自然流產(chǎn)和超聲檢查提示臟器結(jié)構(gòu)異常胎兒的染色體高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)分析

李啟發(fā)，朱健生，唐俊湘，孫玉秀，李景然，王朝紅

安徽省婦幼保健院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院遺傳中心，合肥 230000

自然流產(chǎn)指非人為造成、自然狀態(tài)下發(fā)生的流產(chǎn)，發(fā)生率為10%～15%［1］。導(dǎo)致自然流產(chǎn)的因素很多，遺傳性因素有染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常等；非遺傳性因素有感染、子宮異常、精子DNA碎片化、內(nèi)分泌或免疫系統(tǒng)紊亂、孕婦患有抗磷脂抗體綜合征或易栓癥等［2］。盡管病因多樣，胚胎染色體異常是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的常見(jiàn)原因。研究［3］發(fā)現(xiàn)，孕12周之前的流產(chǎn)中至少50%是由胚胎染色體異常導(dǎo)致的，其中染色體數(shù)目異常約占86%，染色體結(jié)構(gòu)異常尤其是染色體末端結(jié)構(gòu)異常約占6%。此外，約3%的胎兒會(huì)出現(xiàn)超聲結(jié)構(gòu)異常，包括單系統(tǒng)微小異常及嚴(yán)重的多系統(tǒng)缺陷。研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒染色體異常率為10%～32%。這時(shí)，進(jìn)一步遺傳學(xué)檢測(cè)方法明確診斷對(duì)后續(xù)臨床診療十分重要。染色體檢查可以明確病因，減少孕婦的心理負(fù)擔(dān)，還可以減少其他不必要的檢測(cè)及治療［6］。特定的染色體異常提示親代隱匿性平衡易位的可能性，因此對(duì)流產(chǎn)物進(jìn)行染色體檢查有助于后續(xù)的遺傳咨詢。既往臨床常用的染色體分析方法有G顯帶核型分析、熒光原位雜交（FISH）、QF-PCR技術(shù)及低深度全基因組測(cè)序拷貝數(shù)變異分析（CNV-seq）等，均具有檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用較高等缺點(diǎn)。高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)（HLPA）是由多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）改進(jìn)而來(lái)的一種新檢測(cè)方法，能夠識(shí)別染色體末端大于3 Mb以上的缺失重復(fù)，具有快速、準(zhǔn)確、價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)［7］。目前關(guān)于HLPA在自然流產(chǎn)和超聲異常胎兒染色體檢測(cè)的應(yīng)用情況相關(guān)研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。我們觀察了HLPA在自然流產(chǎn)或超聲檢查顯示心臟、淋巴水囊瘤或多發(fā)畸形等結(jié)構(gòu)異常胎兒染色體檢測(cè)中的應(yīng)用效果。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 采取隨機(jī)數(shù)字表法選取2019年2月—2021年10月于我院就診的自然流產(chǎn)或超聲檢查胎兒存在結(jié)構(gòu)異常的1 183例孕婦。1 183例孕婦中自然流產(chǎn)995例、超聲胎兒結(jié)構(gòu)異常170例。自然流產(chǎn)患者孕7～15周，平均9周；超聲胎兒結(jié)構(gòu)異常者孕12～32周，平均26+2周。1 183例孕婦分為HLPA組372例、對(duì)照組811例。HLPA組孕婦年齡21～43歲，平均30.5歲，孕7～28周，平均10.9周；CNV-seq組孕婦年齡20～45歲，平均30.6歲，孕7～32周，平均12.2周；兩組年齡、孕周等資料具有可比性。本研究通過(guò)安徽省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，患者及家屬均對(duì)本實(shí)驗(yàn)知情，自愿要求檢測(cè)簽署知情同意書(shū)。

1.2 胎兒染色體檢測(cè) 孕早期孕婦留取絨毛組織約30 mg，孕中晚期孕婦取胎兒肌肉組織約0.5 cm×0.5 cm大小，0.9%生理鹽水反復(fù)洗滌后-20 ℃凍存。將留取組織標(biāo)本組織研磨后，采用短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分型方法排除母源性污染、三倍體和單親二倍體情況。

