電針大鼠血清對氧糖剝奪誘導的海馬神經元鐵死亡的影響

李笑笑 ，李姝潔 ，董健健 ，韓永升，

1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012； 2.安徽中醫藥大學神經病學研究所，安徽 合肥 230038；3.安徽省中西醫結合醫院，安徽 合肥 230031

卒中是世界第二大死亡原因，也是全球致殘的主要原因。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是卒中最常見的類型[1-2]，由血管阻塞導致大腦特定區域血液供應減少引起。電針將傳統針刺與生物電刺激相結合，基礎和臨床研究均表明電針可通過多途徑、多靶點治療IS[3-6]。針刺血清是針刺治療后產生的效應物質，有類似于針刺治療的效應，具有抑制神經元Ca2+超載、促進神經干細胞增殖與分化、上調神經元內質網活性、提高海馬神經元突觸可塑性、減輕神經元損傷等作用[7-10]。

鐵死亡是細胞內鐵和脂質活性氧累積，導致細胞氧化應激損傷和死亡的特殊死亡形式[11]。越來越多的證據表明，鐵死亡是IS病理性細胞死亡的重要機制，鐵死亡促進IS的發生，引起腦組織結構和功能損傷，而抑制鐵死亡可以顯著降低IS嚴重程度并促進腦功能恢復[12-13]。

課題組前期研究發現，電針對IS模型大鼠神經血管單元（NVU）具有保護作用，且電針血清干預可減輕氧糖剝奪/復糖復氧（OGD/R）誘導的神經元損傷，而該作用與激活Wnt/β-catenin信號通路密切相關[14-15]。同時發現，電針通過抑制鐵死亡對IS模型大鼠發揮神經保護作用[16]。為進一步探究電針對IS鐵死亡的抑制作用及可能機制，本研究利用OGD/R方法構建海馬神經元體外缺血損傷模型，并予電針大鼠血清干預，觀察電針血清對海馬神經元OGD/R損傷及鐵死亡的影響，為電針治療IS提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞

SPF級健康雄性SD大鼠30只，2～3月齡，體質量250～300 g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號SCXK（魯）2019-0003。飼養溫度24～26 ℃，相對濕度50%～60%，12 h光照，自由攝食飲水。HT-22細胞，購自中國科學院上海細胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基（批號8120475），美國Gibco公司；胎牛血清（批號20210506），天津康源；CCK8試劑盒（批號CK04），上海東仁化學科技有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒（批號CA1410），索萊寶科技有限公司；長鏈脂酰輔酶A合成酶4（ACSL4）抗體（批號384265）、Wnt1多克隆抗體（批號251822），成都正能生物；β-連環蛋白（β-catenin）多克隆抗體（批號8480），美國CST公司；谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）抗體（批號GB113745），武漢賽維爾生物；糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）抗體（批號ab32391）、軸蛋白2（Axin2）抗體（批號ab109307）、運鐵蛋白（Tf）抗體（批號ab82411），英國Abcam公司。

生物安全柜（BSC-1300ⅡA2），蘇州安泰空氣技術有限公司；CO2培養箱（GOLD-SIM W200IR），美國SIM公司；熒光倒置相差顯微鏡（CKX41），日本Olympus公司；全波長酶標儀（Epoch2），美國Biotek公司；電泳儀（Powerpac Basic），美國伯樂公司；電針儀（G6805-2A），上海華誼醫用儀器有限公司；一次性無菌針灸針（13 mm×0.18 mm），吳江云龍醫療器械有限公司。

2 實驗方法

2.1 血清制備

參照前期研究[15]方法制備對照大鼠血清和電針大鼠血清，0.22 μm過濾器過濾，分裝，56 ℃滅活30 min，-20 ℃冰箱保存備用。

2.2 分組、造模及干預

將HT-22細胞分為對照組、模型組和電針血清組。對照組先以15%對照大鼠血清置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，后更換為無血清、含糖培養基繼續培養；模型組先以15%對照大鼠血清正常培養24 h，再以無血清、無糖培養基置于37 ℃、5%CO2、1%O2和94%N2混合氣體培養箱中培養2 h，后以無血清、含糖培養基置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h建立OGD/R模型；電針血清組先以15%電針大鼠血清正常培養24 h，再按模型組方法進行處理。

