淫羊藿苷對環磷酰胺致小鼠卵巢早衰的影響

薛美昭 ，趙均

1.山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619；2.山西白求恩醫院，同濟山西醫院，山西 太原 030032

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40歲前因卵巢功能衰竭而出現月經稀少或閉經4個月以上的婦科內分泌疾病，以閉經、雌激素缺乏、促卵泡激素（FSH）水平升高為主要表現，常伴有出汗、焦慮、抑郁、記憶力減退等癥狀[1]。POF病因復雜，目前已知的致病因素包括染色體異常、自身免疫性疾病、病毒感染等[2]。環磷酰胺是臨床常用的烷化劑類化療藥物，其毒性可造成細胞DNA斷裂，導致DNA、RNA及蛋白質合成受阻。卵巢是環磷酰胺生殖毒性的主要靶器官，研究表明，卵巢對化療毒性非常敏感，化療藥物引發的POF占患病總人數的25%以上，許多化療患者卵巢功能受到嚴重損傷，導致絕經期提前，卵巢功能紊亂，甚至不育[3]。

中醫學認為，腎虛是POF發生的根本原因，沖任不調為POF發病關鍵因素[4]，因此常采用補腎法調節激素水平，改善POF臨床癥狀[5]。淫羊藿為補腎助陽之要藥，在治療閉經、不孕、POF等卵巢功能失調性疾病方面有顯著療效[6]。淫羊藿苷是淫羊藿的有效成分之一，對生殖系統具有較好的保護作用[7]。本研究以環磷酰胺誘導小鼠POF模型，觀察淫羊藿苷對模型小鼠血清性激素水平、卵巢病理形態及卵巢組織基因表達的影響，揭示淫羊藿苷治療POF的作用機制，為中藥防治POF提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雌性C57BL/6小鼠30只，6周齡，體質量（18±1）g，購于山西醫科大學動物實驗中心，飼養于該動物中心屏障動物房，溫度（25±2）℃，濕度（55±2）%，光暗循環12 h，自由進食飲水。本研究經山西中醫藥大學醫學倫理委員會批準（2019LL197）。

1.2 主要試劑與儀器

淫羊藿苷（貨號I8760，北京索萊寶），環磷酰胺（貨號C0768，德國Sigma），小鼠雌二醇（E2）ELISA試劑盒（貨號E-EL-0150c，武漢Elabscience），FSH ELISA試劑盒（貨號E-EL-M0511c，武漢Elabscience），多聚甲醛（貨號P1110，北京索萊寶），HE染色試劑盒（貨號G1120，北京索萊寶），Trizol（貨號DP424，北京天根），Rnase-free water（貨號R1600，北京索萊寶），反轉錄試劑盒（貨號AG11728，湖南艾科瑞生物），PCR檢測試劑盒（貨號Q711-03，南京諾唯贊）。臺式高速冷凍離心機（型號H1650R，湖南賽特湘儀），酶標儀（型號Elx800，美國Bio-Tek），電泳儀（型號DYY-6C，北京六一儀器），凝膠成像儀（型號ChemiDocXRS+，美國Bio-Rad），核酸蛋白檢測儀（型號BioPhotometer D30，德國Eppendorf），熒光定量PCR儀（型號QuantStudio 7 Flex，美國ABI）。

1.3 分組、造模及給藥

小鼠適應性飼養1周后行陰道涂片，將30只動情周期正常的小鼠隨機分為對照組、模型組和淫羊藿苷組，每組10只。模型組和淫羊藿苷組腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg制備POF小鼠模型，1次/d，連續14 d，對照組注射等量生理鹽水。造模結束后次日，淫羊藿苷組予淫羊藿苷溶液（用生理鹽水制備成濃度為1 g/L溶液）25 mg/kg灌胃，1次/d，連續28 d。對照組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.4 一般狀況觀察

造模和給藥過程中，觀察小鼠活動情況、精神狀態、皮毛光澤度、對外界反應的靈敏度、進食量等情況，每周稱量并記錄小鼠體質量變化。

1.5 ELISA檢測

分別于造模及干預結束后，摘眼球取血，血液室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，ELISA檢測血清E2和FSH含量。

1.6 卵巢組織病理觀察

干預結束后，頸椎脫臼處死小鼠，取雙側卵巢，剝離周圍脂肪組織，稱量卵巢質量。將一側卵巢用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，并進行HE染色。光學顯微鏡下觀察卵巢組織形態，并對各級卵泡數量進行統計。

1.7 卵巢組織mRNA轉錄組分析

取另一側卵巢，分別放入標記好的凍存管中，迅速置于液氮中凍存。采用Trizol法提取總RNA，檢測RNA完整性、濃度及純度，質控合格后送至北京諾禾致源科技股份有限公司，利用Illumina測序平臺進行高通量測序及生物信息學分析。

