根結(jié)線蟲危害與健康黃瓜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析

楊學(xué)瑾 周媛媛 彭欣怡 劉建鳳 張愛民 井愛芹 趙鋼勇 曹丹丹

摘要：為探明黃瓜根結(jié)線蟲病與根際土壤微生物群落的關(guān)系，通過高通量測序分析對比了受根結(jié)線蟲危害和健康黃瓜根系的根表土和根圍土中微生物群落結(jié)構(gòu)組成及豐富度的差異。結(jié)果表明，健康黃瓜根表土、健康黃瓜根圍土、病害黃瓜根表土和病害黃瓜根圍土4組土壤樣品之間微生物Alpha多樣性無顯著差異，但Beta多樣性在各組間差異顯著。在門水平上，各組間細(xì)菌和真菌群落組成相似，但擬桿菌門（Bacteroidetes）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在各組的相對豐度存在顯著差異，其中擬桿菌門在病害黃瓜根表土（13.58%）、擔(dān)子菌門在健康黃瓜根表土（6.69%）中的相對豐度較高。在屬水平上，各組間細(xì)菌和真菌的組成也基本一致，細(xì)菌中黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、劍菌屬（Ensifer）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）和噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）在不同組中的相對豐度存在顯著差異，且均在病害黃瓜根表土中的相對豐度最高，分別為3.62%、2.58%、1.93%、2.34%、1.14%、1.60%、1.30%、1.13%和1.59%；而黃色類固醇桿菌屬（Steroidobacter）在健康黃瓜根表土中的相對豐度最高，為1.50%；真菌中假埃希氏菌屬（Pseudallescheria）、毛殼菌屬（Chaetomium）在健康黃瓜根圍土中的相對豐度最高，分別為13.73%、11.00%；漆斑菌屬（Myrothecium）在健康黃瓜根表土中的相對豐度最高，為7.51%；綠僵菌屬（Metarhizium）在病害黃瓜根圍土中的相對豐度較高，為3.99%；棒孢菌屬（Corynespora）在病害黃瓜根表土中的相對豐度較高，為2.64%。研究結(jié)果為通過調(diào)控植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)防治根結(jié)線蟲提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲??；根際土；微生物多樣性；黃瓜doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0840

中圖分類號：S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2023）01010910

蔬菜根結(jié)線蟲?。╮oot-knot nematode disease）已成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中僅次于真菌病害的第二大類病害，由植物寄生性根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）引起[1]。根結(jié)線蟲主要侵害植物的根系，并在其內(nèi)部形成復(fù)雜的取食位點(diǎn)，嚴(yán)重影響植物正常的水分和養(yǎng)分吸收運(yùn)輸?shù)壬泶x功能[23]。每年因根結(jié)線蟲侵染可造成蔬菜減產(chǎn)30%，因此導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億元以上[4]。在植物根際篩選具有抑殺功能的有效微生物是目前生物防治根結(jié)線蟲的重要手段。

在根際微生態(tài)系統(tǒng)中，由于植物根系分泌物以及代謝后組織成分的存在使得植物根際塑造出不同于周圍土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，這些根際微生物在促進(jìn)植物生長以及生物地球化學(xué)循環(huán)方面起著重要作用[5-7]。研究表明，根際土壤微生物群落水平上的構(gòu)成特性能夠成為植物宿主免受病原物侵染的第一道免疫防線[89]。若植株感染病害，則表明原本的根際微生物群落生態(tài)平衡被打破[10]，如受疫霉菌感染患晚疫病的馬鈴薯根際土壤中細(xì)菌的多樣性及豐度發(fā)生了改變[11]；由尖孢鐮刀菌草莓?；筒≡鸬牟葺菸∫矔?dǎo)致根際基質(zhì)中真菌組成發(fā)生變化[12]。根結(jié)線蟲病對煙草[13]、大豆[14]、茄子、番茄、苦瓜和黃瓜[15]根際微生物群落影響的研究相繼被報道，但植物種類、地區(qū)氣候、土壤理化性質(zhì)和種植管理措施等均會影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成。因此，充分了解病害發(fā)生的作物根際微生物群落特征，有利于有針對性地改善根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)而有效防控根結(jié)線蟲，促進(jìn)植物健康生長。

山東省壽光市是我國重要的蔬菜生產(chǎn)基地，被譽(yù)為“中國蔬菜之鄉(xiāng)”。其蔬菜生產(chǎn)遭受根結(jié)線蟲危害嚴(yán)重[16]，因此，本研究通過高通量測序技術(shù)對該地區(qū)設(shè)施大棚中感病植株和健康植株的根表土和根圍土中細(xì)菌、真菌的生物群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在明確根結(jié)線蟲危害對黃瓜根際微生物種類和豐度的影響，為改善作物根際土壤微生態(tài)環(huán)境以及研發(fā)環(huán)境友好型高效抑殺線菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

