基于生物信息學及實驗驗證探討腦出血后代謝相關鐵死亡機制及安腦平沖方干預作用

張瑛 ，張宇星 ，郭純 ，周德生

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

腦出血是非創傷性腦血管破裂，致腦實質內血液聚集，出現頭痛、嘔吐、不同程度意識障礙等局灶神經功能缺損癥狀的急性腦血管疾病[1]，約占全部腦卒中的18.8%～47.6%，具有高病死率、高致殘率的特點[2]。

鐵死亡是一種在Fe2+參與下，細胞先后出現鐵沉積、水腫、破裂現象，以細胞內線粒體體積縮小、嵴減少、內膜密度增大、外膜破裂為特征的死亡方式[3]。腦出血后神經元鐵死亡調控機制可能與鐵代謝、脂質代謝、氨基酸/谷胱甘肽代謝異常有關[4]。外源性Fe3+與轉鐵蛋白（Tf）結合形成Tf-Fe3+復合物，此復合物與轉鐵蛋白受體（TfR）結合后被轉運至細胞內，在酶的作用下Fe3+被還原為Fe2+，形成不穩定鐵池，Fe2+作為輔助因子，能增強脂氧合酶活性，激發芬頓反應，促進脂質過氧化，致細胞膜上多不飽和脂肪酸破裂，進而腦組織中神經元細胞裂解死亡[5]，代謝相關性鐵死亡是腦出血發生發展中的關鍵機制。

安腦平沖方是湖南中醫藥大學第一附屬醫院治療出血性腦卒中的協定方，基礎研究及臨床觀察顯示其用于腦出血效果良好[6-10]。前期研究表明，安腦平沖方能下調Tf和TfR表達，減少鐵離子向神經元轉移，改善腦出血后大鼠神經功能缺損癥狀，發揮神經保護作用[11]。基于此，本研究從生物信息學、體內實驗驗證角度，探討安腦平沖方在腦出血后代謝相關性鐵死亡中的分子機制，為新藥開發提供理論和實驗依據，為中醫藥防治腦出血提供參考。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

1.1.1 代謝相關鐵死亡基因集獲取

通過Reactome（https://reactome.org）數據庫[12]，進入“Pathway Browser”條目，下載“Metabolism”通路基因集，作為代謝相關基因集（MRGs）。通過GeneCards 數據庫[13]，以“Ferroptosis”為檢索詞，同時從FerrDb（http://www.zhounan.org/ferrdb）數據庫[14]下載鐵死亡相關基因，整合2個數據庫基因，獲得鐵死亡相關基因（FRGs）。

1.1.2 腦出血差異基因獲取

通過 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫，以“Intracerebral Hemorrhage”為檢索詞，設定物種為“Homo sapiens”，條目類型為“Series”，且每組樣本量≥3例，下載腦出血芯片表達譜數據（GSE24265、GPL570）。GSE24265共有11個樣本，包括出血側血腫周圍組織及對側灰質白質組織，將出血側血腫周圍組織樣本設為模型組（GSM596842、GSM596845、GSM596848、GSM596850），對側灰質白質組織為對照組（GSM596843、GSM596844、GSM596846、GSM596847、GSM596849、GSM596851、GSM596852），采用R語言limma包對2組進行差異分析，以|log2(FC)|>1且Padj<0.05為篩選條件，獲取腦出血差異基因（DEGs）。

利用在線取交集工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），取DEGs、MRGs、FRGs三者的交集，獲取腦出血后代謝相關鐵死亡基因（ICH-MFRGs）。

1.1.3 腦出血后代謝相關鐵死亡基因差異表達分析

下載GSE24265表達譜數據，提取ICH-MFRGs在模型組與對照組中的相對表達量，進行獨立樣本t檢驗以鑒定各基因表達差異，采用R語言ggpolt2包進行可視化。

1.1.4 腦出血后代謝相關鐵死亡基因蛋白相互作用及GO、KEGG富集分析

通過 STRING（http://string-db.org）數據庫[15]，導入ICH-MFRGs，導出蛋白相互作用（PPI）信息，采用Cytoscape3.9.0[16]進行可視化。根據節點蛋白的相互作用對應次數的Degree值設置顏色和大小，Degree值越大顏色越紅且節點越大，Degree值越小顏色越藍且節點越小。

