鐵死亡抑制劑預培養的大鼠心肌細胞抵抗素誘導后細胞肥大程度及鐵死亡相關蛋白表達觀察

朱賁賁 ，海日汗 ，王巍嵩 ，楊鵬杰

1 內蒙古自治區腫瘤醫院藥劑科，呼和浩特 010020；2 內蒙古醫科大學附屬人民醫院藥劑科；3 內蒙古醫科大學麻醉系；4 內蒙古醫科大學附屬醫院藥學部；5 內蒙古自治區腫瘤醫院胸外科；6 內蒙古醫科大學附屬人民醫院胸外科

心肌肥厚（Cardiac Hypertrophy）的終末階段為心力衰竭（Heart Failure）。全世界范圍內心力衰竭的發病率和病死率均較高［1-2］。抵抗素是由脂肪細胞產生和分泌的一種分泌蛋白［3-4］。動物實驗［5］發現，抵抗素可誘導胚胎大鼠心肌細胞肥大。臨床研究［6］發現，心力衰竭患者血清抵抗素水平升高。推測抵抗素在心肌細胞肥大過程中可能發揮重要作用。鐵死亡（Ferroptosis）是一種新型的細胞程序性死亡方式，是細胞內鐵依賴脂質活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）積聚過多而導致的一種可調節性的細胞死亡形式［7］。研究［8］發現，鐵代謝異?？赡芘c心力衰竭的發生有關。鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）是一種ROS清除劑［9］，可顯著提高阿霉素（Doxorubicin，DOX）誘導心力衰竭小鼠的存活率［10］。抵抗素是否通過鐵死亡途徑導致心肌細胞肥大，目前相關研究較少。我們觀察了Fer-1預培養的大鼠心肌細胞系H9c2抵抗素誘導后細胞肥大程度及鐵死亡相關蛋白的表達情況，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑 H9c2細胞購于協和細胞庫，使用完全DMEM培養基進行培養，待貼壁細胞達培養瓶底面積80%～90%時備用。重組人抵抗素購自美國Peprotech，Fer-1購于美國 Sima-aldrich，完全 DMEM培養基購于美國Gibco，谷胱甘肽過氧化物酶 4（Glutathione Peroxidase 4，GPX4）、?；o酶 A 合成酶長鏈家族成員 4（Acyl-CoA synthetase long-chain family member ，ACSL4） 及環氧合酶 2（COX2）抗體購于美國Abcam。

1.2 H9c2細胞分組及Fer-1、抵抗素干預方法 取H9c2細胞，1×105/孔分別接種于6孔板內，加入完全DMEM培養基3 mL，細胞貼壁后換含0.1% FBS的DMEM培養基 3 mL饑餓培養16 h（以便后續藥物吸收）。將 H9c2細胞分為 1、2、3、4組。1組用含1 μmmol/L的Fer-1培養基培養16 h，后換為含50 ng/mL抵抗素的培養基培養32 h。2組用含1 μmmol/L的Fer-1培養基培養16 h，后換為含0.1% FBS的培養基培養32 h。3組用含50 ng/mL抵抗素的培養基培養48 h。4組（正常對照組）用含0.1% FBS的培養基培養48 h。

1.3 各組細胞肥大程度觀察

1.3.1 各組細胞表面積測算 于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態，隨機選取3個不同的視野進行拍照，每視野隨機選取5個細胞，采用Image J軟件測算各細胞的表面積，以所有細胞的表面積之和為各組細胞表面積，重復測算3次，取平均值。

1.3.2 各組單細胞蛋白含量測算 取各組細胞，BCA法測算各組單細胞蛋白含量。 配制蛋白標準液，分別吸取10 μL標準品及樣品依次加入96孔板內，加入 200 μL BCA 工作液/孔，37 ℃恒溫孵育30 min，酶標儀波長調至562 nm進行檢測。根據已知標準蛋白濃度與吸光值繪制標準曲線，通過函數根據已知吸光值測定待測蛋白濃度C。單細胞蛋白含量=細胞總蛋白濃度C×裂解液體積V/細胞總數n。重復測算3次，取平均值。

