黃芪對糖尿病視網膜病變小鼠的影響及機制研究

劉漢瀅 ，季青璇 ，彭美中 ，馬盼 ，牛藝婷 ，徐藝宸 ，韓靜

1.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029； 2.北京中醫藥大學北京中醫藥研究院，北京 100029

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿病引起的微血管并發癥[1]，是成年人失明最常見的原因[2]。在我國，隨著糖尿病患病人數增加，DR的致盲率日益升高[3]。目前，DR的治療方法有控制血糖、激光光凝手術、注射抗血管內皮生長因子藥物等。但目前的治療方法存在弊端，如經視網膜光凝手術治療后，患者出現視網膜受損性裂孔、虹膜受損、出血等不良反應[4]；使用抗血管內皮生長因子藥物治療后，部分患者出現牽引性視網膜脫離、眼壓升高、黃斑孔形成及葡萄膜炎等不良反應[5]。因此，亟需尋找能夠有效治療DR的新方法。

黃芪味甘，性微溫，具有補氣升陽、固表止汗、斂瘡生肌等作用[6]。藥理研究表明，黃芪可降低糖尿病大鼠血糖[7]。臨床研究表明，黃芪注射液能提高DR患者視力，減少眼底出血，改善血液流變學指標[8]。此外，黃芪有效部位黃芪多糖能減少視網膜血管中白細胞黏附，降低DR大鼠視網膜腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等蛋白表達[9]。黃芪主要成分黃芪甲苷可顯著抑制db/db小鼠視網膜神經節細胞凋亡[10]。雖然提示黃芪具有治療DR的潛力，但藥理機制尚未闡明。本實驗通過建立小鼠糖尿病模型，觀察黃芪對糖尿病小鼠視網膜病變的作用，并探討其潛在機制，為黃芪治療DR的臨床應用奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠18只，8周齡，體質量20～25 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號SYXK（京）2019-0030。飼養于北京中醫藥大學動物實驗中心，溫度22～27 ℃，濕度45%～55%，自然光照，適應性喂養1周。本實驗經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（BUCM-4-2020102005-4193）。

1.2 藥物及制備

黃芪，購于南京同仁堂有限公司，批號6971133498764。稱取黃芪飲片50 g，加10倍量去離子水，煎煮2次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮至5 g/mL，于4 ℃保存。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ），德國Sigma，貨號S0130；檸檬酸鈉緩沖液，江蘇凱基生物技術股份有限公司，貨號KGHC001；封閉用羊血清，北京中杉金橋，貨號ZLI-9056；小鼠內皮糖蛋白（Endoglin/CD105）抗體，英國Abcam，貨號ab156756；基質金屬蛋白酶2（MMP2）抗體，英國Abcam，貨號ab79781；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）抗體，美國CST，貨號D5C5Z；含DAPI熒光封片劑，北京中杉金橋，貨號ZF-0311；山羊抗小鼠IgG，英國Abcam，貨號ab97018；羊抗兔IgG-Alexa Fluor 647，北京百瑞極生物，貨號BN20636；Triton X-100，北京百瑞極生物，貨號9002-93-1。光學顯微鏡（德國Leica，型號DM2500），激光共聚焦顯微鏡（德國Leica，型號TCS SP8），視網膜顯微成像系統（美國Phoenix Research Labs，型號Micron Ⅲ）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

小鼠隨機分為正常組、模型組和黃芪組，每組6只。除正常組外，其余各組參照文獻[11]方法制備DR小鼠模型。小鼠禁食12 h，模型組和黃芪組連續5 d腹腔注射鏈脲佐菌素溶液60 mg/kg（pH=4.4檸檬酸鈉緩沖液配制），正常組注射等體積檸檬酸鈉緩沖液。4周后小鼠尾靜脈采血測定空腹6 h血糖，剔除血糖<16.7 mmol/L小鼠。按60 kg成人臨床劑量與小鼠體表面積換算給藥劑量，黃芪組予黃芪水提物80 mg/kg灌胃[12-13]，正常組和模型組予等體積羧甲基纖維素鈉灌胃，連續6周。

2.2 體質量與空腹血糖測定

每周稱量小鼠體質量，每2周檢測小鼠空腹血糖。

2.3 光學相干斷層掃描檢測視網膜厚度

小鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉麻醉，滴加復方托吡卡胺滴眼液散瞳，卡波姆眼膏潤滑角膜，將小鼠眼球緊貼于實驗儀器鏡面進行觀察并拍照。采用Image J軟件對圖片進行分析，統一標尺長度以測量視網膜厚度，以中央凹為起點，在左右各150、300 μm處測量視網膜全層厚度。

2.4 網絡藥理學分析

2.4.1 黃芪有效成分及靶點篩選

在 TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數據庫以“黃芪”為關鍵詞進行檢索，獲取黃芪有效成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選。通過SwissTargetPrediction數據庫檢索有效成分對應靶點信息，將篩選的靶點導入UniProt數據庫（http://www.uniprot.org/up-loadlists/），限定物種為“人類”，將靶點蛋白、基因信息標準化。

