玉竹組織培養外植體滅菌研究

胡亞龍李聰蔡任躍賀瑩余國梁楊華

(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.博觀生物科技有限公司，湖南 長沙 410205)

玉竹(Polygonatum odoratum(Mill.)Druce)為百合科黃精屬多年生草本植物，又名萎蕤、地管子、尾參等[1]。始載于《神農本草經》，明代李時珍以“萎蕤”之名將其列在《本草綱目》草部山草類[2]。玉竹根狀莖入藥，性味甘、微寒，有養陰潤燥、生津止渴的功效[3]。玉竹不僅可以藥用，在我國多個省份和其它國家還作為保健品、飲料、食品和化妝品等。玉竹含有多糖類、甾體皂苷類、黃酮類和生物堿、氨基酸，以及多種微量元素。藥理研究表明，玉竹有降血糖、抗腫瘤、抗衰老和增強免疫力等功效，越來越受到人們的青睞。

玉竹在我國中藥材市場中的份額不斷攀升，其市場廣、利潤高，成為農民喜愛種植的中藥材[4]。但玉竹的生產過程中，因人工選育，種資退化，不產生種子，所以通過組織培養快速大量繁殖玉竹良種種苗，成為解決種苗問題的有效途徑[5]。玉竹組培外植體取自農田生長的植株，均帶有微生物病菌，外植體表面滅菌是組培的重要步驟之一。同時，玉竹含糖量高，組織培養過程中更易滋生微生物，因此玉竹組織培養外植體滅菌研究顯得尤為重要。筆者對不同殺菌劑，以及不同消毒方法的消毒效果進行研究，以篩選出適合玉竹組織培養的滅菌體系。本試驗的目的在于降低玉竹外植體組織培養過程中的污染率，以獲得足夠的無菌材料，保證玉竹組培快繁體系研究的順利開展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

試驗材料為玉竹根莖，取自于邵東南國藥都實驗基地，選擇生長健康的玉竹作為材料。

1.1.2 試驗器材與試劑

XFH-30高壓蒸汽滅菌鍋(浙江新豐有限公司)、JP-100PLUS超聲波清洗儀(深圳市潔盟清潔有限公司)、98%高純度多菌靈(MACKLIN)、0.1%氯化汞(湖南農業大學實驗試劑管理處)、次氯酸鈉(汕頭市蓮塘化工有限公司)、乙酸(滬試化工有限公司)、MS培養基(國藥集團化學試劑有限公司)、6-BA(茉鋇特有限公司)、NAA(茉鋇特有限公司)、植物凝膠(Coolaber)。

1.2 試驗方法

1.2.1 滅菌處理

挑選健康玉竹根莖，切下芽尖作為組織培養外植體，每組100個，用無菌水預沖洗3次，分別進行處理,如表1所示；2個殺菌劑復合作用時，先浸泡A殺菌劑，無菌水沖洗3遍再泡B殺菌劑，浸泡完后再用無菌水沖洗3遍，每種滅菌方法進行3組重復。在消毒劑浸泡期間不時搖晃，使外植體與消毒劑充分接觸。

表1 外植體滅菌方法

1.2.2 接種

經上述消毒處理后，將玉竹外植體放在無菌濾紙上吸干水分，轉接至培養基上進行培養，接種培養基采用MS加6-BA 3mg·L-1加NAA 1mg·L-1加蔗糖10g·L-1加植物凝聚2.5mg·L-1，培養基(pH5.8)，培養溫度為(25±2)℃，光照強度1500～20001x，光照時間12h·d-1[6]。

1.3 觀察指標

培養期間，每天觀察玉竹芽尖組織生長和污染情況，統計污染率和發芽率，其計算方法見公式：

幼芽污染率=(污染幼芽數/消毒幼芽數)×100%

(1)

幼芽成活率=(成活幼芽數/消毒幼芽數)×100%

(2)

