UCA1在AML患者骨髓組織單個核細胞中的表達及對AML細胞增殖凋亡調(diào)節(jié)作用觀察

李佳佳，伍燕平，白雪，王蒙，李忠玉，張平平

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，安徽蚌埠 233003

急性髓系白血病（AML）是一種高異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征為髓系增殖祖細胞的增殖分化失控，導(dǎo)致骨髓內(nèi)未成熟前體細胞異常蓄積、正常成熟血細胞的產(chǎn)生不足［1］。目前，AML患者的預(yù)后仍然較差，5年生存期仍小于40%［2-3］。因此，闡明AML發(fā)生發(fā)展的的基礎(chǔ)機制，有助于改善AML的治療效果。研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼 RNA（lncRNA）在AML的發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。LncRNA是一種長度超過200個核苷酸的RNA，通過調(diào)控基因表達參與各種生物過程［6］。LncRNA UCA1于2006年被確定為膀胱癌標(biāo)志物［7］。最新研究［8-11］發(fā)現(xiàn)，胃癌、乳腺癌組織中UCA1高表達，且UCA1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌作用。研究［11］證實，UCA1可抑制人原髓白血病細胞HL60的遷移，促進細胞凋亡［11］。另有研究［12］發(fā)現(xiàn)，UCA1敲低可降低兒童AML細胞的化學(xué)耐藥性，其機制可能為microRNA抑制了糖酵解（miR）-125a /己糖激酶2途徑。目前UCA1在AML發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制尚不明確。我們觀察了AML患者骨髓組織單個核細胞UCA1的表達變化，同時觀察抑制UCA1表達的AML細胞增殖、凋亡情況，并探討其可能作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人AML細胞株（U937，HL60）購自北納生物。 RPMI-1640培養(yǎng)基（用于U937；美國HyClone），IMDM培養(yǎng)基（用于HL60；美國Gibco）。培養(yǎng)基中補充10%的胎牛血清和L-谷氨酰胺（2 mmol/L； 美國 Gibco）。Wnt多克隆抗體（1∶300）、兔抗人β-catenin（1∶300）、兔抗人p-gsk-3?（1∶300），GAPDH（1∶1 000；均購自美國Abcam），二抗（美國Abcam），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（Mir-XTM miRNAFirst-Strand Synthesis Kit， TAKARA），UCA1-siRNA（抑制UCA1表達）和對照空載siRNA（上海GenePharma構(gòu)建），Lipofectamine?2000（美國Invitrogen）；MTT試劑盒（美國Sigma）；PCR試劑盒（GeneCopoeia， Rockville， MD， USA）；SYBR premix試劑盒（Takara）；微量離心機（美國Thermo Scientific） ；紫外分光光度儀（ 美國貝克曼，Du.640） ；細胞培養(yǎng)箱（中國力康）； 酶標(biāo)儀（美國Awareness） ；熒光定量PCR儀（ 7500型，美國ABI）； 凝膠成像分析掃描儀（美國Bio-Rad）；顯微鏡（日本尼康公司）；流式細胞儀（美國Bio-Rad）。

1.2 AML患者骨髓組織單個核細胞UCA1檢測方法

1.2.1 臨床資料 收集2019年5月—12月間于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科就診的初診AML患者30例作為實驗組、門診缺鐵性貧血患者30例作為對照組。初診AML患者中男16例、女14例，年齡25～82（59.93 ± 15.35）歲；染色體正常核型22例，染色體異常核型8例；存在基因突變患者18例，其中CEBPA基因突變3例、TET2基因突變4例、NPM1基因突變6例、FLT3基因突變5例。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)同意，納入者或其家屬簽署知情同意書。

1.2.2 AML及缺鐵性貧血患者骨髓組織單個核細胞UCA1檢測 AML及缺鐵性貧血患者均留取骨髓標(biāo)本，提取單個核細胞，-80 ℃保存。采用RT-PCR法檢測AML及缺鐵性貧血患者骨髓組織單個核細胞UCA1。TRIzol提取總RNA，取RNA樣品1 μL，測定純度和濃度。將得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR測量各組U937和HL60細胞中UCA1，PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60 ℃ 60 ℃ s，共42個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，UCA1上游引物5'-CACTCTTTGCCAGCCTCAGCTT-3'，下游引物 5'-AGGTGTGAGTGGCGGTCTGAAT-3'；GAPDH 上游引物5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，下游引物 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。以 2-ΔΔCt代表UCA1相對表達量，重復(fù)檢測3次，取平均值。