1.3.3 各組心肌細胞肥大相關胚胎基因ANP、BNP和β-MHC基因檢測 采用RT-qPCR法檢測心肌細胞ANP、BNP和β-MHC基因，取各組細胞，提取RNA后根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR檢測各組細胞中ANP、BNP和β-MHC的表達量。反應體系：RNase Free dH2O 9.5 μL，cDNA/DNA 1 μL，上游引物 1 μL，下 游 引 物 1 μL，2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL。引 物 序 列 為 ANP-F：5'-CTTCGGGGGTAGGATTG ACA-3'，ANP-R：5'-AATGCGACCAAGCTGTGTGAC-3'；BNP-F：5'-CCAAGATGGCACATAGTTCAAGC-3'，BNP-R：5'-AGAGCCGCAGGCAGAGTCA-3'；β -MHF：5'-GAAAGCAACTGGAGGCTGAGA-3’，β-MH-R：5'-CATCTCCTCGTCCTTCTCTGC-3'；ACTIN-F：5'-A GAGGGAAATCGTGCGTGA-3’，ACTIN-R：5'-CAT TGCCGATAGTGATGACCT-3'。反應條件：預變性95 ℃ 10 min；變性 95 ℃ 10 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40 個循環。以 β-actin 為內參，以 2-ΔΔCt代表目的基因的相對表達量，每組重復檢測3次，取平均值。

1.4 各組細胞鐵死亡相關蛋白谷胱甘肽過氧化物酶 4（ Glutathione Peroxidase 4，GPX4）、?；o酶 A合成酶長鏈家族成員 4（Acyl-CoA synthetase longchain family member ，ACSL4） 、環氧合酶 2（COX2）檢測 采用Western Blotting法檢測各組細胞GPX4、ACSL4、COX2。取各組細胞，加入預冷過RIPA裂解液充分裂解，4 ℃下離心15 min，取上清，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度 ，加入1/4體積的蛋白上樣緩沖液，100 ℃、5 min加熱變性，采用SDS-PAGE法電泳分離。分別加入1：1 000比例稀釋的GPX4、ACSL4、COX2一抗，4 ℃環境過夜孵育。將二抗以1∶10 000比例進行稀釋，PVDF膜避光常溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。采用熒光成像系統測得對應灰度值，以β-actin為內參，用Image J軟件測算目的蛋白的灰度值，以目的蛋白灰度值/內參灰度值為目的蛋白的相對表達量，重復測算3次，取平均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行數據處理。P-P圖檢驗數據的正態性，符合正態分布的計量資料以-表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞表面積比較 1、2、3、4組心肌細 胞 表面積分別為（2 181.02 ± 210.89）、（1 964.96 ± 187.51）、（3 602.93 ± 347.47）、（1 522.54 ± 431.93）pixel，與4組比較，3組細胞表面大（P＜0.05）；與3組比較，1組細胞表面積?。≒＜0.05）。

2.2 各組心肌細胞單細胞蛋白含量比較 1、2、3、4組心肌細胞單細胞蛋白含量分別為（680.00 ±41.15）、（540.67 ± 87.19）、（1 115.67 ± 77.84）、（457.67 ± 67.30）pg/L，與4組比較，3組心肌細胞單細胞蛋白含量高（P＜0.05）；與3組比較，1組心肌細胞單細胞蛋白含量低（P＜0.05）。

2.3 各組心肌細胞ANP、BNP、β-MHC基因的相對表達量比較 各組心肌細胞ANP、BNP、β-MHC基因相對表達量比較見表1。

表1 各組心肌細胞ANP、BNP、β-MHC基因相對表達量比較（-）

表1 各組心肌細胞ANP、BNP、β-MHC基因相對表達量比較（-）

注：與4組比較，# P ＜0.05；與3組比較，*P ＜0.05。

組別1組2組3組BNP基因3.14 ± 0.56*1.84 ± 0.83 4.25 ± 0.86#ANP基因2.32 ± 0.54*1.55 ± 0.46 4.91 ± 0.58#β-MHC基因1.76 ± 0.29*1.39 ± 0.19 2.43 ± 0.49#