通過Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）平臺下載org.Hs.eg.db、clusterProfiler包[17]，org.Hs.eg.db包用于ID轉換，clusterProfiler包用于富集分析。采用R語言，以Padj<0.05且qvalue<0.2為篩選條件，對ICH-MFRGs進行GO功能富集分析，包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF），以及KEGG通路富集分析，并采用ggpolt2包進行可視化。

1.1.5 安腦平沖方藥物靶點及其干預靶點獲取

通過TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[18]、TCMID（https://47.100.169.139/tcmid/）[19]、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）[20]數據庫，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，獲取安腦平沖方組方藥物龍骨、牡蠣、川牛膝、蒺藜、鉤藤、澤瀉、牡丹皮、梔子、黃芩、白芍、生大黃的有效組分。通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[21]數據庫，檢索各有效組分的SMILES編碼，將SMILES編碼導入 SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget prediction.ch/）[22]數據庫獲取潛在藥物靶點。

通過在線取交集工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），取安腦平沖方藥物靶點與ICH-MFRGs交集，獲取安腦平沖方干預腦出血后代謝相關鐵死亡靶點，即干預靶點。

1.2 體內實驗驗證

1.2.1 動物

SPF級雄性SD大鼠45只，體質量250～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心，相對濕度50%～70%，室溫22～26 ℃，自然晝夜交替，墊料隔日更換1次。動物實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會審查批準（ZYFY20210427）。

1.2.2 藥物

安腦平沖方（龍骨30 g，牡蠣30 g，川牛膝15 g，蒺藜12 g，鉤藤12 g，澤瀉12 g，牡丹皮12 g，梔子12 g，黃芩12 g，白芍12 g，生大黃9 g）飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院張裕民主任藥師鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》規定。制備方法：龍骨、牡蠣先煎30 min；將除生大黃、鉤藤的其他飲片混合，浸泡2 h；共煎煮2次，第1次加水煮沸10 min后，加生大黃、鉤藤再煎10 min，倒出藥液，第2次加水煮沸30 min，倒出藥液，2次藥液混合，于旋轉蒸發儀上濃縮，冷卻后即得安腦平沖方浸膏。以生理鹽水配制成原藥材濃度為3.0 g/mL的安腦平沖方藥液，于4 ℃保存備用。

1.2.3 主要儀器與試劑

1900標準型單臂腦立體定位儀（美國KOPF公司），HM325石蠟切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司），NanoDrop One超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），DS-U3顯微成像系統（日本尼康公司），1658000小型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司），1703930轉印槽（美國Bio-Rad公司），PowerPac蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司），Gel Doc XR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），iQ5熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），D3024R臺式高速冷凍型微量離心機（中國DragonLab公司），EnSpire多功能酶標儀（美國Perkinelmer公司）。

BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號70-PQ0012），SLC2A3抗體、LDHA抗體、β-actin抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號分別為20403-1-AP、21799-1-AP、02536-1-AP、SA00001-2），AKR1C1抗體、SLC2A1抗體（英國Abcam公司，批號分別為ab131375、ab115730），總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號DP419），反轉錄試劑盒、擴增試劑盒（上海近岸科技有限公司，批號分別為E047、E096），SLC2A3、LDHA、AKR1C1、SLC2A1、GAPDH引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.4 造模

參照課題組前期造模方法[7]，大鼠適應性喂養7 d后，用10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉滿意后經心臟采血0.1 mL。將大鼠固定于單臂腦立體定位儀上，保持前后囟在同一水平，備皮消毒后用手術刀于前正中線上切開1 cm，暴露顱骨后于冠狀縫前1 mm，中線左側旁開3 mm處，垂直進針6 mm，采用二次注血推針法，先勻速注血50 μL，保持進針深度并停針5 min，再次緩慢勻速注血50 μL，停針10 min后開始推針2.0 mm，再次停針4 min，最后推針，骨蠟封閉骨窗。

1.2.5 分組及給藥

將45只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和安腦平沖方組。假手術組心臟采血時僅進針不抽血，自體注血時僅進針不注血。模型組和安腦平沖方組大鼠造模完成清醒后，采用Longa評分法[23]進行評分并剔除0分和4分大鼠，實驗過程中死亡或取腦組織時未發現出血病理改變的大鼠予以剔除，選備用大鼠重新造模，補齊每組15只。安腦平沖方組參照前期研究最佳給藥劑量[7]，予安腦平沖方藥液15 g/（kg·d）灌胃，假手術組和模型組予等體積蒸餾水灌胃，每日2次，連續7 d。

