相關腫瘤標記物在早期肝細胞癌診斷中的應用研究進展

鐘國強，林巖 ，黃贊松，2，韋華

1 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西百色 533000；2 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科 廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學研究中心；3 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科

肝細胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌最常見的病理類型，其發(fā)病率、病死率及死因分別占腫瘤疾病的第五、二及四位，且均有逐年上升趨勢。HCC起病隱匿且病情進展迅速，極易發(fā)生轉移多數患者確診時已處于病情中晚期，手術切除、肝移植、放化療、靶向治療等治療后的預后較差。早發(fā)現、早診治對改善HCC的預后具有重要意義。腫瘤標志物是腫瘤診斷的臨床常用檢測指標之一，是指與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移有關，可用于腫瘤的早期發(fā)現、探索腫瘤發(fā)生機制、監(jiān)測腫瘤治療效果及腫瘤復發(fā)的特異性物質。腫瘤標志物檢測具有創(chuàng)傷小、經濟便捷、可操作性強等優(yōu)點，目前已廣泛用于疾病的診斷中。目前臨床為明確早期HCC診斷，常采用血清腫瘤標記物檢測聯(lián)合超聲、計算機X線斷層掃描（CT）及磁共振成像（MRI）等影像學檢查。近年來研究［1］發(fā)現，微小RNA（microRNA ， miRNA）、長鏈非編碼RNA及環(huán)狀RNA（circular RNA， circRNA）等可能作為HCC的潛在腫瘤標記物，單獨或與常規(guī)腫瘤標記物聯(lián)合檢測以及綜合評分模型的應用或能進一步提高早期HCC的診斷效率。現將早期HCC診斷相關腫瘤標志物的應用相關研究進展綜述如下。

1 臨床常用的相關腫瘤標志物在早期HCC診斷中的應用

目前臨床常用的HCC腫瘤標志物主要有甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、 脫-γ-羧基凝血酶原（Des-γ-carboxy-prothrombin，DCP）、熱休克蛋白90α（heat shock protein 90 α，HSP90α）、高爾基體蛋白73（Golgi protein 73，GP73）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（glypican 3，GPC3）、骨橋蛋白（osteopontin ，OPN）及α-L巖藻糖苷酶（α-L-fucosidase，AFU）等。

1.1 AFP在早期HCC診斷中的應用 AFP是一種胚胎抗原，是目前最經典的肝癌標志物之一，可作為HCC診斷標志物中的“金標準”。AFP診斷HCC的靈敏度約為45%，特異度約為88%［2］。作為一種糖蛋白，AFP在HCC患者中的表達水平與腫瘤直徑相關，但其在某些良性肝病及其他胃腸惡性腫瘤中也可見表達升高。AFP異構體AFP-L3常見于原發(fā)性肝癌，其診斷肝癌的靈敏度較高，對于早期HCC的診斷效能優(yōu)于 AFP［3］。

但AFP在HCC診斷中的應用尚存在一定不足。AFP診斷HCC的特異度較高但靈敏度較低，臨床應用過程中誤檢率、漏檢率均較高，且AFP對＜2 cm的原發(fā)性肝癌的診斷效能極低。為改善這一現狀，現世界范圍內普遍采用AFP聯(lián)合腹部超聲或多標志物聯(lián)合檢測來提高HCC的診斷效能。腹部彩超檢查聯(lián)合AFP檢測能提高非病毒肝炎相關肝硬化患者早期肝癌診斷的靈敏度［4］。有學者［5］研究發(fā)現，血清AFP與GP73聯(lián)合檢測早期HCC的靈敏度及特異度最高。但臨床診療過程中，AFP仍是在超聲診斷經驗缺乏或其他影像學檢查設備匱乏的地區(qū)最常用的HCC篩查標志物。

1.2 DCP在早期HCC診斷中的應用 DCP是不具正常功能的凝血酶原，也稱APT（human abnormal prothrombin），當機體缺乏維生素K時，肝細胞不能合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ行使正常功能。由于HCC細胞對凝血酶原前體的合成發(fā)生異常，凝血酶原前體羧化不足而致使DCP大量生成［6］。