2.4 各組心肌細胞GPX4、ACSL4、COX2相對表達量比較 各組心肌細胞GPX4、ACSL4、COX2相對表達量比較見表2。

表2 各組心肌細胞GPX4、ACSL4、COX2相對表達量比較（-x ± s）

3 討論

心肌肥厚是由多種因素引起的心肌組織超負荷的適應性反應，可分為生理性和病理性。持續的病理性心肌肥厚最終可導致擴張性心肌病、心力衰竭和猝死［11］。目前，心肌肥厚的分子及細胞信號轉導機制仍不明確。抵抗素是一種由小鼠脂肪細胞產生的分子。研究［12］發現，心力衰竭患者的血清抵抗素水平升高。最新研究［13］發現，暴露于高水平血清抵抗素的一般人群比較低水平血清抵抗素的人群有更高的心血管死亡風險。本研究中，抵抗素組與空白組對比，抵抗素組心肌細胞表面積顯著增加。抵抗素組單細胞蛋白質含量也顯著增加，心肌細胞肥大標志物ANP、BNP和β-MHC基因相對表達量升高，說明抵抗素成功誘導心肌細胞的肥大。

Ferroptosis是以鐵依賴性脂質過氧化為特征的調節性細胞死亡 （RCD） 形式。迄今為止，鐵死亡與退行性疾?。ê嗤㈩D氏病、阿爾茨海默氏病和帕金森病）、缺血再灌注損傷和心血管疾病等有關。例如ACSL4和p53誘導的GPX4和凋亡誘導因子線粒體相關2（AIFM2）抑制鐵死亡。TADOKORO等［14］發現，阿霉素通過線粒體途徑下調 GPX4 誘導鐵死亡，同時GPX4過表達通過調節鐵死亡改善心臟功能。FAN等［15］研究，發現，ACSL4過表達損害了黃芩苷在H9c2細胞中產生的保護作用。此外，ZHU等［16］等研究發現，鐵死亡可作為導致自身免疫性肝炎的引發劑或中間介質。本研究結果，發現在抵抗素誘導的心肌細胞肥大中，抵抗素組與正常對照組相比，GPX4蛋白表達下調，ACSL4、COX2蛋白表達上調，提示抵抗素誘導H9c2心肌細胞肥大途徑中鐵死亡被激活。1組與3組相比，GPX4蛋白表達上調，ACSL4、COX2蛋白表達下調，提示Fer-1可以緩解抵抗素誘導的心肌細胞肥大過程中鐵死亡的發生，可能與Fer-1引發脂質氫過氧化物的消失作用有關［17］。在我們的研究中，1組H9c2細胞的表面積明顯減小、單細胞蛋白含量明顯減少、心肌細胞胚胎基因（ANF、BNF及β-MHC）表達明顯下調。說明Fer-1的干預對抵抗素誘導的心肌細胞肥大有保護作用，同時抵抗素誘導心肌細胞肥大的過程中，有鐵死亡的途徑被激活，鐵死亡可能成為治療心肌肥大患者的新靶點。

綜上所述，抵抗素可誘導H9c2心肌細胞肥大。與加入抵抗素培養者相比，先后加入Fer-1與抵抗素培養的大鼠心肌細胞系H9c2肥大程度輕、GPX4蛋白表達增加、ACSL4及COX2蛋白表達降低。Fer-1可能通過促進鐵死亡相關蛋白GPX4表達、抑制ACSL4及COX2蛋白表達，抑制抵抗素誘導的H9c2肥大。Fer-1預處理可能對抵抗素誘導的心肌細胞肥大有一定保護作用。但鐵死亡參與抵抗素誘導的心肌細胞肥大的具體作用機制今后仍需進一步研究。