2.3 CCK8法檢測細胞存活率

取對數生長期細胞，以每孔1×105個細胞接種至96孔板，每孔100 μL，按“2.2”項下方法分組處理，每組6個復孔，另設空白組（不接種細胞僅加入培養基）。干預結束后，每孔加入10 μL CCK8溶液，于37 ℃培養箱中孵育1.5 h，各組分別吸取100 μL培養液于96孔板中，酶標儀波長450 nm測定吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（電針血清組-空白組）÷（對照組-空白組）×100%。

2.4 活性氧含量檢測

取對數生長期細胞，將細胞接種至放有細胞爬片的6孔板中，調整細胞密度為3×105個/孔，并按“2.2”項下方法進行分組干預。干預結束后，吸去培養液，每孔加入1 mL稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，棄去液體，以無血清培養基洗滌細胞3次，細胞爬片滴加DAPI染色劑，室溫避光孵育8～10 min，PBS漂洗3次，使用抗熒光淬滅封片劑進行封片，熒光顯微鏡下觀察，使用Image J軟件分析平均熒光強度。

2.5 Western blot檢測

干預結束后，收集各組細胞，分別加入PMSF和RIPA裂解液吹打混合，冰浴搖床上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱8 min，-80 ℃冰箱保存備用。以12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移到NC膜上，快速封閉液搖床常溫封閉20 min，加入β-actin、ACSL4、 Tf、 GPX4、 Wnt1、 β -catenin、 Axin2、GSK-3β一抗（均為1∶1 000），室溫搖床孵育4 h，PBST洗膜3次，加二抗（1∶10 000），室溫搖床孵育1.5 h，使用ECL發光試劑進行曝光，Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）灰度值比值計算蛋白相對表達量。

3 統計學方法

采用SPSS23.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 電針血清對HT-22細胞存活率的影響

與對照組比較，模型組HT-22細胞存活率顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，電針血清組HT-22細胞存活率顯著升高（P<0.01）。見表1。

表1 各組HT-22細胞存活率比較（±s，%）

表1 各組HT-22細胞存活率比較（±s，%）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針血清組n 6 6 6存活率100.00± 5.37 56.04± 6.81**71.87±10.05##

4.2 電針血清對HT-22細胞活性氧含量的影響

與對照組比較，模型組HT-22細胞ROS含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，電針血清組HT-22細胞ROS含量顯著減少（P<0.01）。見表2。

表2 各組HT-22細胞ROS含量比較（±s，平均熒光強度）

表2 各組HT-22細胞ROS含量比較（±s，平均熒光強度）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針血清組n 3 3 3 ROS 2.04±0.37 44.59±2.47**17.59±2.08##

4.3 電針血清對HT-22細胞鐵死亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組HT-22細胞ACSL4、Tf蛋白表達升高，GPX4蛋白表達降低，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，電針血清組HT-22細胞ACSL4、Tf蛋白表達降低，GPX4蛋白表達升高，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖1、表3。

圖1 各組HT-22細胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白免疫印跡

表3 各組HT-22細胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白表達比較（±s）

表3 各組HT-22細胞ACSL4、Tf、GPX4蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針血清組n 3 3 3 ACSL4 0.141±0.003 0.316±0.002**0.096±0.003##Tf 0.635±0.006 0.665±0.004**0.383±0.002##GPX4 1.021±0.013 0.500±0.009**0.643±0.001##

4.4 電針血清對HT-22細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組HT-22細胞Wnt1、β-catenin蛋白表達顯著降低，Axin2、GSK-3β蛋白表達顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，電針血清組HT-22細胞Wnt1、β-catenin蛋白表達顯著升高，Axin2、GSK-3β蛋白表達顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。見表4、圖2。