XING等［7］研究發(fā)現，DCP診斷HCC的特異度為89%、靈敏度為66%。一項多中心研究［8］發(fā)現，在包含521例HCC、肝轉移、肝硬化、肝血管瘤及健康對照受試者的研究中，DCP診斷HCC正確率相較于AFP高6.2%～9.7%，在447例HCC、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康對照受試者隊列中，DCP診斷HCC準確率比AFP高12.30%～20.67%。由于AFP、DCP的來源及形成機制均不相同且不存在明顯相關性，故AFP、DCP檢測聯(lián)合影像學檢查可能進一步提高早期HCC肝癌的診斷效能。

1.3 HSP90α在早期HCC診斷中的應用 在原核和真核細胞中都有熱休克蛋白（HSP）表達，與細胞生長、凋亡及腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，在機體應激狀態(tài)或癌癥條件下發(fā)揮分子伴侶等作用。HSP90α也被稱作應激性蛋白，是最活躍的HSP蛋白，是機體在應激狀態(tài)下分泌的一種保護性蛋白質。乙肝相關性肝癌患者血清HSP90α表達水平明顯高于正常人，且存在性別差異，女性表達高于男性［9］。HSP90α高表達于HCC細胞中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移相關，并能被轉運到細胞表面而易于被檢測，目前已普遍用于HCC的診斷中。研究［10］發(fā)現，血清HSP90α診斷HCC的曲線下面積（AUC）為0.836，與AFP聯(lián)合診斷HCC的AUC為0.943。

1.4 GP73在早期HCC診斷中的應用 GP73是一種跨膜糖蛋白。GP73作為臨床應用較多的早期肝癌標志物，不受年齡、性別、病灶數以及血清AFP水平的影響，但與病灶直徑、血管浸潤以及腫瘤分化程度相關。GP73表達上調能促進HCC細胞的侵襲和轉移，并提示患者預后不良。GP73在血清AFP陰性的HCC患者的篩查具有一定優(yōu)勢。LI等［11］在納入4 000例HCC患者后研究發(fā)現，血清GP73診斷早期HCC的靈敏度與特異度分別為74.6%、97.4%，均高于AFP。MARRERO等［12］認為，血清GP73診斷早期HCC的效能優(yōu)于血清AFP。

1.5 GPC3在早期HCC診斷中的應用 GPC3是膜性硫酸乙酰肝素類糖蛋白超家族成員之一，由糖、蛋白質及脂質組成。HCC患者血清GPC3水平升高。GPC3被激活后可通過調控多條信號通路，促進HCC細胞的增殖和侵襲［13］。研究［14］表明，GPC3不僅是肝癌的診斷和預后預測指標，還可能成為HCC的治療靶點。

1.6 OPN在早期HCC診斷中的應用 OPN是一種分泌型磷酸化糖蛋白，參與組織修復及自身代謝。OPN主要由免疫系統(tǒng)和上皮細胞產生，也可被腫瘤細胞、平滑肌細胞及成骨細胞等釋放，是機體一種至關重要的黏附分子。OPN可介導腫瘤進一步惡化及轉移，還能通過抑制HCC細胞NO產生，促進轉移灶細胞的存活。與血清AFP（0.639）比較，血清OPN（0.813）診斷早期HCC的靈敏度較高，且二者聯(lián)合檢測對早期HCC的診斷效能更高［15］，可進一步提高檢查的準確率。ZHU等［16］研究發(fā)現，血清OPN診斷肝癌的AUC（0.851）及靈敏度（79.21%）均優(yōu)于血清AFP（0.683，54.46%），特異度（79.64%）與 AFP（81.00%）接近。

1.7 AFU在早期HCC診斷中的應用 AFU常見于哺乳動物，本質是一種水解酶，參與含巖藻糖基的大分子水解。HCC細胞可合成大量AFU并將其釋放入血，因此AFU是一種較為有效的肝癌標志物。血清AFU對早期HCC診斷靈敏度和特異度分別為72%和78%，AUC為0.812 5［17］。血清AFU與AFP、GP73等聯(lián)合檢測可提高早期HCC確診率［18］。