1.2.6 改良神經功能缺損評分

分別于造模后1、3、7 d采用改良神經功能缺損評分（mNSS）[24]評價各組大鼠神經功能缺損情況。mNSS總分為18分，綜合評價大鼠的運動試驗（提尾試驗、將大鼠放置于地板上）、感覺試驗（放置感覺、本體感覺）、平衡木試驗、反射消失和不正常運動（耳廓、角膜、驚恐、病理反射），評分越高表明神經功能缺損越嚴重。

1.2.7 腦組織含水量測定

大鼠麻醉取血后，迅速斷頭取腦組織。將腦組織表面血液及軟腦膜清理干凈，切取左側大腦半球，取出血側腦組織放入錫箔紙上，稱量濕重。然后以錫箔紙包裹放入恒溫烘干箱中，100 ℃烘干24 h達到恒重，稱量出血側腦組織干重。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）÷濕重×100%。

1.2.8 HE染色與Nissl染色觀察腦組織皮質區形態

大鼠麻醉取血后，迅速取腦組織。皮質區腦組織經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（3 μm）、脫蠟、復水、染色（HE、Nissl染色）后，于顯微成像系統獲取腦組織神經元圖像，觀察5個不同視野，采用Image J軟件計算皮質區尼氏小體數目。

1.2.9 RT-qPCR 檢 測 腦 組 織 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達

大鼠麻醉取血后，迅速取左側出血灶腦組織皮質。稱取腦組織50 mg，用Trizol法提取腦組織總RNA，檢測RNA濃度和純度后采用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，以其為模板，采用SYBR Green進行兩步法實時熒光定量PCR擴增。反應體系：cDNA產物1 μL，正、反向引物各0.5 μL，2×SYBR Green染料10 μL，無RNA酶水3.2 μL，總體積20 μL。各基因引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃反應30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。以GAPDH為內參，每組使用5個生物樣本，每個樣品重復3次，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

1.2.10 Western blot檢測腦組織 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達

大鼠麻醉取血后，迅速取左側出血灶腦組織皮質，沖洗后加入裂解液（裂解液∶PMSF=100∶1）低溫勻漿，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，用轉膜儀轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉 1.5 h，加入 SLC2A3一抗（1∶1 000）、AKR1C1一抗（1∶2 000）、LDHA一抗（1∶1 000）、SLC2A1一抗（1∶100 000）、β-actin一抗（1∶6 000），4 ℃孵育過夜；洗膜3次，10 min/次，加入山羊抗兔抗體（1∶10 000），37 ℃孵育2 h，洗膜后凝膠成像分析儀成像，采用Image J分析圖像灰度值。

1.2.11 統計學方法

采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態性與方差齊性采用方差分析LSD法進行兩兩比較，不符合正態性采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 代謝相關鐵死亡基因

通過Reactome數據庫，獲取MRGs共2 143個；整合GeneCards、FerrDb數據庫，獲取FRGs共659個。

2.2 腦出血后代謝相關鐵死亡基因

以|log2(FC)|>1且Padj<0.05為篩選條件，獲取DEGs共776個（見圖1A），其中434個DEGs在腦出血模型中高表達，342個DEGs在腦出血模型中低表達。取DEGs、MRGs、FRGs三者的交集，獲得ICHMFRGs共15個，分別為ACADSB、AKR1C1、CAV1、 G0S2、 GCH1、 HMOX1、 LDHA、 PLIN2、PRKAA2、PSMD8、RPL8、RPLP0、SAT1、SLC2A1、SLC2A3（見圖1B）。

圖1 腦出血差異基因及腦出血后代謝相關鐵死亡基因

2.3 腦出血后代謝相關鐵死亡基因表達差異

為進一步鑒定ICH-MFRGs在模型組與對照組中的表達差異，提取GSE24265芯片中基因相對表達量，進行獨立樣本t檢驗，ACADSB、PRKAA2在腦出血后差異 低 表 達 （P<0.01，P<0.05）， AKR1C1、 CAV1、G0S2、GCH1、HMOX1、LDHA、PLIN2、PSMD8、RPL8、RPLP0、SAT1、SLC2A1、SLC2A3在腦出血后差異高表達（P<0.05，P<0.01，P<0.001），見圖2。