圖2 各組HT-22細胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白免疫印跡

表4 各組HT-22細胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白表達比較（±s）

表4 各組HT-22細胞Wnt1、β-catenin、Axin2、GSK-3β蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針血清組n 3 3 3 Wnt1 0.639±0.015 0.524±0.008**0.612±0.010##β-catenin 1.024±0.028 0.846±0.014**0.986±0.033##Axin2 0.649±0.012 0.878±0.013**0.662±0.020##GSK-3β 0.633±0.017 0.787±0.018**0.599±0.021##

5 討論

研究發現，以鐵超載、谷胱甘肽（GSH）消耗和GPX4失活、脂質過氧化、Xc-系統損傷及線粒體膜密度增加、嵴破裂或消失等為特征的鐵死亡在IS發生發展中具有重要作用[17]。大腦中動脈閉塞（MCAO）模型大鼠大腦皮質出現鐵和ROS沉積，血清脂質過氧化水平明顯升高，并伴有鐵死亡相關蛋白表達異常[18]。OGD/R能顯著增加神經元內鐵和ROS含量，線粒體出現膜密度增加和嵴減少[19]，而應用鐵死亡抑制劑如Liproxstatin-1可顯著減少鐵沉積和ROS生成，降低脂質過氧化水平，保護OGD/R誘導的神經元損傷，促進MCAO大鼠神經功能恢復[20]。臨床應用去鐵胺能降低急性IS患者體內鐵含量和運鐵蛋白飽和度，減輕神經損傷，改善預后[21]。

ROS累積是鐵死亡的標志之一，鐵死亡抑制劑和各種抗氧化劑或ROS清除劑都可以抑制ROS累積和細胞鐵死亡[22]。相關研究發現，OGD/R誘導神經元內鐵和ROS沉積，介導細胞鐵死亡[20，23-24]。本實驗及前期研究結果[14]顯示，OGD/R后神經元內ROS水平升高、丙二醛（MDA）含量增加、超氧化物歧化酶（SOD）活性減弱，提示OGD/R誘導神經元內ROS生成和氧化應激發生。在電針大鼠血清干預下，ROS水平降低，MDA含量減少、SOD活性增強，提示電針大鼠血清能抑制ROS產生，減輕氧化損傷。

ACSL4和GPX4被認為是鐵死亡的正、負調節因子。ACSL4是多不飽和脂肪酸（PUFA）代謝的同工酶[25]，通過催化PUFA乙?；?，產生脂質過氧化物，導致鐵死亡[26]。ACSL4過表達促進鐵死亡的發生，而抑制ACSL4可減輕鐵死亡[27-28]。GPX4是一種硒過氧化物酶，利用GSH作為輔助因子，將有毒的脂質氫過氧化物轉化為無毒的脂質醇，以維持細胞氧化還原穩態[29]，通過調節脂質過氧化抑制細胞鐵死亡。Tf是血清中的一種鐵載體蛋白，通過轉鐵蛋白受體介導的內吞作用將鐵轉運到細胞中[30]，Tf的激活促進鐵死亡發生[31]。本實驗發現，OGD/R誘導HT-22細胞ACSL4、Tf蛋白表達升高，GPX4蛋白表達降低，結合ROS含量增加和細胞存活率降低，提示OGD/R能誘導神經元鐵死亡。電針血清干預后，HT-22細胞ACSL4、Tf蛋白表達降低，GPX4蛋白表達升高，并伴有ROS含量減少和細胞存活率升高，提示電針血清對OGD/R誘導的神經元鐵死亡具有抑制作用。

Wnt信號通路是一條進化上保守的細胞間信息傳遞通路，與胚胎發生和干細胞更新，細胞增殖、分化等緊密相關。課題組前期研究發現，電針可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，有效保護MCAO大鼠NVU[14]。本研究也發現，在電針大鼠血清干預后，HT-22細胞Wnt1、β-catenin蛋白表達上調，Axin2、GSK-3β蛋白表達下調，提示電針大鼠血清可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制神經元鐵死亡。

綜上所述，電針大鼠血清對OGD/R誘導的海馬神經元損傷的保護作用可能與激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制細胞鐵死亡相關。