1.4 數據處理

采用SPSS統計分析軟件對試驗數據進行方差分析及最小顯著差異性檢驗，用Excel 2010進行數據整理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 單一殺菌劑對玉竹外植體的影響

由表2可知，分別用A組(0.2%多菌靈)、B組(10%次氯酸鈉)、C組(0.1%升汞)浸泡玉竹外植體，相同作用時間，0.1%升汞處理后外植體污染率<10%次氯酸鈉處理后外植體污染率<0.2%多菌靈處理后外植體污染率。結果表明，單一滅菌劑相同滅菌時間處理外植體時，0.1%升汞對玉竹外植體的滅菌效果優于0.2%多菌靈、10%次氯酸鈉。說明升汞對玉竹外植體上的病原菌有較好的殺滅和抑制作用。這3種滅菌劑中，多菌靈的滅菌效果最差，可能是玉竹種植過程中長期使用多菌靈浸種導致病原菌對多菌靈產生耐藥性。分析數據可知，隨著玉竹外植體的污染率上升，成活率在下降，說明外植體一旦滅菌效果不好就會滋生病菌，從而導致外植體在組織培養過程中死亡。其中，C1組(0.1%升汞浸泡5min)滅菌效果最好，外植體污染率為8.33%，成活率為91.67%。升汞作為強力滅菌試劑，其滅菌效果好，滅菌較為徹底，且短時、高效[7]。但因其屬于劇毒試劑，安全系數低往往在應用時較為受限。

圖1 滅菌處理試驗結果

2.2 殺菌劑復合使用對玉竹外植體的影響

由圖1可知，分別用D組(0.2%多菌靈加0.1%升汞)、E組(0.2%多菌靈加10%次氯酸鈉)、F組(10%次氯酸鈉加0.1%升汞)浸泡玉竹外植體，3種處理方法對玉竹的外植體滅菌效果都比較好，但D、F組略優于E組。其中，F3組(10%次氯酸鈉加0.1%升汞，分別浸泡15min)滅菌效果最好，外植體污染率為1.67%，成活率為96.67%。結果表明，2種殺菌劑復合使用時比單一殺菌劑的滅菌效果好，含有0.1%升汞的滅菌組合效果更佳。可以看出，殺菌劑復合作用時可有效解決外植體病原菌的耐藥性問題，所以在玉竹的農業種植過程中可復合使用殺菌劑或者每年不同殺菌劑交替使用，可有效解決病原菌的耐藥性問題。

表2 單一殺菌劑對玉竹外植體的影響

表3 殺菌劑復合使用對玉竹外植體的影響

2.3 殺菌時間對玉竹外植體的影響

由圖1可知，在利用殺菌劑進行外植體表面滅菌時，隨著浸泡時間增加，污染率會降低，但殺菌劑對外植體的傷害也會增加，植物體細胞受損越來越嚴重，導致外植體抵抗病原菌傷害的能力減弱，污染率逐漸上升，從而導致外植體的存活率降低。可以看出，并不是浸泡殺菌劑時間越久越好，浸泡時間太短則殺菌不充分，浸泡時間太長則對植物體細胞損傷過大，兩者都會導致外植體死亡。該研究結果表明，外植體浸泡殺菌劑的時間在10～15min為宜。

2.4 超聲波清洗對玉竹外植體的影響

表4 超聲波清洗對玉竹外植體的影響

本實驗G組和H組在A組和E組的基礎上增加使用超聲波清洗，結果表明，無論是單一殺菌劑還是2種殺菌劑復合處理，在結合超聲波清洗后，都降低了外植體的污染率，提高了外植體的成活率。H3組(0.2%多菌靈浸泡15min，10%次氯酸鈉浸泡15min，超聲波處理15min)可使污染率降至3.67%，成活率為95.00%。由此可見,超聲波處理對外植體滅菌能起到較好的優化效果。原因可能是經過殺菌劑處理后病菌活性降低，再通過超聲波清洗可使病菌更易從外植體脫離，具體原因有待后續實驗探討。如果從實驗室安全角度考慮，不含升汞的H3組可作為備用方案，其滅菌效果幾乎和F3組相當。增加超聲波清洗步驟，提升了外植體滅菌效果，同時可以替代毒性較大的含升汞的滅菌方案。

