了解臨床微生物檢驗的常用染色方法

李玉梅

微生物細胞含有大量的水分（通常在80%以上），對光線的吸收和反射與水溶液差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細胞的運動性和直接計算菌數外，絕大多數情況下都要經過染色后，才能在顯微鏡下進行觀察。但是，染色就意味著微生物處于死亡狀態，其形態、結構也會發生一些變化，并不能完全代替活細胞的真實狀況。

基本原理

微生物染色通常有化學和物理兩種方法。其中，物理方式通常采用滲透、染料吸附等，化學方法則利用染料與細胞物質進行化學反應。通常來說，酸性物質對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩固；同樣，堿性物質對酸性染料較易于吸附。但是，要使酸性物質染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發生。細菌的等電點較低，呈現出酸性。因此，一般細菌學經常會使用堿性染料染色。染色還可能與菌體結構、膜的狀況（通透性、孔大小等）、細胞結構，以及染色時的電解質、溫度等有一定關系。

染料

染料分為人工和天然兩種。天然染料存在于自然界當中，例如蘇木素、胭脂蟲紅等，通常提取于植物當中。人工染料一般在煤焦油當中獲得，屬于苯衍生物。染料通常為有機酸或堿類，在有機溶劑當中易溶解，水中難溶解，但可以制成鹽類而溶于水。染料還可分為酸性、堿性、中性、單純四大類。

其中，酸堿染料并不是依據溶液的pH值決定，而是其自身所帶的助色基團決定。將助色基團電離之后，查看電荷的帶電情況。通常而言，堿性染料助色基團為正電荷，酸性染料助色基團為負電荷。因此，堿性染料通常能電離無色陰離子和有色陽離子，如龍膽紫、亞甲基藍等；酸性染料通常能電離一些無色陽離子和彩色陰離子，如伊紅、苦味酸、加那綠等。中性染料是一種復合型染料，通常是將酸堿染料進行混合。單純染料通常親和力低，染色的能力通常由被染色物決定，若能夠較好地溶于被染色物當中，則染色能力強，且單純染料難以溶于水，可溶脂肪溶劑，例如紫丹類。

微生物染色程序

雖然微生物有許多染色方式，但一般的操作程序大體相同，通常的流程為制片—干燥—固定—染色—干燥—鏡檢。

（1）制片：在進行微生物染色前，制作相應的載玻片。操作時，將生理鹽水滴1滴在載玻片上，而后應用無菌接種環挑選少許培養物混入生理鹽水中研磨至均勻乳濁狀，再涂抹成直徑1.5 cm左右的橢圓形薄菌膜。如果是液體培養基中的菌液，可直接涂在載玻片上。（2）干燥：涂片通常是在室溫當中進行自然干燥。為加快干燥速度，可以將菌膜面向上放在酒精燈火焰上方進行微加熱，使水分快速蒸發，但應注意不能夠與火焰靠得太近，否則會使菌體出現變形而影響鏡下觀察。（3）固定：通常是將細胞的結構進行固定。殺死微生物，將菌體與載玻片牢牢相粘，防止水沖洗掉。固定時需要將載玻片來回幾次通過酒精燈火焰最外層，溫度以玻片不燙手背為宜，冷卻之后進行染色。（4）染色：根據檢驗目的不同，選擇不同的染色方法，染液應完全覆蓋菌膜。（5）干燥：染色沖洗完成后的涂片可自然晾干，也可用吸水紙吸水后晾干或烘干。（6）鏡檢：應用光學顯微鏡在油鏡下對菌體的染色性、形態、排列進行觀察。

微生物染色方法

通常，微生物有單染和復染兩種染色方法 。

單染

即用一種染料對涂片進行染色，簡單方便，適用于觀察微生物的形態，但是不能夠對微生物進行鑒別。常用堿性染料，如亞甲基藍、孔雀石綠、堿性品紅、結晶紫、中性紅等。如果使用酸性染料，通常使用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅。當使用酸性染料時，必須降低染料溶液的pH值，使其呈強酸性（低于細菌細胞的等電點），使細胞帶正電，從而容易被酸性染料染色。