取樣地位于山東省壽光市孫集鎮(zhèn)南胡村的黃瓜種植大棚（36°50′18.7″N、 118°43′22.7″E，海拔32 m）。樣地土壤pH 7.2，土壤有效氮、磷、鉀含量分別為26.0、49.2 和108.3 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量2.0%。黃瓜品種為津美85，嫁接砧木品種為白子瓜。于2020年7月黃瓜采收中后期，在同一大棚內(nèi)采用平行線取樣法選取受根結(jié)線蟲危害嚴(yán)重（圖1A）和未受危害的黃瓜根系（圖1B）各9株，每3株混合成1個樣本作為1個重復(fù)，每組3個重復(fù)。樣品植株去除地上部分和根部大塊土壤后，將分離的根圍土（貼近根的輕微抖動能從根上脫落的土層）和根表土（貼附在根的表面上用無菌毛刷輕輕掃落的土層）分別過60目篩網(wǎng)，共得到4組樣本，分別記作健康黃瓜根表土（JGB）、健康黃瓜根圍土（JGW）、病害黃瓜根表土（BGB）和病害黃瓜根圍土（BGW）。將獲得的土壤樣品及時裝入無菌離心管內(nèi)用液氮速凍，加干冰低溫運(yùn)送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.2 土壤微生物高通量測序

采用DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.? Soil DNAKit）抽提樣本中微生物群落總DNA，使用微量分光光度計(jì)以及1%瓊脂糖凝膠電泳（電壓5 V·cm-1，時間20 min）對提取DNA的純度、濃度和完整性進(jìn)行檢測。分別使用引物338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3）/806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）和ITS1F（5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）/ITS2R（5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)和真菌的ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol·L-1）0.8 μL，下游引物（5 μmol·L-1）0.8 μL， TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR 程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27個循環(huán)；72 ℃ 10 min；最后擴(kuò)增產(chǎn)物在4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化、微型熒光計(jì)定量與按照相應(yīng)比例混合均一化后，使用建庫試劑盒（NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit）構(gòu)建文庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺對構(gòu)建的文庫進(jìn)行相對定量測序。

1.3 土壤微生物DNA 序列的優(yōu)化和聚類

使用Fastp 軟件（version 0.19.6）和Flash 軟件（version 1.2.11）對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控、過濾、拼接，最終得到優(yōu)化序列。使用Uparse 軟件（version 7.0.1090）去除優(yōu)化序列中沒有重復(fù)的單序列，提取優(yōu)化序列中的非重復(fù)序列，并按照97%的相似性將其進(jìn)行可操作分類單元（operationaltaxonomic unit，OTU）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.4 土壤微生物多樣性組成及差異性分析

基于最小樣本序列數(shù)對OTU抽平，利用RDPclassifier 軟件（version 2.11）通過比對Silva16S rRNA 數(shù)據(jù)庫和Unite數(shù)據(jù)庫，對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，設(shè)置比對閾值為70%，分別在門和屬水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的微生物群落組成。使用Mothur 軟件（version 1.30.2）計(jì)算Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)。使用R 語言（version 3.3.1）進(jìn)行Beta 多樣性分析，基于bray_curtis 距離計(jì)算距離矩陣，使用PCoA進(jìn)行可視化展示。調(diào)用R語言中的stats包和Python語言中的scipy包分析不同組微生物群落組成及豐度差異。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 26.0 軟件和R語言（version 3.3.1）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)法和Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)法檢驗(yàn)組間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜根際土壤微生物高通量測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

將細(xì)菌原始測序序列進(jìn)行優(yōu)化后共得到500 450條序列，平均序列長度為436.98 bp，通過聚類分析得到2 037 個OUT，物種注釋到35 門、78綱、158目、302科、565屬、1 060種。樣品土壤真菌測序序列優(yōu)化后共得到781 135條序列，平均序列長度為262.69 bp，聚類分析得到689個OUT，物種注釋到6 門、17 綱、46 目、99 科、189 屬、301種。

2.2 根結(jié)線蟲危害黃瓜與健康黃瓜根際土壤微生物群落Alpha 多樣性差異

Alpha 多樣性分析結(jié)果（表1）表明，JGB 和JGW樣品中細(xì)菌和真菌的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于BGB 和BGW 樣品，表明JGB 和JGW 中微生物的豐度及多樣性高于BGB和BGW，但差異均未達(dá)到顯著水平。