2 新型腫瘤標志物在早期HCC診斷中的應用

《原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）》中指出：新型腫瘤標志物在早期HCC診斷及治療后療效評價等方面有重要價值。近年研究發(fā)現，外泌體可作為多種疾病的診斷及預后標志物。外泌體來源的miRNA、lncRNA、 circRNA、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）及甲基化生物標志物等可作為HCC診斷的生物標志物。

2.1 miRNA在早期HCC診斷中的應用 MiRNA是一類內源性非編碼RNA，多數來源于外泌體。miRNA可作為促癌基因或抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。最新研究認為，miRNA可作為腫瘤標志物用于早期肝癌篩查、預測預后。研究［19］發(fā)現，miRNA對血清AFP陰性HCC的診斷效能更高。PENG 等［20］發(fā)現，miR-130b、miR-150 等 miRNA 診斷HCC的靈敏度及特異度均大于80%。ZHOU等［21］研究發(fā)現，特定的 miRNA（miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、 miR-26a、 miR-27a及miR-801）試劑盒診斷早期HCC的AUC為0.888，靈敏度為81.8%，特異度為83.5%。miR-122已被確定為HCC標志物，且外泌體來源miR-122較傳統(tǒng)診斷標志物的診斷潛能更高［22］。因為miRNA來源于外泌體，不易獲得且可重復性較差，目前尚未在臨床診療中普及。

2.2 lncRNA在早期HCC診斷中的應用 lncRNA是一類長度超過200個核苷酸且不具備蛋白編碼功能的RNA，參與調控表觀遺傳、轉錄，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［23］。HCC細胞lncRNA表達的失衡可能對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起抑制或促進作用，故理論上lncRNA可作為HCC的診斷或預后標志物。研究［24］發(fā)現，HCC 及正常細胞中 C005332.5、ELF3-AS1和LINC00665表達存在差異，且與HCC患者的生存預后相關，三種lncRNA聯(lián)合診斷HCC的AUC為 0.913，說明C005332.5、ELF3-AS1和 LINC00665可能作為HCC的診斷標記物。

HCC的復發(fā)、轉移及耐藥可能與肝癌干細胞的自我更新有關，而lncRNA參與調節(jié)肝癌干細胞的自我更新能力。LncRNA-H19在人HCC細胞、HCC干細胞及小鼠模型中高表達且隨著疾病進展及巴塞羅那分期（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）的增加而進一步上調，提示lncRNA-H19可作為HCC診斷及預后的新的標志物［25］。但血清lncRNA水平較低導致其臨床應用尚存在一定不足。

2.3 circRNA在早期HCC診斷中的應用 CircRNA具有獨特的閉環(huán)結構，廣泛存在于真核細胞中，具有多種生物學功能。CircRNA不含有5'及3'端且比線性RNA更穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解。CircRNA有一定保守性，具有組織、時序甚至細胞特異性，使它們具備作為生物標志物的潛能。HCC患者中外泌體來源的circ_0006602表達上調，其表達與乙型病毒肝炎及肝硬化的發(fā)生發(fā)展有關［26］。競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制是環(huán)狀RNA發(fā)揮生物學功能的重要機制之一。環(huán)狀RNA可靶向競爭吸附下調對應的miRNA表達，解除miRNA對下游靶基因的抑制，同時通過多條信號通路參與HCC的發(fā)生發(fā)展［27］。

