沉默RALA基因表達對前列腺癌細胞的增殖、遷移及凋亡的影響*

翁吳斌 劉昌明 張家彬 李國敏 薛清平 林寧峰 陳光炳

目前前列腺癌發病率為13.5%，位居男性全部惡性腫瘤第二位[1]，且隨著人口老齡化，其發病率和病死率將逐年升高，對社會和家庭均造成巨大負擔，因此尋找有效的治療方案成了當務之急。RALA 作為RAL（Ras 相關性蛋白，Ras-like）家族的一員，其基因最早由類人猿RALA 基因序列中分離出來的，定位在人類7 號染色體上，其長度為84 642 bp[2]。相關研究數據顯示RAL 家族蛋白在惡性腫瘤的生長、侵襲及轉移等生物行為中起著至關重要的作用，在包括結腸癌、肺癌在內的多種腫瘤中都發現RAL 家族基因的表達改變[2]。另有研究表明，在多種腫瘤的生長中，RALA 作為癌基因起著關鍵性作用[3]。在前列腺癌的發生、發展中是否存在RALA 的參與目前尚不明確。因此本研究通過小干擾RNA 沉默前列腺癌DU145 細胞株中RALA 基因的表達來觀察對DU145 細胞增殖、凋亡及遷移的影響，以及探討可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細胞株LNCap、PC-3 和DU145 購于中國科學院上海細胞庫。PRMI1640 培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清均購于北京賽默飛世爾科技有限公司；鏈霉素、青霉素來源于山東魯抗醫藥；PBS 緩沖液、細胞裂解液（RIPA）、RTPCR 試劑盒、Trizol 試劑購于杭州博日生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 購于Invitrogen 公司；Annexin V/PI 染色試劑、噻唑藍比色法（MTT）盒均購自北京鼎國生物技術有限公司；未包被基質膠 的Transwell 小室美國Sigma 公 司；PCR 引物和RALA-siRNA 由上海生工生物工程有限公司合成，于-20 ℃下保存；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL試劑盒均購于碧云天生物技術研究所；山羊抗兔IgG 第二抗體、山羊抗鼠IgG、兔抗人RALA 多克隆抗體第二抗體購于英國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人前列腺癌LNCap、DU145 和PC-3 細胞，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液進行傳代培養。每2～3 天更換一次培養液，維持培養液pH 值在7.2～7.4，當前列腺癌細胞以致密單層的形式平鋪在培養瓶壁上后則用于傳代，使用0.25%胰蛋白酶進行消化，實驗用的前列腺癌細胞采用對數生長期細胞。

1.2.2 RT-PCR 檢測前列腺癌DU145、PC-3 和LNCap 細胞中RALA mRNA 的表達水平 收集對數生長期的DU145、PC-3 和LNCap 細胞，按照Trizol試劑說明書，用Trizol 試劑提取細胞總RNA，取2 μg 總RNA 逆轉錄合成cDNA，并以該cDNA 作為模板，用RT-PCR 試劑進行PCR 擴增，檢測三種細胞株中RALA mRNA 的表達，以GAPDH 為內參照。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，RALA上游引物5′-ATCGGAAGAAGGTAGTGC-3′，下游引物5′-AAATCTGCTCCCTGAAGT-3′；GAPDH上游引物5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′，下游引物5′-AAGAATGGGAGTTGCTTTGAAGTC-3′，RALA 與GAPDH 擴增片段的長度分別為182 bp、700 bp。PCR 反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，56 ℃（RALA）/60 ℃（GAPDH）30 s，72 ℃ 30 s，共40 個循環。根據2-ΔΔCt法對數據進行相對定量分析。

1.2.3 分組轉染與MTT 法檢測細胞的增殖率 收集對數生長期的DU145 細胞，以細胞懸液的形式接種于6 孔細胞培養板中，每孔細胞數達5×105個，于孵育箱中培養。待細胞融合度達60%，利用LipofectamineTM2000 進行轉染（操作步驟參照LipofectamineTM2000 說明書），轉染RALA-siRNA為RALA-siRNA組，也即實驗組，轉染negativesiRNA 為陰性對照組，而在空白對照組中只加入等體積無血清RPMI-1640 培養液。在96 孔板中，將三組以5×104個細胞/mL 的密度進行接種，每孔100 μL，每組設4 個復孔，置于孵育箱中，分別培養12、24、48、72 和96 h 后在避光環境下添加5 mg/mL MTT，10 μL/孔，再培養4 h 后吸棄培養液，以150 μL/孔的量添加DSMO，然后放在搖床上低速震蕩，時間為10 min，于酶標檢測儀波長為490 nm 處檢測每個孔的OD值，作為細胞增殖的指標。實驗重復開展3次，然后繪制細胞的增殖曲線。