HLPA組采用HLPA檢測(cè)胎兒染色體：①DNA提取：提取基因組DNA的濃度和純度通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，DNA濃度調(diào)整至20～50 ng/μL。②連接反應(yīng)：取2×連接緩沖液、探針混合液3001、耐熱DNA連接酶和樣本連接反應(yīng)15 h。③連接產(chǎn)物多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增。④擴(kuò)增產(chǎn)物熒光毛細(xì)管電泳分離：將適量的樣品文庫(kù)與擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋液混勻95 ℃5 min變性后，上ABI3500基因分析儀進(jìn)行測(cè)序分析。⑤數(shù)據(jù)讀取及分析：利用GeneMapper?v4.1軟件對(duì)基因分析儀DataCollection?軟件收集的原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)分析。

對(duì)照組采用CNV-seq技術(shù)檢測(cè)胎兒染色體：①DNA提取： 45 μL裂解反應(yīng)液，37 ℃溫育10 min；再加入300 μL緩沖液BST1，室溫孵育10 min，3 min后棄上清，加入600 μL MKW1，2 min后棄上清，重復(fù)2次；加入65 μL緩沖液DH，靜置5 min后將EP管短暫離心，靜置1 min后吸取63 μL于EP管，-20 ℃凍存。②文庫(kù)構(gòu)建：酶切打斷后先磁珠純化，再PCR反應(yīng)。③文庫(kù)Pooling測(cè)序：將適量的樣品文庫(kù)與質(zhì)控樣品文庫(kù)等量混合后Illumina NextSeq 550AR高通量測(cè)序儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

1 183例樣本中18例（1.52%）檢測(cè)失敗，最終1 165例納入研究。HLPA組、對(duì)照組胎兒檢測(cè)失敗率分別為1.61%（6/372）、1.48%（12/811），二者比較，χ2=0.03，P＞0.05。HLPA組、對(duì)照組胎兒染色體異常檢出率分別為60.11%（220/366）、49.94%（399/799），二者比較，χ2=0.524，P＞0.05。HLPA組中胚胎染色體異常220例（60.11%），其中染色體數(shù)目異常204例（55.74%）、染色體結(jié)構(gòu)異常16例（4.37%），染色體結(jié)構(gòu)異常中≥10 Mb缺失重復(fù)12例（3.28%），3～10 Mb缺失重復(fù)3例（0.82%）、≤3 Mb缺失重復(fù)1例（0.27%）。對(duì)照組胚胎染色體異常399例（49.94%），其中染色體數(shù)目異常369例（46.18%）、染色體結(jié)構(gòu)異常30例（3.75%），染色體結(jié)構(gòu)異常中≥10 Mb缺失重復(fù)20例（2.5%）、3～10 Mb缺失重復(fù) 4例（0.5%）、≤3 Mb缺失重復(fù) 6例（0.75%）。 HLPA組、對(duì)照組胎兒染色體數(shù)目異常率、染色體結(jié)構(gòu)異常情況，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為0.455、0.565、0.428、0.959；P均＞0.05）。

3 討論

自然流產(chǎn)是指非人為目的造成的流產(chǎn)，是由于自然因素導(dǎo)致的流產(chǎn)。至少50%的孕12周前自然流產(chǎn)是由胚胎染色體異常引起，且多為染色體數(shù)目異常，包括非整倍體和多倍體［3］。YAKUT 等［7-8］對(duì)457例流產(chǎn)組織進(jìn)行分析顯示三體型最多，頻率較高的是16、21、18、13、22和X 染色體。本研究中1 165例胎兒中染色體異常率為53.13%（619/1 165），其中非整倍體異常483例（41.46%）、三倍體異常88例（7.55%），單親二倍體2例（0.17%）、染色體結(jié)構(gòu)異常46例（3.95%，其中缺失或重復(fù)28例、合并缺失重復(fù)18例）。本研究非整倍體異常中三體型異常占比最高（34.34%，400/1 165），三體型異常中16染色體三體最常見(jiàn)，其次為22、21、13、15和18三體；單體型染色體7.12%（83/1 165），為X染色體單體（80例），3例常染色體單體均為21單體。提示胚胎染色體異常不但主要表現(xiàn)為非整倍體形式，而且非整倍體的類(lèi)型也較為集中。但本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)19號(hào)染色體異常的胎兒。19號(hào)染色體58.6 Mb，包含1 473個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、918個(gè)非編碼基因和527個(gè)假基因，基因密度最高.如存在異常，流產(chǎn)會(huì)在妊娠的第3、4周甚至更早發(fā)生，患者可能只視為月經(jīng)紊亂［9］。

