROP1的活性是調節花粉管極性生長的關鍵因素。ROP1在頂端的分布存在周期性的震蕩作用，并早于花粉管的生長周期震蕩，說明ROP1的活性震蕩引導著花粉管生長的震蕩[16,17]。另外，RIC3所介導的Ca2+信號在花粉管生長過程中同樣存在震蕩現象[18]。Ca2+的震蕩周期晚于ROP1活性的震蕩周期，說明Ca2+與ROP1之間可能存在一個負反饋的調節作用，預示著Ca2+信號相關調控因子可能參與到Ca2+與ROP之間的負調節機制中[7]。

圖3 擬南芥ROPs的系統發育分析

2.2 ROP調控根毛的發育

根毛的形態建成是個非常復雜的過程。根毛形成細胞底端膨大，而后如同花粉管的生長方式一樣，在膨大細胞的頂端進行極性生長。利用GFP熒光標記，發現ROP2分布在根毛延伸區域的頂端。在根毛中表達CA-ROP2、ROP4或ROP6可以導致各向輻射生長或根毛長度增加，而過量表達DN-ROP2則會抑制根毛的生長[19]。這些研究都證實了ROP控制根毛的極性生長與花粉管中的情況類似，根毛中的ROP也是通過調節頂端鈣離子積累和微絲動態來實現其功能的[15,19]。

除了調控根毛的頂端生長外，ROP還參與了根毛膨大位點的形成和極性生長位點的建立。過量表達ROP2后，根毛形成的細胞膨大位點無法正確定位而導致同一個根毛細胞會形成多個分支結構[19]。極性生長是一種依賴于微絲的輻射生長，而頂端位點的建成是被微管所調節，所以ROP在早期根毛發育與伸長時期的頂端生長中所起的調控機制有所不同[4]。

2.3 ROP調控葉片鋪板細胞的發育

葉片鋪板細胞是一類研究細胞與細胞間協同生長，以及調控彌散生長的理想模式系統。鋪板細胞的形狀建成主要取決于微絲和微管的排列方向。CA-ROP2和DN-ROP2突變體中的鋪板細胞發生了顯著的形狀改變[20]。ROP2與ROP4擁有高度的同源性，二者在葉片鋪板細胞的突起區域的頂端被激活，可以激活RIC4引起微絲的形成，促進鋪板細胞的突起區域的生長；同時ROP2又在突起區域頂端抑制RIC1的功能。RIC1是植物特有的微管結合蛋白，能促進鋪板細胞凹陷區微管的有序化排列，抑制該處細胞的側向擴張，同時有序排列的微管還可反饋抑制ROP2的活性。兩條途徑相互拮抗，共同調控葉片鋪板細胞的生長[21]。

3 ROP的調控因子及其下游效應子

ROP小G蛋白可與多個上游調控因子及下游效應子相互作用，這一點Rho類小G蛋白在酵母及動物中也同樣存在。ROP互作因子的多樣性使之成為重要的信號分子開關并具備多樣的生物學功能[4]。

3.1 ROP的上游調控因子

已發現擬南芥中存在14個RopGEF基因，都包括一段保守的功能未知的結構域(DUF315)，以及可變的C-端和N-端。分別過表達RopGEF1、RopGEF8、RopGEF9、RopGEF12及RopGEF14，可造成不同程度的花粉管去極化生長。其中，以RopGEF1所誘導的去極化生長最為嚴重。另外，RopGEF1、RopGEF8、RopGEF9、RopGEF14都定位在花粉管頂端質膜上。共表達RopGEF1和DN-ROP1，可抑制RopGEF1過表達所誘導的去極化生長，說明RopGEF1在花粉管的極性生長中可能激活ROP1[22]。

GAP是一類Rho類小G蛋白的失活因子。通過酵母雙雜交技術發掘出一組RopGAP。這些RopGAP都含有一段GAP的催化結構域，并且與哺乳動物中的Cdc42 GAP擁有高度的同源性[23]。體外試驗證實，RopGAP可以顯著促進結合在ROP上的GTP水解，但對于結合在Cdc42的GTP水解卻影響不大，所以這一類RhoGAP是一類ROP特異作用的GAP。RopGAP包含一段CRIB(Cdc42/Rac-interactive binding)結構域，處于GAP結構域的上游[1]。對CRIB結構域中的關鍵位點進行突變，可以顯著抑制RopGAP1的活性及其與ROP1的結合能力，說明RopGAP1中的CRIB結構域是促進GTP水解的關鍵區域。另外，CRIB結構域決定了RopGAP1在花粉管頂端質膜的定位，并且影響RopGAP1負調節因子功能的發揮[23]。

