自身基因優(yōu)化育種為植物分子育種提供新思路

生物育種技術(shù)是確保中國(guó)人將飯碗牢牢端在自己手里的重要手段。四川天豫興禾生物科技有限公司經(jīng)8年研究，建立了“基因超進(jìn)化”系統(tǒng)，獲得了一批高抗除草劑的作物內(nèi)源突變基因；結(jié)合分子育種技術(shù)與常規(guī)育種方法，創(chuàng)制出一種新的基因型設(shè)計(jì)育種方法，獲國(guó)內(nèi)外授權(quán)專利12 項(xiàng)，集成創(chuàng)建了“自身基因優(yōu)化育種”技術(shù)，成功培育出一批高抗除草劑的水稻新品系，為作物獲得創(chuàng)新性狀提供了新思路。自優(yōu)育種的商業(yè)化應(yīng)用，不僅能助力解決種業(yè)“卡脖子”難題，還可以推動(dòng)我國(guó)生物育種技術(shù)快速發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生物育種能力穩(wěn)步提升。

一、自身基因優(yōu)化育種技術(shù)路線

育種的本質(zhì)任務(wù)是創(chuàng)造變異、選擇有利變異、固定所選擇的變異。為解決抗除草劑“基因挖掘難”和“突變不定向”等技術(shù)難題，天豫興禾將分子育種技術(shù)與常規(guī)育種方法深入結(jié)合，從作物基因組中分離出多個(gè)除草劑標(biāo)靶基因，針對(duì)標(biāo)靶基因進(jìn)行隨機(jī)突變和定向篩選。該技術(shù)突變速度快、精準(zhǔn)度好、篩選效率高，可以快速獲得具有較高除草劑抗性的有益突變位點(diǎn)信息，被形象地稱為“基因超進(jìn)化”系統(tǒng)。天豫興禾通過“基因超進(jìn)化”篩選出一大批抗草甘膦和抗草銨膦的作物內(nèi)源突變基因。

為避免引入外源基因或載體系統(tǒng)，天豫興禾根據(jù)“基因超進(jìn)化”獲得的突變位點(diǎn)信息和作物靶標(biāo)基因野生型序列，利用PCR 技術(shù)對(duì)該基因片段進(jìn)行定點(diǎn)、精準(zhǔn)突變，獲得不含任何非必要突變和外源序列的突變片段，通過基因槍將此片段導(dǎo)入作物優(yōu)良品種，快速獲得無(wú)載體系統(tǒng)、不含外源基因的抗除草劑作物新品系。該實(shí)驗(yàn)過程即“自身基因優(yōu)化育種”（簡(jiǎn)稱自優(yōu)育種）（圖1）。

二、基因超進(jìn)化系統(tǒng)

（一）基因超進(jìn)化系統(tǒng)原理 “基因超進(jìn)化”是自優(yōu)育種的核心，是將標(biāo)靶基因置于高通量定向進(jìn)化系統(tǒng)中，進(jìn)行大量隨機(jī)突變和高效篩選的實(shí)驗(yàn)過程（該系統(tǒng)是經(jīng)過功能改造的微生物系統(tǒng)，只有當(dāng)突變基因符合系統(tǒng)預(yù)設(shè)目標(biāo)，例如，當(dāng)突變基因擁有抗除草劑功能時(shí)，該系統(tǒng)才能正常生長(zhǎng)，當(dāng)含有害突變時(shí)微生物不能存活，自動(dòng)被該系統(tǒng)淘汰，整個(gè)篩選過程在48h 內(nèi)完成），能快速篩選出具有目標(biāo)性狀的突變基因，通過測(cè)序分析，找出對(duì)基因功能有貢獻(xiàn)的氨基酸位點(diǎn)，申請(qǐng)相應(yīng)突變位點(diǎn)和功能基因的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)。創(chuàng)建“基因超進(jìn)化”的目的，就是為了快速獲得對(duì)作物內(nèi)源基因功能有貢獻(xiàn)的突變位點(diǎn)信息（圖2）。

圖2 “基因超進(jìn)化”系統(tǒng)技術(shù)路徑圖 “基因超進(jìn)化”是一個(gè)經(jīng)過功能改造的微生物系統(tǒng)，符合系統(tǒng)預(yù)設(shè)目標(biāo)的標(biāo)靶基因突變可以被快速篩選出來(lái)，例如只有標(biāo)靶基因突變抗除草劑時(shí)，系統(tǒng)才能正常生長(zhǎng)、繁殖，否則微生物不能存活。