1.8 RT-qPCR驗證差異表達mRNA

質檢合格的總RNA反轉錄合成cDNA，PCR條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料以±SE表示，組間比較用方差分析，方差齊用Duncan檢驗，方差不齊用多重比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 淫羊藿苷對模型小鼠一般狀況的影響

對照組小鼠精神狀態良好，活動敏捷，皮毛光滑，反應靈敏；模型組小鼠隨造模時間延長，進食量逐漸減少，形體消瘦，反應遲鈍，皮毛黯淡，體質量較對照組減輕；淫羊藿苷組小鼠進食量增加，反應較敏捷，皮毛稍有光澤，體質量較模型組增加。

2.2 淫羊藿苷對模型小鼠血清雌二醇、促卵泡激素含量的影響

與對照組同一時點比較，模型組和淫羊藿苷組小鼠14 d血清E2含量顯著減少，FSH含量顯著增加（P<0.05），模型組小鼠42 d血清E2含量顯著減少，FSH含量顯著增加（P<0.05）；與模型組同一時點比較，淫羊藿苷組小鼠42 d血清E2含量顯著增加，FSH含量顯著減少（P<0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠血清E2和FSH含量比較（±SE）

表2 各組小鼠血清E2和FSH含量比較（±SE）

注：與同一時點對照組比較，*P<0.05；與同一時點模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組淫羊藿苷組只數10 10 10 E2/（pg/mL）14 d 52.57±1.76 30.89±2.14*32.67±1.07*42 d 54.25±1.65 29.21±1.78*48.11±1.56*#FSH/（ng/mL）14 d 3.08±0.11 4.68±0.58*4.73±0.52*42 d 3.17±0.12 4.70±0.57*3.31±0.60#

2.3 淫羊藿苷對模型小鼠卵巢質量及病理形態的影響

與對照組比較，模型組小鼠卵巢質量顯著減少（P<0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠卵巢質量顯著增加（P<0.05）。結果見表3。

表3 各組小鼠卵巢質量比較（±SE，mg）

表3 各組小鼠卵巢質量比較（±SE，mg）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組淫羊藿苷組只數10 10 10卵巢質量12.2±2.1 7.3±1.7*11.6±1.9#

HE染色顯示，對照組小鼠卵泡發育正常、生長活躍，可見各級卵泡，卵泡液豐富，顆粒細胞層次多；模型組小鼠各級卵泡數目減少，顆粒細胞層次少，卵巢明顯萎縮；淫羊藿苷組小鼠顆粒細胞層次增加，各級卵泡數量較模型組明顯增多。見圖1。

圖1 各組小鼠卵巢組織形態（HE染色，×40）

與對照組比較，模型組小鼠原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡數量均顯著減少（P<0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠原始卵泡、初級卵泡和成熟卵泡數量均顯著增加（P<0.05）。結果見表4。

表4 各組小鼠各級卵泡數比較（±SE，個）

表4 各組小鼠各級卵泡數比較（±SE，個）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組淫羊藿苷組只數10 10 10原始卵泡280.0±19.9 183.7±10.5*213.3± 9.8#初級卵泡147.0±12.1 67.0±12.3*110.0± 9.6#次級卵泡72.0±7.6 35.3±6.3*50.7±4.3成熟卵泡65.3±7.2 31.3±1.9*46.7±8.4#

2.4 淫羊藿苷對模型小鼠基因轉錄組的影響及差異基因RT-qPCR驗證

對模型組/對照組、淫羊藿苷組/模型組卵巢組織基因表達進行分析，以|log2模型組/對照組|≥1為篩選條件，結合P<0.05，共篩選出8個與卵巢組織功能相關的基因。與對照組比較，模型組小鼠卵巢組織Mafg、Gcnt3基因表達上調，Oas1h、Smc1b、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表達下調（P<0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠卵巢組織上述基因表達顯著逆轉（P<0.05）。結果見表5。

表5 各組小鼠卵巢組織差異表達基因篩選結果

基于轉錄組分析結果，選擇5個基因（Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP）通過RT-qPCR進行驗證，驗證結果與高通量測序結果一致。結果見表6。

表6 各組小鼠卵巢組織Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表達比較（±SE）

表6 各組小鼠卵巢組織Gcnt3、Mov10l1、Oosp2、Tbpl2和DynAP基因表達比較（±SE）

注：與模型組/對照組比較，*P<0.05

基因名稱Gcnt3 Mov10l1 Oosp2 Tbpl2 DynAP模型組/對照組10.82±0.85 0.05±0.00 0.24±0.01 0.19±0.03 0.12±0.00淫羊藿苷組/模型組0.42±0.01*4.31±0.04*2.28±0.07*2.51±0.39*3.38±0.24*