目前流產(chǎn)表型與特定遺傳物質(zhì)異常相關(guān)聯(lián)的關(guān)系仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)發(fā)生在孕7～15周，平均9周，其中染色體數(shù)目異常531例，染色體結(jié)構(gòu)異常者41例，異常類(lèi)型包括單條、多條染色體數(shù)目異常、三倍體、單親二倍體、部分缺失重復(fù)等多種情況，且異常情況分布于每條染色體。超聲胎兒結(jié)構(gòu)異常的胎兒中染色體數(shù)目異常40例、染色體結(jié)構(gòu)異常者5例，異常類(lèi)型僅為單條染色體數(shù)目異常和染色體的部分缺失重復(fù)，數(shù)目異常的染色體號(hào)也比較集中，僅分布在9、13、18、21和X染色體上，18三體發(fā)生率最高，其次為X單體、13、21三體。除13、18、21和X染色體，其他染色體數(shù)目異常大多是致死性的，通常會(huì)發(fā)生孕早期胚胎停育［10］，如流產(chǎn)組織中最常見(jiàn)的16三體染色體異常，發(fā)生率為1%～2%，但16三體染色體異常致死性較高，本研究中16三體染色體異常僅見(jiàn)于自然流產(chǎn)。21三體活產(chǎn)兒發(fā)生率為1/600～1/800，但產(chǎn)前超聲多無(wú)明顯異常，產(chǎn)前難以檢出，其分娩風(fēng)險(xiǎn)最高；18三體染色體異常的活產(chǎn)兒發(fā)生率低于21三體染色體異常，多數(shù)產(chǎn)前超聲都會(huì)發(fā)現(xiàn)胎兒存在一種或幾種異常［11］。

流產(chǎn)組織染色體分析有助于明確流產(chǎn)原因［3］。G顯帶核型分析結(jié)果是染色體分析的臨床金標(biāo)準(zhǔn)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、分辨率低且存在培養(yǎng)失敗的風(fēng)險(xiǎn)［12］。FISH或QF-PCR技術(shù)具有檢測(cè)周期短、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，但分辨率低，檢測(cè)范圍局限［13］。CNV-seq技術(shù)既可以檢測(cè)染色體數(shù)目異常又可以檢測(cè)亞顯微水平的拷貝數(shù)變異，具有高分辨率、高準(zhǔn)確性和高基因覆蓋率等優(yōu)勢(shì)，但費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)［14］。HLPA是由多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）改進(jìn)而來(lái)的一種新方法，在近端粒區(qū)域增加了足夠的探針，能夠可靠的識(shí)別染色體末端大于3Mb以上的缺失重復(fù)，且具有快速、準(zhǔn)確、價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)［15］。雖然CNV-seq分辨率高達(dá)100 Kb，能更好地檢出微小拷貝數(shù)變異，但本研究為流產(chǎn)組織，≥3 Mb染色體異常占比高達(dá)98.87%，且一般認(rèn)為CNV＞10 Mb與自然流產(chǎn)直接相關(guān)，10 Mb＞CNV＞2 Mb則需要參考CNV數(shù)據(jù)庫(kù)［16］。人類(lèi)基因組中雖有許多小片段CNV，但這些是進(jìn)化、遺傳多樣性和疾病易感性的基礎(chǔ)，目前尚不確定是否與流產(chǎn)有關(guān)，致病性小片段CNV的發(fā)生率僅為0.6%～0.78%，意義不明的小片段CNV給后續(xù)診斷病因及遺傳咨詢帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。HLPA是一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快速的檢測(cè)流產(chǎn)組織染色體的方法［17］，具有高靈敏度（98.9%）和高特異度（100%）。本研究中。兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)于染色體數(shù)目異常和部分缺失重復(fù)，檢出率相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，HLPA在孕早期流產(chǎn)病因診斷中有很好的應(yīng)用前景，有助于后續(xù)遺傳咨詢。

臨床應(yīng)用中，HLPA檢測(cè)每例樣本所需費(fèi)用1 200元，檢出1例染色體異常胎兒的平均費(fèi)用1 996.4元；CNV-seq檢測(cè)每例樣本所需費(fèi)用2 000元，檢出1例染色體異常胎兒的平均費(fèi)用4 005.0元。HLPA的檢測(cè)費(fèi)用低于CNV-seq技術(shù)，可緩解患者的經(jīng)濟(jì)壓力。

綜上所述，HLPA對(duì)染色體異常的診斷效能與CNV-seq技術(shù)相當(dāng)，且檢測(cè)周期短、成本較低，可用于胎兒遺傳學(xué)診斷中。