2.3 根結(jié)線蟲危害黃瓜與健康黃瓜根際土壤微生物群落Beta 多樣性差異

PCoA 分析結(jié)果表明，各組樣品中細(xì)菌組成存在一定的分離趨勢，且各組間的差異性顯著大于組內(nèi)的差異性（圖2A），表明受根結(jié)線蟲危害后的黃瓜根際土壤與健康黃瓜根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的Beta多樣性存在顯著差異。土壤樣品真菌群落分析結(jié)果（圖2B）表明，4組土壤樣品間真菌的多樣性組成相似性較小，受根結(jié)線蟲危害后黃瓜根際土壤與健康黃瓜根際土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)的Beta多樣性存在顯著差異。

2.4 根結(jié)線蟲危害黃瓜與健康黃瓜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異

2.4.1 根結(jié)線蟲危害黃瓜與健康黃瓜根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異 在門水平上，以相對豐度大于1%為閾值，4組樣品的細(xì)菌微生物群落組成相似（圖3），均包含10個共有細(xì)菌門。變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）均為各組樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌門，其中變形菌門占比最大，其在JGB中的相對豐度最高，為43.31%；放線菌門在BGW中的相對豐度最高，為19.46%；綠彎菌門和酸桿菌門在JGW 中的相對豐度分別為18.27% 和10.89%，高于其他組。擬桿菌門在各組中的相對豐度存在顯著差異（P=0.038），其中在BGB 中的相對豐度最高，為13.58%；在JGB 和BGW 中次之，相對豐度分別為10.54%和8.90%；在JGW中的相對豐度最低，為6.25%。

在每種細(xì)菌屬豐度達(dá)到1% 的前提下，健康和根結(jié)線蟲危害的黃瓜根際土壤中細(xì)菌群落在屬水平上的組成基本一致，均包含34 個屬（圖4）。其中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為優(yōu)勢細(xì)菌屬，在JGB中的相對豐度較高，為4.48%，高于其他組。

經(jīng)差異顯著性檢驗(yàn)，有10個細(xì)菌屬的相對豐度在4 組樣品間存在顯著差異（圖5）。其中黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、劍菌屬（Ensifer）、纖維弧菌屬（Cellvibrio） 和噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）在BGB 中的相對豐度分別為3.62%、2.58%、1.93%、2.34%、1.14%、1.60%、1.30%、1.13%和1.59%，均高于其他組；黃色類固醇桿菌屬（Steroidobacter）在JGB中相對豐度最高，為1.50%。

2.4.2 根結(jié)線蟲危害黃瓜與健康黃瓜根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異 在以相對豐度1%的閾值條件下，各組土壤真菌在門水平上的群落組成相似（圖6），均包含4個共有真菌門，其中子囊菌門（Ascomycota）為優(yōu)勢菌門，在各組中的相對豐度均達(dá)到81.00% 以上，在BGB 中最高，為88.38%；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的相對豐度在各組間差異顯著（P=0.031<0.05），在JGB 中的相對豐度最高（6.69%），其次是JGW（1.78%），在BGW和BGB中較低（1.03%和0.71%）。

以相對豐度不小于1%為閾值，4組土壤樣品在屬水平上包含27個共有真菌屬（圖7）。假埃希氏菌屬（Pseudallescheria）和被孢霉屬（Mortierella）為優(yōu)勢菌屬，其中假埃希氏菌屬在JGW中的相對豐度較高，為13.72%；被孢霉屬在BGW中的相對豐度較高，為12.02%。對4組土壤樣品間真菌群落在屬水平上的組成差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)7種真菌屬在各組間存在顯著差異（圖8），其中假埃希氏菌屬（Pseudallescheria）、毛殼菌屬（Chaetomium）以及unclassified_ f_Bionectriaceae 在JGW 中相對豐度較高，為別為13.73%、11.00% 和4.62%；漆斑菌屬（Myrothecium）和unclassified_ f_Ceratobasidiaceae 在JGB中的相對豐度較高，分別為7.51%和4.18%；綠僵菌屬（Metarhizium）的相對豐度在BGW中較高，為3.99%；棒孢菌屬（Corynespora）在BGB中的相對豐度較高，為2.64%。

3 討論

構(gòu)成植物根際功能核心的根際微生物在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，被看作是植物的第二基因組，已逐漸成為促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域[17]。本研究通過比較根結(jié)線蟲危害和健康黃瓜的根際土壤發(fā)現(xiàn)，健康根表土、健康根圍土、病害根表土、病害根圍土4組土壤樣品中細(xì)菌和真菌的群落組成多樣性無顯著差異，在一定閾值范圍內(nèi)，4組土壤樣品無論是細(xì)菌還是真菌在門和屬水平上的群落結(jié)構(gòu)組成均相似，但同類群在不同組間的相對豐度存在差異，與前人研究結(jié)果一致[18]。