1.3 抑制UCA1表達的U937、HL60細胞增殖凋亡情況觀察

1.3.1 細胞分組及UCA1-siRNA轉(zhuǎn)染方法 取生長良好的U937、HL60細胞接種于6孔板，1×105/孔，待細胞生長至70%以上融合時進行后續(xù)轉(zhuǎn)染。將U937及HL60細胞各分為1、2、3組。1、2組分別用UCA1-siRNA和空載siRNA轉(zhuǎn)染，使用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒，所有操作均嚴(yán)格按照說明書進行。3組為空白對照，不作任何處理。轉(zhuǎn)染后將各組細胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染48 h取各組細胞，RT-PCR法檢測各組UCA1，確定UCA1轉(zhuǎn)染效率。U937細胞1、2、3組UCA1相對表達量分別為 1.00 ± 0.06、1.00 ± 0.09、1.00 ± 0.08，HL-60細胞 1、2、3 組 UCA1 相對表達量分別為 0.38 ±0.04、1.00 ± 0.01、1.00 ± 0.01，與 2、3 組比較，U937及HL-60細胞1組UCA1相對表達量低（P均＜0.05），提示UCA1-siRNA轉(zhuǎn)染成功。

1.3.2 各組細胞增殖情況觀察 采用MTT法。分別于轉(zhuǎn)染 24、48、72 h取各組細胞，接種于96孔板，調(diào)整細胞密度為100 μL細胞懸液中含1 × 104個細胞。每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，孵育4 h后離心棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，避光振蕩15 min，用酶標(biāo)儀檢測各組490 nm波長處的光密度OD值。以O(shè)D值代表各組細胞的增殖活力，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 各組細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術(shù)。轉(zhuǎn)染48 h時取各組細胞，冷PBS洗滌2次后將細胞重懸于100 μL的Binding Buffer，分別加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL的 PI，室溫避光染色10 min，用流式細胞儀測算1、2組的細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 各組細胞Wnt、β-catenin及p-gsk-3?蛋白檢測 采用WESTERN Blotting法。轉(zhuǎn)染48 h時取各組細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，12 000 r/min離心15 min，取上清液相同條件再次離心15 min，BCA法測定上清液中蛋白。制備電泳凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗：兔抗人Wnt多克隆抗體（1∶300）、兔抗人β-catenin多克隆抗體（1∶300）、兔抗人p-gsk-3?（1∶300）過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參，加入二抗（1∶3 000）孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，于暗室曝光、顯影液中顯影、定影液中定影，采用Quantity One軟件分析條帶亮度，Wnt、β-catenin、p-gsk-3?蛋白相對表達量以其蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用P-P圖檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML及缺鐵性貧血患者骨髓組織單個核細胞UCA1相對表達量比較 AML及缺鐵性貧血患者骨髓組織單個核細胞UCA1相對表達量分別為4.96 ±1.51、1.09 ± 0.93，二者比較，P＜0.05。

2.2 轉(zhuǎn)染24、48、72 h時各組細胞OD值比較 轉(zhuǎn)染24、48、72 h時各組細胞OD值見表1。與2、3組比較，轉(zhuǎn)染24、48、72 h時U937及HL-60 1組細胞增殖活力低（P均＜0.05）。

表1 轉(zhuǎn)染24、48、72 h時各組OD值（）

表1 轉(zhuǎn)染24、48、72 h時各組OD值（）

組別OD值U937 1組U937 2組U937 3組HL-60 1組HL-60 2組HL-60 3組轉(zhuǎn)染24 h 0.32 ± 0.05 0.36 ± 0.04 0.42 ± 0.02 0.37 ± 0.05 0.45 ± 0.01 0.34 ± 0.74轉(zhuǎn)染48 h 0.48 ± 0.41 0.52 ± 0.07 0.59 ± 0.14 0.47 ± 0.02 0.67 ± 0.21 0.54 ± 0.05轉(zhuǎn)染72 h 0.61 ± 0.88 0.73 ± 0.14 0.71 ± 0.54 0.51 ± 0.08 0.79 ± 0.18 0.68 ± 0.75