圖2 腦出血后代謝相關鐵死亡基因表達差異散點圖

2.4 腦出血后代謝相關鐵死亡基因蛋白相互作用及GO、KEGG富集分析結果

腦出血后代謝相關鐵死亡基因PPI網絡共有15個節點和35條邊，即15個蛋白質之間有35組相互作用關系，相互作用關系強度由強到弱依次為LDHA、PLIN2、 SLC2A1、 HMOX1、 CAV1、 RPLP0、ACADSB、 PRKAA2、 SLC2A3、 PSMD8、 GCH1、RPL8、AKR1C1、G0S2、SAT1，見圖3。

圖3 腦出血后代謝相關鐵死亡基因PPI網絡

在Padj<0.05且qvalue<0.2條件下，GO分析得到BP共66條、CC共14條、MF共10條，KEGG分析得到4條通路。對前10條GO條目、前4條KEGG通路進行可視化，見圖4。腦出血后代謝相關鐵死亡基因主要富集到缺氧應激、輔酶代謝過程、細胞酮代謝過程等生物過程，在脂質體、細胞膜、胞質核糖體等細胞組分，發揮葡萄糖跨膜轉運蛋白活性、己糖跨膜轉運蛋白活性、輔酶結合等分子功能；介導HIF-1信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、鐵死亡等信號通路。

圖4 腦出血后代謝相關鐵死亡基因GO、KEGG富集分析

2.5 安腦平沖方藥物靶點及其干預靶點

通 過 TCMSP、 TCMID、 ETCM、 PubChem、SwissTargetPrediction數據庫檢索，得到安腦平沖方組方藥物有效成分分別為龍骨1個、牡蠣3個、川牛膝4個、蒺藜12個、鉤藤33個、澤瀉10個、牡丹皮11個、梔子15個，黃芩36個、白芍13個、生大黃16個，整合重復靶點后獲得安腦平沖方潛在藥物靶點共901個。將安腦平沖方潛在藥物靶點與腦出血后代謝相關鐵死亡靶點取交集，共獲得4個干預靶點，分別為SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1。

2.6 安腦平沖方對模型大鼠神經功能缺損的影響

模型組與安腦平沖方組大鼠在造模2 h后逐漸蘇醒，均出現不同程度右側肢體偏癱、“追尾征”、右側傾倒等神經功能缺損癥狀，造模成功。與假手術組比較，模型組、安腦平沖方組大鼠mNSS于造模后1、3、7 d均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，安腦平沖方組造模后1 d mNSS無明顯差異（P>0.05），神經功能缺損癥狀未見明顯改善，造模后3、7 d mNSS均顯著降低（P<0.01），神經功能缺損癥狀明顯改善。見表2。

表2 各組大鼠造模后不同時點mNSS比較（±s，分）

表2 各組大鼠造模后不同時點mNSS比較（±s，分）

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別假手術組模型組安腦平沖方組只數15 15 15 1 d 0.00±0.00 13.07±1.10**12.87±1.41**3 d 0.00±0.00 11.87±0.99**10.13±1.19**##7 d 0.00±0.00 11.13±0.74**8.93±1.28**##

2.7 安腦平沖方對模型大鼠腦組織含水量的影響

與假手術組比較，模型組、安腦平沖方組大鼠腦組織含水量均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，安腦平沖方組大鼠腦組織含水量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量比較（±s，%）

表3 各組大鼠腦組織含水量比較（±s，%）

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別假手術組模型組安腦平沖方組只數5 5 5腦組織含水量77.01±0.73 85.45±0.63**81.21±0.74**##

2.8 安腦平沖方對模型大鼠腦組織病理改變的影響

HE染色結果顯示，假手術組大鼠神經細胞及膠質細胞形態正常，排列致密，結構完整，細胞核淡染，核仁清晰，無炎癥細胞浸潤、壞死、凋亡等病理反應；模型組大鼠可見神經細胞大片缺失、變性、腫脹，細胞間隙增大，部分可見紅細胞浸潤，散在出血，膠質細胞及星形細胞增生、腫脹，核仁固縮且溶解；安腦平沖方組細胞水腫減輕，神經細胞丟失較模型組大鼠減少，神經元變性恢復，胞體形態較飽滿，仍有核固縮及空泡現象。見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織形態（HE染色，×400）