4 組土壤樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌門均為變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和酸桿菌門，其中綠彎菌門和酸桿菌門在健康黃瓜根際土壤中的相對豐度較高。綠彎菌門參與重要的生物地球化學(xué)循環(huán)過程，能夠降解有機(jī)污染物和改善環(huán)境，包含多種營養(yǎng)代謝方式，并可以在不同的環(huán)境條件下進(jìn)行切換，其中一些類群產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有一定的抗菌效果[19]。酸桿菌門的細(xì)菌具有產(chǎn)抗生素、抗真菌藥物、抗病毒藥物等次生代謝物基因[20]，在植物生長過程中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用。

本研究中放線菌門和擬桿菌門在病害植株的根圍土和根表土中的相對豐度較高。研究表明，受根結(jié)線蟲侵害的苦瓜、茄子和番茄的根際土壤中放線菌的相對豐度高于未侵染土壤[15]，與本研究結(jié)果相似。據(jù)報道，放線菌及其代謝產(chǎn)物對植物病原菌和病蟲害具有較強(qiáng)的拮抗作用[21]，但Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，植物根際土壤中存在對根結(jié)線蟲具有吸引作用的放線菌，特殊的植物根系微生物有助于線蟲尋找寄主植物。本研究中受侵害黃瓜根圍土中的放線菌種類及具有生物活性的代謝產(chǎn)物還需進(jìn)一步分離鑒定。

研究表明，抗病蟲的栽培基質(zhì)中黃色類固醇桿菌屬為優(yōu)勢菌屬[23]。本研究結(jié)果也表明，健康黃瓜根表土中黃色類固醇桿菌屬的相對豐度較高；而黃桿菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、根瘤菌屬、德沃斯氏菌屬、鞘氨醇桿菌屬、劍菌屬、纖維弧菌屬和噬幾丁質(zhì)菌屬在受根結(jié)線蟲侵染的黃瓜植株根表土中的相對豐度較高。研究表明，黃桿菌屬和噬幾丁質(zhì)屬對病原體的侵害具有一定的抵抗作用[24]。假單胞菌、鏈霉菌及其代謝產(chǎn)物均對根結(jié)線蟲具有一定的抑制作用[25]。根結(jié)線蟲和根瘤菌屬、德沃斯氏菌屬、鞘氨醇桿菌屬和纖維弧菌屬存在互利共生的關(guān)系[26]。多數(shù)劍菌屬是從固氮根瘤中分離得到，屬于固氮菌，根結(jié)線蟲侵入的傷口可能為這類細(xì)菌的生長提供了有利條件[27]。

本研究結(jié)果表明，健康和受侵害黃瓜根際的真菌群落中均以子囊菌門為優(yōu)勢菌門，而擔(dān)子菌門的相對豐度在4組處理間存在顯著差異，其中在健康黃瓜根際土中的相對豐度較高。研究表明，在根結(jié)線蟲侵染的馬鈴薯根際土壤中，擔(dān)子菌門的相對豐度有所增加[28]，表明擔(dān)子菌門可能在一定程度上起到抵抗線蟲的作用。本研究中假埃希氏菌屬、毛殼菌屬和漆斑菌屬在健康植株根際土中的相對豐度較高。研究表明，假埃希氏菌屬在受根結(jié)線蟲危害的番茄根際土中的相對豐度較低[13]；由球形毛殼菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)能夠降低棉花黃萎病的病情指數(shù)，提高棉花產(chǎn)量[29]；漆斑菌屬對引起煙草根病的腐霉菌和立枯絲核菌的抑制率達(dá)到50%以上[30]；疣孢漆斑菌產(chǎn)生的代謝活性物質(zhì)能夠抑殺根結(jié)線蟲[31]。本研究表明，綠僵菌屬和棒孢菌屬在病害植株根際土中的相對豐度較高。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，綠僵菌屬在受根結(jié)線蟲危害的根際土中的相對豐度顯著增加。棒孢菌屬是植物致病菌，會引起植物葉枯病[32]。

綜上，在受根結(jié)線蟲危害后的黃瓜根表土和根圍土中，黃桿菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、噬幾丁質(zhì)屬、根瘤菌屬、德沃斯氏菌屬、鞘氨醇桿菌屬、劍菌屬和纖維弧菌屬的細(xì)菌以及綠僵菌屬和棒孢菌屬的真菌相對豐度顯著升高。在健康黃瓜植株根表土和根圍土中，黃色類固醇桿菌屬細(xì)菌和假埃希氏菌屬、毛殼菌屬和漆斑菌屬的真菌相對豐度較高。這些差異微生物的生理活動是否對植物健康生長產(chǎn)生影響還有待進(jìn)一步對菌種進(jìn)行分離純化和鑒定培養(yǎng)研究。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）