2.3 轉(zhuǎn)染48 h時各組細胞凋亡率比較 U937細胞1、2、3組細胞凋亡率分別為 34.20% ± 1.21%、7.21 % ± 1.41%、6.84% ± 1.53%，HL-60細胞1、2、3組細胞凋亡率分別為34.21% ± 1.83%、7.20% ±1.56%、7.85% ± 1.93%，與2、3組比較，U937及HL-60細胞1組細胞凋亡率高（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞Wnt、β-catenin及p-gsk-3?相對表達量比較 各組細胞Wnt、β-catenin及p-gsk-3?相對表達量見表2。與2、3組比較，U937及HL-60 1組Wnt、β-catenin相對表達量降低，p-gsk-3?蛋白相對表達量升高（P均＜0.05）。

表2 各組細胞Wnt、β-catenin、p-gsk-3?相對表達量（）

表2 各組細胞Wnt、β-catenin、p-gsk-3?相對表達量（）

組別U937 1組U937 2組U937 3組HL-60 1組HL-60 2組HL-60 3組Wnt 46.18 ± 0，21 89.78 ± 0.38 92.92 ± 0.43 51.14 ± 0.23 77.19 ± 0.37 86.47 ± 0.59 β-catenin 40.11 ± 0.21 60.23 ± 0.32 78.18 ± 0.59 33.76 ± 0.18 80.35 ± 0.35 96.52 ± 0.44 p-gsk-3? 102.63 ± 0.49 56.83 ± 0.24 60.23 ± 0，17 128.37 ± 0.40 45.96 ± 0.22 52.09 ± 0.35

3 討論

AML是一種具有高度異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征是髓系祖細胞增殖失控，導(dǎo)致未成熟前體細胞在骨髓中異常增殖積聚，而正常成熟血細胞生成不足。盡管 AML隨著新藥及造血干細胞移植技術(shù)的發(fā)展，治療療效有了顯著改善，但AML患者總體預(yù)后仍然很差，5年總生存率仍低于40%。因此，AML 發(fā)病的內(nèi)在潛在機制需要進一步研究及闡明，有助于提高及改善AML的治療效果。最新的國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可能在在AML的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

LncRNA是細胞內(nèi)一類轉(zhuǎn)錄本長于200 nt 的不具有開放閱讀框的RNA分子，可與多種生物學(xué)元件如DNA、RNA和蛋白質(zhì)相互作用。越來越多的研究認(rèn)為，LncRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中夠起至關(guān)重要的作用。LncRNA是一類長度超過200個核苷酸的RNA，調(diào)節(jié)基因表達并參與多種生物過程［13］。GAN等［14］發(fā)現(xiàn)，lncRNA 鋅指反義 1 （ZFAS1） 的沉默抑制了 AML 細胞的增殖并促進了細胞凋亡，并抑制了體內(nèi)AML 異種移植物的生長。有研究［15］表明，在AML患者中發(fā)現(xiàn)新型lncRNA-H22954，其在AML中低表達，且可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2活性抑制 AML細胞生長。lncRNA HOXA 簇反義 RNA2 （HOXA-AS2）先前已被證明在幾種人類惡性腫瘤中具有致癌特性［16］。 HOXA-AS2 可 通 過 調(diào) 控 HOXA3/EGFR/Ras/Raf/MEK信號通路降低急性淋巴細胞白血病患者的糖皮質(zhì)激素敏感性。研究［17］共納入241例AML患者的樣本，后發(fā)現(xiàn)高HOTAIRM1 水平與更短無白血病生存期、更短 OS 和更高累積復(fù)發(fā)率相關(guān)。