Nissl染色結果顯示，假手術組大鼠神經細胞形態正常，結構清晰，排列緊密；模型組神經細胞形態異常，核固縮，尼氏小體數量減少（P<0.01），多呈空泡樣變性或壞死；安腦平沖方組神經細胞形態較模型組好轉，尼式小體數目增多（P<0.05），核間隙變小，染色均勻。見圖6、表4。

圖6 各組大鼠腦組織形態（Nissl染色，×400）

表4 各組大鼠尼式小體數目比較（±s，個）

表4 各組大鼠尼式小體數目比較（±s，個）

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別假手術組模型組安腦平沖方組只數5 5 5尼氏小體數目91.20±7.03 65.60±5.82**75.40±5.85**#

2.9 安 腦 平 沖 方 對 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組、安腦平沖方組SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達均顯著升高（P<0.01），與生物信息學結果一致；與模型組比較，安腦平沖方組SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達均顯著降低（P<0.01）。見表5。

表5 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達比較（±s）

表5 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達比較（±s）

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別假手術組模型組安腦平沖方組只數5 5 5 SLC2A3 1.08±0.13 5.28±0.84**3.41±0.68**##AKR1C1 0.96±0.08 4.85±0.74**3.72±0.37**##LDHA 1.01±0.12 5.72±0.60**4.56±0.61**##SLC2A1 1.07±0.08 3.63±0.32**2.45±0.71**##

2.10 安 腦 平 沖 方 對 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達均顯著升高（P<0.01），安腦平沖方組AKR1C1蛋白表達顯著升高（P<0.01），SLC2A3、SLC2A1升高（P<0.05），LDHA升高不明顯（P>0.05）；與模型組比較，安腦平沖方組SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達均顯著降低（P<0.05）。見圖7、表6。

圖7 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白免疫印跡

表6 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達比較（±s）

表6 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達比較（±s）

注：與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別假手術組模型組安腦平沖方組只數5 5 5 SLC2A3 0.78±0.10 1.29±0.13**1.04±0.16*#AKR1C1 0.62±0.11 1.04±0.11**0.84±0.10**#LDHA 0.71±0.10 1.14±0.19**0.88±0.12#SLC2A1 0.70±0.12 1.40±0.23**1.02±0.20*#

3 討論

《中國腦出血診治指南（2019）》指出，腦出血當內外科協同治療，內科治療常予降壓、控制血糖、止血、神經保護等藥物，中醫藥制劑也廣泛用于腦出血治療[25]。腦出血發生后，局部腦組織血液聚集，導致機體出現一系列復雜的病理過程，涉及血腫周圍炎癥反應、神經細胞程序性死亡、小膠質細胞極化等[26]，各機制交互影響，相互轉化，最終導致大量神經細胞損傷。腦出血后，血液中的血紅蛋白破裂，釋放大量鐵離子，激活活性氧（ROS）系統，增加神經元攝入外源性H2O2入胞，胞質內H2O2與N-乙酰半胱氨酸介導的谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）相互拮抗，大量ROS破壞了抗氧化系統與ROS之間的動態平衡，增強脂質過氧化，進而神經細胞發生鐵死亡[27]。Peng等[28]研究表明，中藥有效成分球豆堿能上調GPX4和谷胱甘肽還原酶的共表達，抑制神經細胞鐵死亡，減輕腦出血后腦損傷。

腦出血屬中醫學“中風”范疇[29]，正氣虧虛，陰陽失調，沖氣上逆，氣血直沖犯腦，腦脈破裂出血，沖氣上逆者，發為沖陰，尤甚者稱沖風[30-31]。沖脈動而諸脈動，腦竅氣化不利，形神俱病，治當平沖降逆、通調氣血。本團隊在中醫腦藏象理論指導下，創立“沖脈理論”，沖為血海，調腦之血液灌注，太沖元氣者，調之以氣機升降、髓海神明，故沖氣是腦之升降出入，循環代謝的基礎。出血性中風者，肝氣上逆為重，兼合肺胃腎之氣而上逆，或肝木生火，風火內動，兼夾痰、瘀、毒邪上攻于腦，氣機閉阻，上擾清竅，神昏而肢癱。

