白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素腹腔預(yù)注射小鼠膿毒癥誘發(fā)過程中的肺損傷情況觀察

張杰，劉自新，賈炳學(xué)，張愛新，張卓

北京市平谷區(qū)醫(yī)院急診科，北京 101200

膿毒癥是一種由病原體嚴重感染引起的過度免疫反應(yīng)性疾病，主要表現(xiàn)為不受控制的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭。臨床診療過程中25%～50%的膿毒癥患者可發(fā)生急性肺損傷（acute lung injury，ALI），治療后病死率高達 40%［1］。目前膿毒癥ALI尚無特異性治療方法，臨床治療策略主要包括高流量鼻導(dǎo)管和無創(chuàng)通氣、神經(jīng)肌肉阻滯、體外膜肺氧合及支持治療等。最近研究［2］表明，早期應(yīng)用抗炎藥物是一種有效的膿毒癥ALI治療策略。白藜蘆醇是一種多酚類化合物，主要存在于葡萄、桑椹、花生及大黃等植物中，在預(yù)防和治療一些慢性疾病（如糖尿病、肥胖癥、心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病）中發(fā)揮重要作用［3］。姜黃素是從姜黃中提取的黃色著色劑，是一種多效性分子，可與炎癥分子靶標(biāo)相互作用，在炎癥性腸病、關(guān)節(jié)炎、胰腺炎以及慢性前葡萄膜炎等炎癥性疾病中發(fā)揮治療作用［4］。最新研究［5］發(fā)現(xiàn)，藜蘆醇和姜黃素聯(lián)用可提高仔豬小腸的消化酶活性及胰腺抗氧化能力，緩解應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥性損傷。細胞實驗［6］證實，白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素可有效降低癌細胞存活率，抗腫瘤效應(yīng)較好。因此，白藜蘆醇和姜黃素具有良好的聯(lián)合用藥基礎(chǔ)。據(jù)文獻［7-8］報道，白藜蘆醇和姜黃素腹腔注射均能改善膿毒癥小鼠的肺損傷程度，但治療效果并不理想。白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素對膿毒癥小鼠ALI的療效是否優(yōu)于單獨用藥目前尚不清楚。2020年3月—2022年10月，我們觀察了白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素腹腔預(yù)注射小鼠膿毒癥誘發(fā)過程中的肺損傷情況，并探討其作用機制。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 90只8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠（體質(zhì)量25～30 g）購自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。小鼠實行分籠飼養(yǎng)，每籠2～3只，環(huán)境為SPF級，溫度21 ℃～23 ℃，濕度30%～70%，給予12 h光照/黑暗周期，并提供充足的飼料與飲用水。所有涉及動物的實驗均經(jīng)北京市平谷區(qū)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（No. 20200014），并且符合國際實驗動物實驗和使用指南（1996年修訂版）。白藜蘆醇與姜黃素購自南京合谷生命生物科技有限公司，小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6以及IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國BD公司，小鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-related X protein，Bax）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）以及激活型多聚ADP核糖聚合酶1（cleaved poly ADP-ribose polymerase 1，cleaved PARP）抗體購自美國CST公司，二抗購自北京百奧萊博科技公司，熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司，核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）螢火蟲報告載體與海腎報告載體購自南通百奧生物技術(shù)有限公司，蘇木精-伊紅（HE）與多聚甲醛購自北京天根生化科技有限公司，杜爾貝科改良鷹培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）以及 lipofectamine 2000試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 小鼠分組及白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素預(yù)處理方法 90只小鼠隨機分為 1、2、3、4、5組，每組 18只。1、2、3組分別腹腔注射100 mg/kg姜黃素、40 mg/kg白藜蘆醇、100 mg/kg姜黃素 + 40 mg/kg白藜蘆醇，然后用盲腸結(jié)扎穿刺法（cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥模型；4組腹腔注射等量無菌0.9%生理鹽水后用CLP建立膿毒癥模型；5組僅腹腔注射等量的無菌0.9%生理鹽水。參照文獻［9］采用CLP建立膿毒癥小鼠模型：首先腹腔注射戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉小鼠，仰臥位固定。腹部做0.4 cm縱向中線切口暴露盲腸。使用3-0醫(yī)用絲線在距尖端1 cm處結(jié)扎盲腸，并在距離結(jié)扎處0.5 處用20號針頭穿孔1次。按壓盲腸擠出少量糞便后將腸管重新放置于腹腔內(nèi)。依次關(guān)閉腹部肌肉組織、腹膜和皮膚。術(shù)后立即給予小鼠皮下注射生理鹽水進行液體復(fù)蘇，自由飲水和進食。