2.4 CTCs在早期HCC診斷中的應用 CTCs是指進入外周血的腫瘤細胞。大部分CTCs在進入外周血后會發(fā)生凋亡或被機體清除，少數能逃避免疫監(jiān)視而形成轉移灶。TAKAHASHI等［28］研究發(fā)現，轉移性HCC患者血液CTCs濃度明顯高于局限性HCC患者，提示CTCs可用于預測HCC預后，并可能成為HCC進展的新的標志物。QI等［29］研究發(fā)現，112例HCC患者血液中CTCs陽性率為90.18%，提示CTCs可能用于早期HCC的篩查。有學者［30］開發(fā)了一種集成3D打印芯片外多源試劑平臺、氣泡保持器和單個CTC捕獲芯片的新的CTCs檢測系統(tǒng)，可縮短CTCs的檢驗時間。但目前臨床CTCs的檢測和分離較為困難，檢驗成本較為昂貴，導致CTCs在HCC診斷中的應用存在一定困難。與CTCs類似的循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）等也有可能成為早期HCC診斷標志物。

2.5 甲基化生物標志物在早期HCC診斷中的應用 甲基化是指經甲基轉移酶的催化，活性甲基化合物上的甲基被催化轉移到其他化合物的過程，包括DNA或蛋白質的甲基化。三個或三個以上miRNA基因的一致性高甲基化可能是檢測HCC和預后不良的高度特異度標志物［31］。XU等［32］認為，RAS相關結構域家族蛋白1A （RASSF1A）啟動子超甲基化可能作為HCC診斷標志物，同時也可作為HCC治療的新靶點。

3 基于相關腫瘤標記物的綜合評分在早期HCC診斷中的應用

近年研究認為，基于數種血清腫瘤標志物推算得到的數據模型及算式得到的綜合評分可能有效提高疾病診斷的特異度及靈敏度，具有一定的臨床推廣價值。GALAD評分和APAC評分可用于HCC的早期診斷。

3.1 GALAD評分在早期HCC診斷中的應用 GALAD評分由JOHNSON等［33］提出，主要包含的指標為年齡（age）、性別（gender）、AFP、AFP-L3及DCP等。具體算法為GALAD評分= （0.09×age + 1.67×gender）+ （2.34×log10（AFP） + （0.04×AFP-L3） + （1.33×log10DCP ）-10.08，其中男性、女性賦值分別為0、1。JOHNSON等［33］在納入331例HCC、339例慢性肝病患者后發(fā)現，在選取切點值為-1.58時，GALAD評分診斷肝癌的特異度為80%，靈敏度為97%，后續(xù)內部驗證的靈敏度為98%，特異度為74%。進一步研究［34］發(fā)現，GALAD評分對乙肝或丙肝患者早期HCC診斷的靈敏度較高。《美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）腫瘤學臨床實踐指南（肝膽癌，2021年版）》中也指出，AFP、AFP-L3、DCP聯(lián)合年齡性別構成的GALAD新型血清標志物模型對慢性肝病或非酒精性脂肪肝中HCC的識別具有較高的準確性［35］。

3.2 APAC評分在早期HCC診斷中的應用 APAC評分是一種基于AFP及肌酐等指標的評分工具，評分系統(tǒng)主要包含的指標有：年齡（Age），可溶性血小板衍生生長因子受體β（sPDGFRβ），AFP及肌酐（Creatinine）。其具體算法為：APAC=（Age×0.204 80）-［log10（sPDGFRβ）×1.986 84］+ ［log10（AFP）×2.456 57］-（Creatinine ×2.468 91）-4.364 93。LAMBRECHT 等［36］研究發(fā)現，在切點值為 0.796 9時，APAC評分診斷HCC的靈敏度81.7%、特異度95.4%，APAC評分診斷HCC的靈敏度、特異度均高于AFP。

綜上所述，AFP、AFP-L3、OPN、AFU等經典腫瘤標志物仍是目前臨床常用的HCC腫瘤標志物，但其均不能滿足臨床早期HCC的診斷需求。外泌體來源的miRNA、lncRNA、 circRNA、CTCs及甲基化生物標志物等新型標志物對早期HCC的診斷效能較高。同時對于臨床高度疑診為HCC的患者，在未出現影像學改變或HCC常規(guī)腫瘤標志物升高不顯著時，新型血清腫瘤標志物聯(lián)合檢測的檢出率更高。GALAD評分和APAC評分等綜合評分方法可進一步明確早期HCC的診斷，改善HCC患者的預后。