基于“沖脈理論”并結合潛降鎮攝法，創制安腦平沖方，鎮沖、平沖、降沖協同呼應，即對病勢，直指內風。方中鉤藤、蒺藜為君，蒺藜祛風平肝疏肝，鉤藤可“開氣閉”（《本草匯言》），二藥均輕揚走竄，易達腦竅，開玄府之郁閉。臣以川牛膝補益肝腎、活血逐瘀通經且能利尿通淋，生大黃逐瘀通經，通宣氣機以調血脈。龍骨、牡蠣重用，平肝潛陽、重鎮安神，方能鎮沖、平沖、降沖，澤瀉利水滲濕、泄熱化濁，使內生兼夾之邪從大小便排出；梔子、黃芩二藥合用，涼血瀉火，清肺瀉肝，牡丹皮破血行血，除血分之熱，為佐。白芍“通順血脈，緩中”（《名醫別錄》），為使藥。諸藥合用，可清利三焦、五臟同治，諸邪并治，達到潛降沖氣，通調氣血，最終使腦之氣化功能得以恢復，消除腦腑血證。

生物信息學研究發現腦出血后15個代謝相關鐵死亡基因差異表達，其中ACADSB、PRKAA2低表達，AKR1C1、CAV1、G0S2、GCH1、HMOX1、LDHA、PLIN2、PSMD8、RPL8、RPLP0、SAT1、SLC2A1、SLC2A3高表達。腦出血代謝相關鐵死亡基因之間存在35組相互作用關系，主要富集到缺氧應激、輔酶代謝過程、細胞酮代謝過程等生物進程，在脂質體、細胞膜、胞質核糖體等細胞組分，發揮葡萄糖跨膜轉運蛋白活性、己糖跨膜轉運蛋白活性、輔酶結合等分子功能；介導HIF-1信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、鐵死亡等信號通路，在腦出血的發生發展中發揮作用。前期研究發現，安腦平沖方能增加超氧化物歧化酶活性，抑制丙二醛生成，上調血腫周圍腦組織GPX4、轉運蛋白系統Xc-、Tf、TfR蛋白表達，減輕腦出血大鼠神經功能缺損癥狀，發揮腦保護作用[7，9]。為進一步深入研究安腦平沖方抑制代謝相關鐵死亡的作用機制，本研究采用網絡藥理學方法發現安腦平沖方可能作用于ICH-MFRGs中的SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1靶點。Liu等[32]研究發現腦出血大鼠SLC2A1 mRNA過表達，早期干預可有效降低其水平，然而SLC2A3、AKR1C1、LDHA在腦出血中的相關作用尚無報道。

本研究體內實驗證實，安腦平沖方能顯著降低大鼠腦出血后3、7 d mNSS，改善神經功能缺損癥狀，可能與其消除腦水腫，改善腦組織病理情況，增加尼氏小體數目，下調 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA及蛋白表達有關。SLC2A3與SLC2A1為葡萄糖轉運蛋白家族基因，Schmidt等[33]研究發現，SLC2A3與SLC2A1均能維持神經元能量供應，且SLC2A3是神經元能量供應的主要調控基因，同時是機體運動、學習、記憶及進食的主要參與者。LDHA是乳酸代謝中的關鍵酶乳酸脫氫酶的2種亞型之一，主要負責將丙酮酸轉化成乳酸和NAH+，研究發現，LDHA上調能顯著增加海馬組織中Warburg效應，促進海馬神經元細胞鐵死亡[34]。AKR1C1屬于醛酮還原酶超家族基因，是人類類固醇代謝的關鍵基因，研究發現，AKR1C1在A549、H1975非小細胞肺癌細胞系中表達上調，沉默AKR1C1能顯著降低GPX4的表達，升高Tf、環加氧酶2的表達，促進鐵死亡的發生[35]。

綜上所述，安腦平沖方通過多組分下調SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1表達，調控代謝相關鐵死亡通路，增加腦出血大鼠腦組織尼氏小體數目，修復病理情況，消除腦水腫，改善神經功能缺損癥狀，發揮神經保護作用。本研究結果可為安腦平沖方治療腦出血提供參考，并為中醫藥治療腦出血提供靶點依據。