1.2.4 Transwell 法檢測細胞的遷移 收集對數生長期空白對照組、陰性對照組和實驗組的細胞重懸于RPMI-1640 培養液中，該培養液中含有1 mmol/L 的氯化鎂、0.2 mmol/L 的氯化錳、1 mmol/L 的氯化鈣及5 g/L 的牛血清白蛋白，調整細胞濃度為2.5×105/mL。在Transwell 上室中加入200 μL 重懸細胞液，在下室的每室中添加500 μL 含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液。置于孵育箱中培養12 h，取出小室，吸棄培養液，濕棉簽抹除沒有穿過小室膜的細胞，在室溫環境中4%多聚甲醛固定細胞15 min，1×PBS 緩沖液洗滌固定后的細胞3次，每次時長5 min，結晶紫染色時長3 min，1×PBS 緩沖液清洗干凈，干燥后置于100 倍光鏡下觀察計數并拍照。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞的凋亡率 轉染72 h后，置于離心機中進行離心，然后收集空白對照組、陰性對照組和實驗組的細胞，預冷PBS 緩沖液洗滌細胞3次，離心后去除上清液，應用200 μL Binding Buffer 重懸細胞，然后分別添加5 μL 的PI及10 μL 的Annexin V-FITC，輕輕混勻，在避光及室溫環境下反應20 min。通過流式細胞儀來測細胞的凋亡率，每次實驗重復開展3 次。

1.2.6 RT-PCR 檢測沉默RALA 基因后DU145 細胞株中RALA 基因的表達水平 轉染72 h后，收集空白對照組、陰性對照組和實驗組的細胞，按1.3 節的RT-PCR 法檢測DU145 細胞株中RALA mRNA 的表達水平。

1.2.7 Western blot 檢測沉默RALA 基因后DU145細胞株中RALA 蛋白的表達水平 轉染72 h后，收集空白對照組、陰性對照組和實驗組的細胞，用RIPA 提取細胞總蛋白（步驟參照RIPA 說明書）。BCA 法進行蛋白質定量，并根據定量結果調整平衡蛋白量。充分混勻等體積的上樣緩沖液與樣品，在98 ℃下變性5 min，室溫下冷卻。取10 μg 上樣在SDS-PAGE 凝膠上電泳，電泳結束后目的蛋白移到PVDF 膜上，進行膜的染色，5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，加入一抗RALA、GAPDH（工作濃度分別為1∶1 000、1∶2 000）4 ℃孵育過夜；加入相應辣根過氧化物標記的二抗（1∶1 000 稀釋），在室溫環境下平緩搖動，時間為1 h。濾紙干燥PVDF膜，根據ECL 試劑盒的說明書進行發光、壓片。

1.3 統計學處理 應用統計軟件SPSS 22.0 進行數據分析，計量資料以用（±s）描述，組間比較采用t檢驗或方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測前列腺癌細胞中RALA mRNA 的表達 收集對數生長期的DU145、LNCap 和PC-3細胞，應用RT-PCR 檢測細胞中RALA mRNA 的表達水平，以GAPDH 為內參照。其結果顯示：RALA在體外培養的DU145、LNCap 和PC-3 細胞中均有表達，且相對表達水平分別為（0.83±0.02）、（0.41±0.01）、（0.37±0.07），RALA 在DU145 細 胞中的表達水平最高（P＜0.05），見圖1。遂取DU145細胞作為后續實驗的研究細胞。

圖1 RT-PCR檢測前列腺癌DU145、LNCap和PC-3 細胞中RALA mRNA的表達

2.2 沉默RALA 基因對DU145 細胞增殖的影響 MTT 法測空白對照組、陰性對照組和實驗組DU145 細胞的增殖。結果顯示：轉染RALA-siRNA 2 d后，實驗組與空白對照組、陰性對照組相比較，其DU145 細胞的增殖速度明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞增殖情況的比較（±s）

表1 各組細胞增殖情況的比較（±s）

*與空白對照組、陰性對照組比較，P＜0.05。

2.3 沉默RALA 基因對DU145 細胞遷移能力的影響 用未包被基質膠的Transwell 小室檢測空白對照組、陰性對照組和實驗組細胞的遷移，結果顯示：實驗組穿膜細胞數（26.00±9.29）明顯少于空白對照組（157.00±16.03）及陰性對照組（149.01±12.03），實驗組與陰性對照組、空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 轉染RALA-siRNA抑制DU145細胞的遷移

2.4 沉默RALA 基因對DU145 細胞凋亡的影響轉染RALA-siRNA 72 h后，用流式細胞儀檢測空白對照組、陰性對照組和實驗組DU145 細胞的凋亡。空白對照組細胞的凋亡率為（2.71±0.78）%，陰性對照組細胞的凋亡率為（2.39±0.89）%，實驗組細胞凋亡率為（17.21±1.33）%，實驗組與陰性對照組、空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 轉染RALA-siRNA促進DU145細胞的凋亡