1.3 各組小鼠存活情況觀察 術(shù)后常規(guī)監(jiān)測小鼠各項生命活動，記錄第1～5天小鼠存活情況。

1.4 各組小鼠肺組織損傷情況觀察 第5天處死各組小鼠，常規(guī)收集雙側(cè)肺組織，左側(cè)肺組織立即稱重，80 ℃烘箱干燥24 h后稱重，計算肺組織濕/干重（wet weight/dry weight，W/D）。右側(cè)肺組織取部分4 ℃固定于4%多聚甲醛，HE染色后于100倍放大鏡下隨機選擇6個視野，參照文獻［10］進行肺組織損傷評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：①肺泡腔中的中性粒細胞聚集（A）情況，0視野可見計0分、1～5個視野計1分、＞5個視野計2分；②間質(zhì)中的中性粒細胞聚集（B）情況，0視野可見計0分、1～5個視野計1分、＞5個視野計2分；③透明膜形成（C）情況，0視野可見計0分、1個視野計1分、＞1個視野計2分；④肺泡腔中存在蛋白質(zhì)碎片（D）情況，0視野可見計0分、1個視野計1分、＞1個視野計2分；⑤肺泡間隔增厚（E）情況，＜2個視野計0分、2～4個視野計1分、＞4個視野計2分。肺組織損傷評分=｛（20×A） + （14×B） + （7×C）+ （7×D） + （2×E）｝/（視野數(shù)×100）。重復(fù)計算3次，取平均值。

1.5 各組小鼠肺組織中炎癥因子的表達檢測 采用ELISA法檢測促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）與抗炎因子（IL-10）的表達情況。取各組小鼠肺組織，充分研磨、裂解，4 ℃下13 000 g離心，取上清液。將上清液加入反應(yīng)孔中，隨后依次加入加酶標(biāo)抗體和底物，所有操作均嚴格按照試劑說明書進行，用多功能酶標(biāo)儀分析各組450 nm波長下的吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測算肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10相對表達量。重復(fù)計算3次，取平均值。

1.5 各組小鼠肺組織中細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達檢測 采用WESTERN Blotting法檢測促凋亡蛋白（Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表達情況。取各組小鼠肺組織，提取肺組織總蛋白并測定濃度。制備12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，依次經(jīng)過上樣、電泳以及轉(zhuǎn)膜處理后，37 ℃封閉2 h。然后將膜在4 ℃下與Bax（1：1 000稀釋）、Bcl-2（1：1 000稀釋）、cleaved caspase-3（1：750稀釋）以及cleaved PARP（1：2 000稀釋）抗體孵育過夜，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體作為內(nèi)參對照。增強化學(xué)發(fā)光液進行顯色處理，并使用Image-Pro Plus 6.0版軟件測算Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相對表達量，目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值為目的蛋白相對表達量。重復(fù)計算3次，取平均值。

1.6 各組小鼠肺組織中NF-κB通路活性檢測 采用熒光素酶報告基因測算NF-κB通路的激活情況。取各組小鼠肺組織，分離小鼠原代肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs），DMEM培養(yǎng)基 + 10% FBS于37 ℃ 5% CO2下培養(yǎng)。后采用Lipofectamine 2000試劑共轉(zhuǎn)染NF-κB螢火蟲報告載體與海腎報告載體至PMVECs細胞。24 h后收集細胞并裂解獲取上清，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組中螢火蟲熒光素酶值與海腎熒光素酶值，計算NF-κB通路相對活性，NF-κB通路活性=螢火蟲熒光素酶值/海腎熒光素酶值×100%。重復(fù)計算3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS28.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。P-P圖檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性，正態(tài)分布的計量資料以表示，統(tǒng)計學(xué)比較采用單因素方差分析與Mann-Whitney檢驗；計數(shù)資料用%表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 第5天時各組小鼠存活情況比較 第5天時1、2、3、4、5組小鼠分別存活4、5、13、1、18只。與5組比較，第5天4組小鼠存活率低（P均＜0.05）；與1、2、4組比較，第5天3組小鼠存活率高（P均＜0.05）。

2.2 各組小鼠肺組織W/D、肺組織損傷評分比較 各組小鼠肺組織W/D、損傷評分見表1。與5組比較，4組小鼠肺組織W/D與損傷評分高（P均＜0.05）。與4組比較，1、2組小鼠肺組織W/D與損傷評分低（P均＜0.05）。與2組比較，1組小鼠肺組織W/D低（P＜0.05）。與1、2、4組比較，3組小鼠肺組織W/D和損傷評分低（P均＜0.05）。

表1 各組小鼠肺組織W/D及肺組織損傷評分（）

表1 各組小鼠肺組織W/D及肺組織損傷評分（）

組別1組2組3組4組5組W/D 6.07 ± 0.30 6.44 ± 0.35 4.79 ± 0.41 8.21 ± 0.49 3.62 ± 0.28損傷評分（分）0.11 ± 0.03 0.10 ± 0.05 0.06 ± 0.02 0.18 ± 0.06-