LncRNA UCA1位于染色體19p13.12正鏈上，具有三個外顯子、兩個內(nèi)含子及多個終止密碼子，沒有任何保守的長開放閱讀框 （ORF）。UCA1 的三種轉(zhuǎn)錄亞型為 lncRNA UCA1、lncRNA UCA1a及 lncRNA CUDR，大小分別為1.4、2.2和2.7 kb。LncRNA UCA1 是膀胱癌、乳腺癌和肝細胞癌等多種惡性腫瘤中最常見的UCA1亞型，已被明確為多種惡性腫瘤的致癌基因［18-20］。亞細胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA UCA1 主要位于細胞質(zhì)中，可與成熟的RNA 或蛋白質(zhì)相互作用。膀胱癌患者的血液和尿液樣本中也可以檢測到lncRNA UCA1，因此認(rèn)為LncRNA UCA1可能作為膀胱癌具有臨床價值的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物。尿液樣本中l(wèi)ncRNA UCA1的檢測是診斷膀胱癌的一種有效且無創(chuàng)的方式，與常規(guī)的細胞學(xué)方法相結(jié)合具有高度靈敏度 （100%） 和特異度（67%） ，并在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中具有致癌作用，因此在許多癌癥（包括肝癌、食管癌和胃癌）中作為潛在的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)［21］。UCA1 作為子宮內(nèi)膜癌患者不良預(yù)后的預(yù)測因子，干擾 UCA1 表達能抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移［22］。在前列腺癌中，UCA1 可以作為競爭性內(nèi)源RNA，通過競爭性結(jié)合 miR-221-3P 抑制 EIF4G1的表達［23］。UCA1可能通過靶向吸附 miR-107來影響胰腺癌的進展［24］。在白血病中，UCA1有助于包括AML在內(nèi)的白血病的化學(xué)耐藥性［12］。此外，UCA1通過抑制細胞增殖，遷移和侵襲，同時促進人類急性髓性白血病細胞株K562和HL60的細胞凋亡［12］。在當(dāng)前的研究中，我們觀察到UCA1是在人類AML細胞中高度表達（KG1、U937、THP-1和HL60）以及預(yù)期的UCA1抑制U937和HL60細胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制UCA1表達可抑制HL60細胞的增殖，促進細胞凋亡。說明UCA1在AML中發(fā)揮促癌功能，UCA1可能是AML治療靶點。本文通過沉默急性髓系白血病細胞中UCA1表達，發(fā)現(xiàn)沉默急性髓系白血病細胞中UCA1表達后可以抑制AML細胞增殖、促進細胞凋亡，提示UCA1可能在AML的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其在AML中的作用機制尚不明確。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， UCA1在AML患者骨髓組織單個核細胞中高表達，而在缺鐵性貧血患者骨髓組織單個核細胞中低表達，說明 UCA1可能促進AML的發(fā)展。LIU等［26］共納入1 240例結(jié)直腸癌、食管鱗狀細胞癌、前列腺癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤患者進行薈萃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCA1是癌癥患者OS 的獨立預(yù)后因素。

AML細胞的增殖和凋亡受多種信號通路的調(diào)控，Wnt/β-catenin 通路在AML的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是由最上游的配體WNT啟動激活，引發(fā)胞質(zhì)中β-catenin的聚集，β-catenin進入細胞核內(nèi)與TCF/LEF（T-cell factor/ lymphocyte -enhance-binding-factor）結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt/β-catenin被認(rèn)為是干細胞重要的生長因子，在其發(fā)育和自我更新中具有重要的調(diào)控作用［27］。然而，異常活化的Wnt／β-catenin信號通路可參與調(diào)控白血病的發(fā)生發(fā)展，促進細胞惡性增殖，抵抗細胞凋亡，并提示不良預(yù)后［28］。在Wnt/β-catenin信號通路中，p-GSK-3β可以磷酸化其關(guān)鍵信號分子β-catenin，使其易被降解。因此，β-catenin是該信號通路中的負性調(diào)控因子。本研究結(jié)果顯示，沉默LncRNA UCA1表達可降低U937及HL-60細胞中Wnt和β-catenin 蛋白相對表達量，提高p-gsk-3?蛋白相對表達量。表明沉默LncRNA UCA1可以抑制AML細胞Wnt/β-catenin信號通路激活。推測沉默LncRNA UCA1可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制AML細胞增殖、促進細胞凋亡。

綜上所述，UCA1可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路從而促進AML細胞的增殖、抑制AML細胞凋亡。UCA1有可能作為檢測AML的潛在生物標(biāo)志物。