2.4.2 糖尿病視網膜病變相關靶點篩選

以“diabetic retinopathy”為關鍵詞在OMIM（https://www.omim.org/）、GAD（https://www.g6gsoftwaredirectory.com/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數據庫進行檢索，獲得DR相關靶點。

2.4.3 黃芪治療糖尿病視網膜病變靶點預測

將黃芪有效成分靶點與DR相關靶點導入Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）得到交集靶點，即黃芪治療DR的潛在靶點。

2.4.4 蛋白相互作用網絡構建

將獲得的交集靶點導入STRING（https://cn.stringdb.org/）數據庫，物種設置為“人類”，剔除孤立靶點，以TSV格式將數據導出，得到蛋白相互作用（PPI）網絡，并進行蛋白間相互作用分析。

2.4.5 黃芪治療糖尿病視網膜病變靶點生物功能注釋

將黃芪治療DR靶點上傳至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/list.jsp）數據庫，對靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，將閾值P<0.01設定為篩選條件。

2.5 免疫熒光染色

干預結束后，取視網膜，制作視網膜組織切片，依次加入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ浸泡20 min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%）脫水5 min，流水沖洗10 min，甘氨酸溶液孵育10 min，PBS沖洗3次，羊血清封閉30 min，分別滴加CD105一抗（1∶50）、MMP2一抗（1∶200）、GSK-3β一抗（1∶250），4 ℃孵育過夜。PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗（1∶400），37 ℃避光孵育60 min，加入適量含DAPI熒光封片劑，避光復染5 min，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J軟件分析蛋白平均光密度。

3 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態分布，多組間比較采用方差分析，方差齊組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊用T2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 黃芪對模型小鼠體質量及空腹血糖的影響

與正常組比較，模型組小鼠體質量明顯減少（P<0.05），空腹血糖明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪組小鼠體質量明顯增加（P<0.05），空腹血糖水平無明顯變化（P>0.05）。結果見表1。

表1 各組小鼠體質量和空腹血糖比較（±s）

表1 各組小鼠體質量和空腹血糖比較（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常組模型組黃芪組只數6 6 6體質量/g 32.25±1.47 20.34±1.15*22.34±1.51#空腹血糖/（mmol/L）8.57±0.73 25.83±2.86*23.17±9.95

4.2 黃芪對模型小鼠視網膜厚度的影響

光學相干斷層掃描前麻醉過程中，黃芪組小鼠死亡2只。對視網膜厚度測量后發現，與正常組比較，模型組小鼠距中央凹150、300 μm處視網膜厚度明顯減少（P<0.05）；與模型組比較，黃芪組小鼠距中央凹150、300 μm處視網膜厚度明顯增加（P<0.05）。結果見圖1、表2。

圖1 各組小鼠視網膜光學相干斷層掃描圖像

表2 各組小鼠視網膜厚度比較（±s，μm）

表2 各組小鼠視網膜厚度比較（±s，μm）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

距中央凹300 μm厚度組別 只數 距中央凹150 μm厚度163.00±4.46 153.52±7.63*158.12±7.53#正常組模型組黃芪組6 6 4 160.67±3.89 151.79±6.81*156.12±7.05#

4.3 黃芪對模型小鼠視網膜組織CD105蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠視網膜組織CD105蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪組小鼠視網膜組織CD105蛋白表達明顯降低（P<0.05）。結果見圖2、表3。

圖2 各組小鼠視網膜組織CD105蛋白表達（免疫熒光染色，×400）

表3 各組小鼠視網膜組織CD105蛋白表達比較（±s，%）

表3 各組小鼠視網膜組織CD105蛋白表達比較（±s，%）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常組模型組黃芪組只數6 6 4平均光密度0.033±0.001 0.039±0.002*0.035±0.001#

4.4 網絡藥理學分析結果

4.4.1 黃芪有效成分及靶點

通過TCMSP數據庫檢索，并根據OB≥30%、DL≥0.18篩選，得到黃芪有效成分6個，見表4。通過SwissTargetPrediction數據庫檢索6個有效成分對應的靶點信息，剔除重復靶點后，得到127個靶點。

表4 黃芪有效成分信息（OB≥30%、DL≥0.18）

4.4.2 糖尿病視網膜病變相關靶點及交集靶點

在OMIM、GAD、TTD 3個數據庫檢索DR相關靶點，剔除重復靶點后，共獲得650個靶點。采用Venny 2.1將有效成分靶點與DR相關靶點取交集，共獲得58個交集靶點，韋恩圖見圖3。

圖3 黃芪治療DR相關靶點韋恩圖

4.4.3 蛋白相互作用網絡與核心靶點

將58個交集靶點導入STRING數據庫，得到PPI網絡（見圖4）。該網絡由58個節點、30條邊構成，平均節點數10.6。節點數靠前的靶點包括MMP2、GSK3B、EGFR、IL2、PPARG等。