3 討論

根據POF發病特點，可將其歸中醫學“血枯”“不孕”“經水早斷”等范疇，相似證治散見于“閉經”“經水不通”“月經后期”等[8]。腎藏精，主生長、發育與生殖。腎中精氣充盛，天癸成熟，月經來潮，標志著女性卵巢生殖周期活動開始；腎中精氣衰退，天癸耗竭，月經閉絕，提示女性卵巢生殖功能結束。POF病機多為腎中精血不足，陰陽失調，命門火衰所致。中醫采用補腎法治療POF，可有效改善和恢復卵巢功能[5]。藥理研究表明，淫羊藿中的黃酮類化合物作為其最主要的有效成分，具有多種生物活性[9]，其中，淫羊藿苷占比較大。多項研究表明，淫羊藿苷可增加堿性磷酸酶活性，降低抗酒石酸酸性磷酸酶活性，刺激E2產生；淫羊藿苷可調節下丘腦-垂體-卵巢軸功能，已被廣泛應用于月經不調、POF等疾病的治療中[10]。

環磷酰胺對卵巢具有較強的毒副作用。本實驗利用環磷酰胺建立POF小鼠模型，與對照組比較，模型組小鼠卵巢質量顯著下降，血清E2含量顯著減少，FSH含量顯著增加，同時卵巢組織各級卵泡數量顯著減少，表明環磷酰胺能夠破壞小鼠卵巢結構，降低卵巢儲備功能。而使用淫羊藿苷治療后，小鼠卵巢質量顯著增加，E2含量顯著增加，FSH含量顯著減少，原始卵泡、初級卵泡和成熟卵泡數量均顯著增加。表明淫羊藿苷通過降低模型小鼠血清FSH水平、提高E2水平，增加大鼠卵巢質量和卵泡數量，從而增強卵巢儲備功能，對環磷酰胺所致小鼠POF有明顯緩解作用。

對各組小鼠卵巢組織基因表達譜進行對比分析發現，表達水平顯著改變的均是參與編碼生殖細胞發生和生長關鍵蛋白質和細胞因子的基因。Mafg是編碼含亮氨酸拉鏈的轉錄因子，該基因在致癌因子等刺激下高表達，進而促進細胞惡化并縮短存活時間[11]。Gcnt3編碼黏連蛋白合酶，在受到病毒等外界刺激后能夠通過ERK信號通路促進細胞惡性增殖和遷移[12]。本實驗中，Mafg和Gcnt3基因在模型組小鼠卵巢組織表達顯著上調，推測卵巢組織受到環磷酰胺刺激后細胞的惡化進程加快，與文獻結果[11-12]一致。而淫羊藿苷干預后，Mafg和Gcnt3基因表達均有所下降。Oas1h基因編碼寡聚核苷酸合成酶，參與細胞因子TNF/NF-κB信號通路，調控生殖細胞對病毒感染的免疫反應[13]。Smc1b基因編碼減數分裂相關的黏連蛋白，調控姐妹染色單體配對及阻止端?？s短，從而維持基因組的穩定性[14]。Mov10l1基因編碼RNA解旋酶，屬于卵巢細胞的特定表達酶，參與調控卵巢發育和配子形成過程[15]。Oosp2基因編碼與透明帶相關的結構蛋白，在女性生育力進程中起關鍵作用，該基因缺失表現為生育力降低[16]。Tbpl2基因編碼與TATA結合的轉錄因子，該蛋白與TFⅡA形成復合體調控與卵母細胞生長相關基因的表達[17]。DynAP基因編碼一種定位于高爾基體脂膜的跨膜蛋白，能夠激活AKT信號通路，促進細胞增殖，當細胞中缺失DynAP基因時則會誘導細胞凋亡[18]。上述6個基因在模型組小鼠卵巢組織表達顯著下調，表明卵巢細胞受到環磷酰胺刺激后對外部刺激的免疫反應、基因組的穩定性、生殖細胞分裂與增殖能力均受到嚴重損傷。淫羊藿苷干預后，以上基因表達水平明顯恢復，表明淫羊藿苷對環磷酰胺造成的卵巢損傷有明顯的治療作用。

綜上所述，淫羊藿苷可通過調控編碼卵巢細胞發生和生長相關蛋白質和細胞因子的基因表達，升高血清E2并降低FSH激素水平，增加卵巢質量，增加原始卵泡、初級卵泡和成熟卵泡數量，進而對POF起到治療作用。