2.3 各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10濃度比較 各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β及IL-6、IL-10濃度見表2。與5組比較，4組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10濃度高（P均＜0.05）。與4組比較，1、2組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度低，IL-10濃度高（P均＜0.05）。與2組比較，1組小鼠肺組織中IL-10濃度高（P＜0.05）。與1、2、4組比較，3組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度低，IL-10濃度高（P均＜0.05）。

表2 各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10濃度（pg/mL，）

表2 各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10濃度（pg/mL，）

組別1組2組3組4組5組TNF-α 248.77 ± 20.90 249.14 ± 24.51 112.49 ± 13.08 324.95 ± 27.24 42.56 ± 7.65 IL-1β 34.13 ± 3.77 37.22 ± 4.02 26.92 ± 1.50 51.95 ± 5.43 15.38 ± 1.98 IL-6 157.70 ± 8.81 152.14 ± 9.67 94.98 ± 6.46 209.08 ± 17.85 67.31 ± 8.22 IL-10 47.12 ± 6.15 42.60 ± 3.75 59.22 ± 4.60 34.53 ± 2.91 26.41 ± 3.06

2.4 各組小鼠肺組織中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白相對表達量比較 各組小鼠肺組織中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白相對表達量見表3。與5組比較，4組小鼠肺組織中Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相對表達量高，Bcl-2蛋白相對表達量低（P均＜0.05）。與4組比較，1、2組小鼠肺組織中Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相對表達量低，Bcl-2蛋白相對表達量高（P均＜0.05）。與2組比較，1組小鼠肺組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白相對表達量低，Bcl-2蛋白相對表達量高（P＜0.05）。與1、2、4組比較，3組小鼠小鼠肺組織中Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相對表達量低，Bcl-2蛋白相對表達量高（P均＜0.05）。

表3 各組小鼠肺組織中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相對表達量（）

表3 各組小鼠肺組織中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白相對表達量（）

組別1組2組3組4組5組Bcl-2 0.11 ± 0.05 0.06 ± 0.03 0.19 ± 0.07 0.02 ± 0.03 1.00 ± 0.11 Bax 7.74 ± 0.39 9.28 ± 0.45 2.50 ± 0.13 14.12 ± 0.58 1.00 ± 0.06 cleaved caspase-3 2.26 ± 0.15 5.77 ± 0.40 1.18 ± 0.14 7.53 ± 0.67 1.00 ± 0.08 cleaved PARP 2.86 ± 0.21 2.80 ± 0.17 0.07 ± 0.02 6.19 ± 0.33 1.00 ± 0.06

2.5 各組小鼠肺組織中NF-κB通路活性比較 1、2、3、4、5組小鼠肺組織中NF-κB通路相對活性分別為250.09% ± 16.35%、 272.42% ± 16.88%、164.31% ±15.105%、406.95% ± 24.18%、127.68% ± 13.59%。與5組比較，4組小鼠肺組織中NF-κB通路相對活性高（P＜0.05）；與4組比較，1、2組小鼠肺組織中NF-κB通路相對活性低（P均＜0.05）；與2組比較，1組小鼠肺組織中NF-κB通路相對活性低（P＜0.05）；與1、2、4組比較，3組小鼠肺組織中NF-κB通路相對活性低（P均＜0.05）。

3 討論

膿毒癥是臨床常見危重癥疾病之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，病死率居高不下。膿毒癥的發(fā)病機制十分復(fù)雜，涉及全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血障礙、組織損傷以及宿主對不同病原微生物及其毒素的異常反應(yīng)等［11］。ALI是膿毒癥相關(guān)并發(fā)癥中最常見也是預(yù)后較差的一種并發(fā)癥。與其他因素引發(fā)的ALI相比，膿毒癥ALI 患者多器官功能障礙、疾病嚴重程度和院內(nèi)病死率更高。近年來研究［12-13］發(fā)現(xiàn)，膿毒癥ALI發(fā)生與炎癥因子的持續(xù)過度激活和失控相關(guān)。因此，治療膿毒癥ALI的關(guān)鍵點在于及時阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生。白藜蘆醇和姜黃素在多種疾病治療中表現(xiàn)出抗炎作用，表明二者具有治療膿毒癥ALI的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素腹腔預(yù)注射小鼠膿毒癥可以有效減輕肺損傷程度。