利用RopGAP4功能缺失突變體，已經證實RopGAP4負反饋調節ROP信號途徑。在氧脅迫的條件下，RopGAP4功能缺失突變體中有高水平的ROP活性。同時氧脅迫下激活的ROP信號和H2O2又可以促進RopGAP4的表達，這些結果預示著RopGAP4介導了ROP的負反饋調節[24]。擬南芥基因組編碼6個RopGAP基因，其同源基因廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中。除了保守的CRIB和GAP結構域，RopGAP的N端和C端個體間存在較大差異，說明不同的GAP可能執行不同的生物學功能[23]。

3.2 ROP的下游效應子

酵母和哺乳動物中Rho類小G蛋白可以激活多種功能不同的效應子[2]。效應子和GTP形式的小G蛋白結合，利用酵母雙雜交技術分離出含有CRIB結構域的ROP效應因子，命名為RIC(Rop-interactive CRIB-containing protein)[25]。RIC優先結合有活性的小G蛋白，而不與結合GDP的小G蛋白作用。目前擬南芥中已證實有11個RIC蛋白，除了CRIB結構域外，其他部分有著較大不同。采用基因槍轉化的方法將9個RIC在煙草的花粉中進行瞬時過量表達，發現RIC過量表達呈現出以下幾種類型：RIC3和RIC4過量表達造成花粉管去極化生長；RIC10過量表達促進花粉管生長；RIC5過量表達抑制花粉管的生長；其他的RICs過量表達抑制花粉管的生長。另外，不同的RICs有著不同的花粉管亞細胞定位：RIC1、RIC4、ROP5、ROP6與ROP7定位于頂端質膜上；RIC2定位于頂端及亞頂端的質膜上；ROP9定位于整個質膜上；ROP10定位在細胞質中；RIC3定位在細胞質中，但在靠近頂端的區域相對集中。ROP1的過量表達對不同RIC的定位及表型的影響也不同。ROP1可以顯著增強RIC4在頂端膜上的定位，但對于RIC2、RIC5及RIC9的影響則不大[25]。大部分RIC基因在多種擬南芥組織中都有表達，在其他植物中也有RIC的同源基因存在，這說明RIC蛋白作為ROP受體作用的廣泛性。不同的ROP擁有不同的下游效應子，以此調控不同的細胞功能[1,7]。

4 展望

近年來，利用幾種植物模型系統(花粉管、根毛或鋪板細胞)在細胞信號和極性形成領域取得了一定的研究進展[1,2,26]。ROP作為植物中唯一的一類小G蛋白，通過調節細胞骨架和囊泡運輸來控制細胞極性的建立，已成為植物細胞信號轉導領域中重要的分子開關[3]。盡管通過酵母雙雜交方法揭示了幾種獨特的ROP調節因子和效應子，但ROP定位及激活的分子機理仍然有待探索。另外，ROP如何控制下游效應子，進而影響植物特定的功能，也需要進一步探索。RIC作為ROP下游潛在的靶蛋白，將ROP和各種下游通路有效的整合在一起，因此發掘RIC互作蛋白對于理解ROP控制下游通路的機制具有重要作用。

鈣離子對于調控花粉管的生長和導向，起著至關重要的作用[10,27]。正在生長中的花粉管頂端可以形成鈣離子的濃度梯度[18,28]。ROP信號途徑中存在鈣離子介導的反饋調節系統，可以調節ROP的動態活性，進而影響花粉管的極性生長[7]。植物細胞中已被證實存在許多鈣離子感受器，其可以感知并傳遞鈣信號的波動。其中，鈣依賴蛋白激酶(CPK)由一個激酶區域和一個類CaM區域組成，所以其既是Ca2+的感受器，又是一個效應因子[29,30]。本研究團隊發現，花粉特異表達的CPK參與細胞極性信號傳導，但尚不清楚是否涉及ROP的負反饋調節機制。隨著遺傳學工具、細胞學標記、生化與分子生物方法的不斷升級，相關突出問題將會在不久的將來實現實質性的突破。