圖4 黃芪治療DR靶點PPI網絡

4.4.4 GO功能和KEGG通路富集分析

將58個交集靶點導入DAVID數據庫進行GO富集分析，以P<0.01為篩選條件，選取前20條基因信息繪制條圖（見圖5）。對交集靶點進行KEGG通路富集分析，共獲得81條通路富集結果。根據P值由小到大選取前20條通路繪制氣泡圖（見圖6）。

圖5 黃芪治療DR靶點GO富集分析

圖6 黃芪治療DR靶點KEGG通路富集分析

4.5 黃芪對模型小鼠視網膜組織基質金屬蛋白酶2、糖原合成酶激酶-3β蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠視網膜組織MMP2、GSK-3β蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪組小鼠視網膜組織MMP2、GSK-3β蛋白表達明顯降低（P<0.05）。結果見圖7、圖8、表5。

圖7 各組小鼠視網膜組織MMP2蛋白表達（免疫熒光染色，×400）

圖8 各組小鼠視網膜組織GSK-3β蛋白表達（免疫熒光染色，×400）

表5 各組小鼠視網膜組織MMP2、GSK-3β蛋白表達比較（±s）

表5 各組小鼠視網膜組織MMP2、GSK-3β蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常組模型組黃芪組只數6 6 4 MMP2 0.037 5±0.004 0.049 5±0.003*0.038 0±0.001#GSK-3β 0.037 5±0.004 0.045 1±0.002*0.037 7±0.001#

5 討論

DR屬中醫學“消渴目病”范疇[14]。劉完素指出，消渴可“變為雀目或內障”（《宣明論方·消渴總論》），《證治要訣》有“三清久之，精血既虧，或目無視”。其基本病機為本虛標實，以氣陰兩虛為本，瘀血阻絡為標，臨床上多用益氣養陰、活血化瘀法治療，效果顯著[15-16]。黃芪是臨床常用補氣藥，具有補氣升陽、生津養血等功效，對糖尿病及DR有一定作用。

CD105是細胞表面跨膜糖蛋白，在增殖的內皮細胞上表達[17]。有研究表明，CD105可參與血管發育，是新生血管形成的主要標志物[18]。新血管生成是DR的臨床特征之一，在DR的各階段，患者血漿CD105水平均明顯升高[19]。通過玻璃體注射DL-α-氨基己二酸建立視網膜新生血管疾病模型發現，模型組視網膜CD105表達較正常組明顯升高[20]。本研究采用免疫熒光染色檢測DR小鼠視網膜組織CD105表達，結果表明，模型組小鼠視網膜組織CD105蛋白表達較正常組明顯升高，黃芪組小鼠視網膜組織CD105蛋白表達較模型組明顯降低，說明黃芪能抑制新血管生成。

DR早期特征為血-視網膜屏障破壞，這與內皮細胞緊密連接結構破壞密切相關。MMP2是MMPs家族的一員[21]，由內皮細胞分泌[22]，并通過調節細胞外基質Ⅳ型膠原以平衡基質合成與降解，進而在維持細胞完整性和細胞存活之間發揮關鍵作用[23]。研究表明，抑制MMP2過表達可抑制視網膜毛細血管內皮細胞凋亡[24]。在DR晚期階段，MMP2能促進新生血管生成[25]，與非糖尿病組比較，患病12周的糖尿病大鼠視網膜MMP2 mRNA水平顯著升高[26]。本研究采用網絡藥理學分析發現，黃芪多個有效成分對應靶點MMP2，采用免疫熒光染色進一步驗證，結果表明，模型組小鼠視網膜組織MMP2表達較正常組明顯升高，黃芪組小鼠視網膜組織MMP2表達較模型組明顯降低，說明黃芪可能通過抑制MMP2表達抑制新血管生成。

DR發病機制與炎癥密切相關，GSK-3β被認為是治療炎癥相關疾病的潛在靶點[27]。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、凋亡、信號傳導中發揮重要作用[28]，其能夠調節視網膜內皮細胞黏附分子的表達和細胞周期，進一步導致DR內皮功能障礙及血-視網膜屏障破壞[29]。在STZ誘導的糖尿病小鼠模型中，模型組視網膜組織GSK-3β表達顯著升高[30]。本研究網絡藥理學結果表明，黃芪可調控GSK-3β，并且免疫熒光結果表明，黃芪能下調DR模型小鼠視網膜組織GSK-3β表達，提示黃芪可能通過GSK-3β改善小鼠DR。

綜上所述，黃芪對DR有明顯改善作用，其機制可能與下調CD105、MMP2、GSK-3β表達，進而抑制新血管生成有關。本研究初步探討了黃芪防治DR的作用機制，可為臨床應用黃芪治療DR提供實驗依據，但未考察不同劑量黃芪的作用效果，今后研究將進一步明確其量效關系。