比如棉藍染色是一種用于真菌檢驗的染色方法。首先在一個干凈的載玻片上，滴入1～2滴乳酸酚棉藍染液，然后應用解剖針將霉菌菌落邊緣地區含有孢子及菌絲的部分切割取下，放置于染色液當中，蓋上蓋玻片稍用力按壓（注意不要產生氣泡），放至顯微鏡下進行觀察。先使用低倍鏡，再換高倍鏡。在鏡下，真菌孢子和菌絲會呈現出藍色，利于觀察真菌完整的形態。

復染

復染是應用兩種及以上的染料進行染色的方法。

革蘭氏染色

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。其被用于對肺炎鏈球菌以及克雷伯菌進行鑒定，包括了四個步驟，初染—媒染—脫色—復染。未染色的細菌在顯微鏡下很難分辨，因為與周圍環境的折射率相差不大。在染色后，陰性菌為紅色，陽性菌為紫色，然后再對于細菌的整體形態和結構進行觀察，以初步鑒定細菌的種類。

具體操作：首先使用接種環蘸取細菌，均勻涂抹于加有生理鹽水的載玻片上；對載玻片背面加熱殺死細菌并固定粘附，應用紫色染液進行初染色，時長為1 min左右；應用自來水沖洗多余的染料后，應用碘液媒染，持續1 min后進行沖洗；應用脫色劑脫色，例如95%酒精、丙酮酸，持續30 s，陽性菌在這一過程中不變色，陰性菌變為無色；應用紅色染液復染，持續30 s，陰性菌變為紅色。

這一方式的原理為在對細菌應用紫色染料初染以及碘溶液媒染后，細菌的細胞壁當中會形成結晶紫碘絡合物，其物理性質不溶于水。陽性菌的細胞壁厚，肽聚糖非常緊密，在應用脫色劑進行脫色時，陽性菌失水出現收縮，不容易脫色，且不含脂類物質，在乙醇處理時沒有空隙，所以呈現為紫色。而陰性菌的細胞壁薄，結構并不緊密，同時含有大量脂質，在脫色時脂肪溶解，結構變得更為松散，故非常容易脫色，呈現無色；在應用紅色染料進行第二次染色時，著色呈現為紅色。

抗酸染色

抗酸染色法是一種對具有抗酸性的細菌進行檢查的特殊染色方法。如分枝桿菌這類抗酸細菌的細胞壁含有大量脂質，不容易被著色，需要進行加熱或延長染色時間才能著色。若一旦與染料進行結合后，很難被酸性的脫色劑脫色。該染色方法首先使用石炭酸復紅進行初染；然后使用鹽酸酒精脫色；最后用亞甲藍染液進行復染。

具體操作：首先將石碳酸復紅染液滴加在涂片上，可用玻片夾將涂片固定在火焰的高處進行加熱，待出現蒸汽后短暫移開（若是染液蒸發減少，可以進行添加，避免干涸）；當染液冷卻后，可再加熱。如此循環10 min后，將標本冷卻水洗。不進行加熱染色時，可將染色時間延長至20 min，隨后應用3%的鹽酸酒精進行脫色至涂片無色為止，再使用自來水進行沖洗，最后使用亞甲藍染液復染1 min，水洗，自然待干或用吸水紙吸干后進行鏡下觀察。

可見，單染和復染兩種染色方式存在著較大的區別。單染只染一種顏色，一般應用于對菌體的形態和排列方式的觀察，但不能夠對細菌進行鑒別。復染應用的染料較多，因菌體的結構組成不同呈現出不一樣的顏色，且不同的細菌種類也存在不同的染料反應，因此能夠鑒別細菌，在臨床應用也較多。