利用可靠、穩(wěn)定的動物模型有助于明確膿毒癥ALI發(fā)病機制、發(fā)掘潛在治療靶點、檢測新研發(fā)藥物安全性以及治療效果。與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）腹腔注射建模相比，CLP建模可以反映人類膿毒癥的眾多特征，被認為是膿毒癥的高度標(biāo)準(zhǔn)化模型之一，當(dāng)前應(yīng)用極為廣泛［14］。本研究中我們采用CLP建立膿毒癥小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)4組小鼠存活率較5組顯著降低，HE染色后發(fā)現(xiàn)4組小鼠肺組織W/D比值與損傷評分較5組顯著增加。ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)4組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10濃度較5組顯著升高。同時WESTERN blotting法檢測發(fā)現(xiàn)4組小鼠肺組織中Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白表達較5組顯著提高。上述結(jié)果充分證實4組小鼠膿毒癥建模成功。

抗氧化、抗衰老、抗癌、抗糖尿病、心臟保護及神經(jīng)保護作用使得白藜蘆醇成為研究最多的天然多酚之一。此外，白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)免疫細胞活性與促炎細胞因子的合成抑制炎癥反應(yīng)［15］。近年研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對ALI具有治療作用。GUO等［16］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)常規(guī)樹突狀細胞的成熟和功能可以減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI。JIANG等［17］揭示白藜蘆醇通過降低長鏈非編碼RNA XLOC_014869表達可以改善LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI并抑制細胞凋亡。姜黃素是姜黃植物的活性成分，為抗氧化劑、抗炎劑和抗癌劑受到了極大的關(guān)注。姜黃素對ALI也具有治療作用，能夠改善肺組織損傷。SHAIKH等［18］通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法證實姜黃素通過抗氧化和抗纖維化活性對ALI發(fā)揮保護作用。LIANG等［19］報道姜黃素通過miR-21/PTEN/NF-kappaB信號通路保護急性肺栓塞大鼠的炎癥和肺損傷。本研究中2組小鼠第2 、3 天存活率較4組升高，1組小鼠第2 天存活率較4組升高，1、2組小鼠肺組織W/D比值與損傷評分較4組降低，表明白藜蘆醇與姜黃素腹腔預(yù)注射均可以改善膿毒癥ALI。3組小鼠第1～4 天存活率較1、2組升高，肺組織W/D和損傷評分較1、2組降低，表明白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素腹腔預(yù)注射對膿毒癥ALI的改善效果優(yōu)于二者單獨用藥。

膿毒癥ALI進展過程中炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的上調(diào)導(dǎo)致肺泡上皮細胞破壞、上皮通透性增加和肺水腫形成。肺組織中促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β及IL-6水平持續(xù)升高，導(dǎo)致患者病死率成比例上升［20］。還有一些研究［21］表明，促凋亡蛋白如 Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP可以加劇肺泡上皮細胞凋亡和損傷，進而提高患者病死率。上述研究表明，抑制促炎細胞因子與促凋亡蛋白表達對于改善膿毒癥ALI至關(guān)重要。本研究中1、2組肺組織中促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6濃度與促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白表達較4組降低，而抗炎因子IL-10濃度與抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達較4組升高，表明藜蘆醇和姜黃素具有抗炎和抗凋亡作用。此外，3組中上述蛋白與炎癥因子的變化程度較1、2組提高，表明白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素腹腔預(yù)注射對膿毒癥ALI中炎癥反應(yīng)與細胞凋亡的抑制作用優(yōu)于藜二者單獨用藥。

NF-κB是炎癥過程的中心介質(zhì)，也是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者，可以被IL-1β和TNF-α激活［22］。NF-κB作為調(diào)控炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控各種促炎基因的翻譯表達。NF-κB通路激活在膿毒癥引起的器官損傷的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。ALI小鼠肺組織中NF-κB通路存在過度激活現(xiàn)象，抑制NF-κB表達可以降低炎癥水平并改善肺組織病理損傷。本研究中4組小鼠PMVECs中NF-κB通路活性較5組升高，表明膿毒癥ALI中NF-κB通路被激活［23］。1、2組小鼠PMVECs中NF-κB通路活性較4組降低，表明藜蘆醇和姜黃素腹腔預(yù)注射可以抑制NF-κB通路激活［24-25］。3組小鼠PMVECs中NF-κB通路活性較1、2組降低，表明白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素腹腔預(yù)注射對NF-κB通路激活的抑制作用優(yōu)于二者單獨用藥。本實驗不足之處在于未能就白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素對NF-κB通路靶向調(diào)節(jié)作用及其上下游基因的反饋性調(diào)節(jié)作用進行研究，擬在后續(xù)深入研究。

綜上所述，白藜蘆醇聯(lián)合姜黃素腹腔預(yù)注射可有效減輕小鼠膿毒癥誘發(fā)過程中的肺損傷程度，其效果優(yōu)于二者單獨用藥，作用機理與其抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡以及NF-κB通路激活有關(guān)。