2.5 RT-PCR 和Western blot 檢測轉染RALAsiRNA 后DU145 細胞中RALA 的表達水平 轉染RALA-siRNA 72 h后，RT-PCR 檢測結果（圖4A）顯示實驗組RALA mRNA 的表達水平（0.21±0.03）明顯低于空白對照組（0.81±0.09）和陰性對照組（0.79±0.05），差異有統計學意義（P＜0.05）。Western blot 結果（圖4B、4C）顯示與空白對照組（0.82±0.03）、陰性對照組（0.80±0.02）比較，實驗組（0.21±0.03）DU145 細胞中RALA 蛋白表達明顯受抑制（P＜0.05）。

圖4 轉染RALA-siRNA后DU145細胞中RALA的表達水平

3 討論

前列腺癌在全球男性惡性腫瘤中的占比呈逐年遞增趨勢，與此同時，由于老齡化人口增多、生活壓力變大、生活飲食習慣改變及前列腺癌篩查普及等因素，我國前列腺癌發病率近年來呈明顯上升趨勢[4]。得益于前列腺癌篩查的開展，早期前列腺癌的診斷率明顯升高，但在我國仍有約60%患者就診時已處于前列腺癌晚期，已無法通過根治性治療獲得良好療效，需終生采用綜合性治療，主要采用內分泌治療[5-6]。目前，抗雄治療仍是晚期前列腺癌治療的首選方案，但絕大多數的患者經1 年半至2 年的內分泌治療，均會進展到去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）階段。雖然阿比特龍等新型雄激素生物合成酶抑制劑的使用，提高了患者的生存率，但耐藥性、副作用及價格昂貴等限制了其廣泛應用。因此目前前列腺癌基礎研究的重要及主要方向仍是尋找新的靶向基因。

在腫瘤的生長過程中，RAS 作為原癌基因發揮著重要及關鍵性的作用。RAS 基因的激活，并通過調控一系列下游信號通路，最終導致機體內腫瘤的形成。RALA 作為RAS 信號通路下游蛋白，在腫瘤的形成、發展中發揮重要作用[7]。RALA 是RAL 家族的一員，屬于小GTP 酶超家族，對細胞生物學功能具有重要的調控作用，包括信號轉導、基因表達、細胞骨架動力學、膜轉運和細胞分裂等[8-9]。研究表明，在腫瘤的生長、轉移及浸潤等方面，RAL 家族蛋白起著重要作用[10]。RAL 家族是一類低分子量的蛋白質，以兩種形式存在，分別為非活性的RALGDP 和活性的RALGTP[11-12]。RALA生物學功能主要通過非活性的RALAGDP 與活性的RALAGTP 兩種形態間的相互轉化得以實現，其過程受RAL 特異的鳥嘌呤核苷酸交換因子（RALspecific guanyl nucleotide exchange factor，RALGEF）調節[13]。在RAS 信號通路中RALGEF 介導惡性腫瘤的發生及發展，發揮關鍵性作用[14]。RALBP1（RALA binding protein 1）作 為RALA下游效應物，通過與活化的RALA 結合而得以激活[15-16]。活化RALBP1 能夠調控cyclin B-CDK1 的活性，從而促進細胞有絲分裂期的線粒體分裂。同時激活RALBP1 可活化Rac1 和Cdc42，兩者分別在遷移細胞細胞膜的變化及細胞絲狀偽足的形成中起著促進作用[15]。RALBP1 的結合蛋白REPS2/POB1（partner of RALBP1）的活性受RALBP1 調節。REPS2/POB1的表達在癌細胞中是呈抑制狀態的，當其過表達時能抑制癌細胞的生長及誘導其凋亡[17]。另外通過增強蛋白質轉換，活化的RALA 可以抑制Cdc42 所致的轉錄減少來抑制凋亡調節蛋白CFLAR（CASP8 and FADD-like apoptosis regulator）的表達，以此來抑制腫瘤細胞的凋亡[18-19]。散射因子（scatter factor，SF）是一種肝細胞生長因子，通過在腫瘤內大量堆積對抗腫瘤細胞的凋亡，而RALA 參與調解SF 通過NF-κB 信號通路介導對腫瘤細胞保護和抗凋亡[20-21]。本實驗將RALA-siRNA 轉染人前列腺癌DU145 細胞，結果顯示DU145 細胞增殖、遷移能力受抑制（P＜0.05），細胞凋亡明顯加劇（P＜0.05），細胞RALA 表達水平明顯下降（P＜0.05），說明沉默前列腺癌細胞中RALA 的表達能抑制其增殖、遷移，并促進細胞凋亡。

綜上所述，沉默RALA 基因能抑制人前列腺癌細胞在體外的增殖及遷移，并能促進細胞凋亡，其機制與沉默RALA 后抑制其下游蛋白（例如RALBP1）的活化相關，提示RALA 可作為治療前列腺癌新的靶向基因。