3 結論與討論

研究結果顯示，最優滅菌方案為F3組(10%次氯酸鈉加0.1%升汞，分別浸泡15min)，污染率為1.67%，成活率為96.67%。將處理后的玉竹芽尖接種在培養基上，此時玉竹芽尖污染率低，生長迅速，且外植體成活狀態好。本次選用的3種殺菌劑中，升汞對玉竹外植體上的病原菌有較好的殺滅和抑制作用，所以含有升汞的滅菌組合效果更佳。當2種殺菌劑復合使用時比單一殺菌劑的滅菌效果好。殺菌劑浸泡外植體的時間并不是越長越好，浸泡時間太長則對植物體細胞損傷過大，外植體浸泡殺菌劑的時間在10～15min為宜。外植體滅菌過程中增加超聲波清洗步驟可提高滅菌效果，不含升汞的H3組(0.2%多菌靈浸泡15min，10%次氯酸鈉浸泡15min，超聲波處理15min)可作為備用方案，其滅菌效果比F3組略差，但方案的安全性更高。

外植體滅菌是植物組織培養能否成功的關鍵因素之一，因此找到一種快速、高效的外植體消毒方法，對于提高植物組織培養的效率和成功率至關重要。常用的消毒劑種類主要有次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫、升汞、抗生素及硝酸銀等[8]；其中，升汞的滅菌效果得到廣泛認可，與本試驗結論一致[9]。但是，升汞屬于劇毒試劑，在實驗操作過程中存在一定的危險性，很多實驗室禁止使用，并且升汞不易采購。找到一種不使用升汞，同時滅菌效果突出的外植體滅菌方法一直是研究的熱點。本試驗通過殺菌劑復合使用并結合超聲波清洗，給出了替代含升汞的滅菌方案，但是滅菌效果略差于含升汞的滅菌方案，此問題在今后的研究中有待繼續優化。

隨著人們對農藥殘留和環境保護的重視，對外植體進行化學除菌有一定的限制性，未來物理除菌可能成為研究的熱點。對外植體進行物理除菌的方法包括光照、射線、紫外線、電離輻射、超聲波清洗，其中超聲波清洗除菌不會引起植株變異，未來可廣泛應用于植物外植體滅菌[10]。Dukhouse等研究用頻率20kHz和850kHz的超聲波分別與次氯酸鈉聯合殺菌，殺菌效果表明，20kHz的低頻超聲與次氯酸鈉同時作用時，除菌效果是最好的[11]。因此，未來可探究不同頻率超聲波的除菌的效果，找到最佳頻率，使滅菌達到更好的效果，超聲波清洗輔助外植體滅菌可以作為以后重點研究的方向。同時，超聲波清洗配合殺菌劑使用達到良好的除菌效果其作用機理目前尚不清楚，筆者推斷有多種不同原因。可能是超聲波清洗使殺菌劑處理后的病原菌更容易從外植體上脫離；可能是超聲波震蕩使藥劑更容易穿透病原菌的保護殼，從而殺死病原菌；也可能是超聲波本身對病原菌有一定的影響，破壞了病原菌的自身結構，起到了殺菌作用。超聲波清洗除菌的具體作用機理仍需進一步研究。

外植體滅菌是植物組織培養過程中重要的一環，一個優秀的滅菌方案是植物組織培養順利開展的關鍵。為更好地進行玉竹組織培養，降低玉竹外植體組織培養過程中的污染率，保證玉竹快速繁育研究的順利開展，筆者進行了本次試驗探究。玉竹屬于百合科黃精屬植物，百合、黃精等同科屬植物在進行植物組織培養時，都易受到病原菌的污染，本次試驗結果在同科屬植物外植體滅菌研究中也具有參考價值。