（二）基因超進(jìn)化系統(tǒng)優(yōu)勢(shì) 創(chuàng)造優(yōu)良變異是育種的基礎(chǔ)，“基因超進(jìn)化”直接對(duì)標(biāo)靶基因進(jìn)行精準(zhǔn)、高效突變，變異效率是化學(xué)誘變1000 倍以上；該系統(tǒng)是開放系統(tǒng)，變異方式靈活多樣，可對(duì)標(biāo)靶基因進(jìn)行隨機(jī)突變、分區(qū)突變、功能區(qū)精準(zhǔn)設(shè)計(jì)等，對(duì)篩選結(jié)果不滿意可循環(huán)突變。利用該系統(tǒng)在3 個(gè)月內(nèi)就獲得了同時(shí)含3 個(gè)有益突變的作物基因，1 年內(nèi)獲得同時(shí)含6 個(gè)有益突變的基因。天豫興禾研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上需要的多個(gè)抗除草劑性狀，都需要3 個(gè)以上有益突變才能獲得，而傳統(tǒng)育種選育同時(shí)含3 個(gè)以上有益突變的難度極大?！盎虺M(jìn)化”創(chuàng)新性地解決以上難題，獲得的水稻、大豆、玉米、小麥和油菜內(nèi)源EPSPS突變基因，在抗性、酶活性等方面均優(yōu)于CP4-EPSPS?！盎虺M(jìn)化”系統(tǒng)還可用于定向改良作物光合效率、抗氧化和抗病等基因。

（三）基因超進(jìn)化獲得抗除草劑性狀 以“基因超進(jìn)化”篩選作物EPSPS基因突變體的抗性測(cè)試為例，評(píng)估各EPSPS基因突變體對(duì)草甘膦的抗性高低（部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1）。多個(gè)水稻OsEPSPS基因突變體表現(xiàn)出較強(qiáng)的草甘膦抗性，如2M43、2M44在100mmol/L 草甘膦濃度下能正常生長(zhǎng)；水稻2M45、玉米ZmES3和大豆GmES2等基因突變體在75mmol/L 草甘膦濃度下能正常生長(zhǎng)；而水稻OsEPSPS野生型基因在1mmol/L及更高的濃度下均不能正常生長(zhǎng)。天豫興禾還測(cè)試了轉(zhuǎn)基因作物中廣泛應(yīng)用的CP4-EPSPS突變基因，發(fā)現(xiàn)CP4-EPSPS能在50mmol/L 草甘膦濃度下正常生長(zhǎng)。

表1 突變體對(duì)不同濃度草甘膦的耐受性

三、自優(yōu)育種進(jìn)行抗除草劑作物品種改良

（一）突變基因精準(zhǔn)雜交實(shí)驗(yàn)以O(shè)sEPSPS基因?yàn)槔榻B自優(yōu)育種實(shí)驗(yàn)過程。根據(jù)“基因超進(jìn)化”獲得的突變信息確定需要精準(zhǔn)突變的堿基，將突變堿基合設(shè)計(jì)在正、反向PCR 引物中。以野生型基因?yàn)槟０?，利用PCR 精準(zhǔn)擴(kuò)增出含突變堿基的片段，然后用重疊PCR 將各突變片段拼接為不含任何非必要突變和外源序列OsEPSPS突變基因。利用基因槍將突變基因?qū)氪牧妓酒贩N中，完成了基因突變精準(zhǔn)雜交實(shí)驗(yàn)。

導(dǎo)入的突變基因既是目的基因，又可作為篩選基因（在培養(yǎng)基上和苗期用草甘膦篩選）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程不需要其他外源篩選基因和載體系統(tǒng)，因此，也不涉及任何異源DNA 和重組DNA。

（二）抗草甘膦水稻品種改良 天豫興禾在現(xiàn)行政策允許條件下，在實(shí)驗(yàn)室封閉環(huán)境中進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，對(duì)突變基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。將抗草甘膦基因突變精準(zhǔn)導(dǎo)入常規(guī)水稻品種，在苗期進(jìn)行草甘膦抗性測(cè)試，收獲生長(zhǎng)正常的單株進(jìn)行下一步抗性驗(yàn)證。經(jīng)過2～3 代嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)，獲得一批高抗草甘膦的水稻新品系。

另外，為測(cè)試該水稻對(duì)草甘膦抗性安全邊界，進(jìn)行了草甘膦耐受極限測(cè)試和農(nóng)藝性狀調(diào)查。多代實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過自優(yōu)育種改良的水稻品系，在20 倍劑量草甘膦噴施條件下仍正常生長(zhǎng)，且其他農(nóng)藝性狀無(wú)不良變化。而未改良的水稻材料（WT）噴施1 倍草甘膦7d 后全部死亡（圖3）。其中，1 倍劑量為農(nóng)藥田間推薦劑量，目前抗除草劑作物行業(yè)測(cè)試最高標(biāo)準(zhǔn)為5 倍。通過自優(yōu)育種獲得的多個(gè)抗除草劑水稻品系，對(duì)草甘膦抗性遠(yuǎn)超田間需求，具有非常高的抗除草劑安全性。

圖3 自優(yōu)育種抗除草劑水稻經(jīng)不同劑量草甘膦噴施15d 后生長(zhǎng)情況

四、天豫興禾全球?qū)＠季?/h2>

岳榮生等在《全球抗草甘膦基因?qū)＠治雠c技術(shù)展望》一文中統(tǒng)計(jì)了全球抗草甘膦基因?qū)＠暾?qǐng)情況。截至2020 年10 月，天豫興禾已申請(qǐng)20 項(xiàng)抗草甘膦基因?qū)＠瑢＠暾?qǐng)數(shù)位居全球第8 位（表2），有6 項(xiàng)專利獲得國(guó)內(nèi)授權(quán)，6 項(xiàng)獲得國(guó)際授權(quán)。其他申請(qǐng)人在抗草甘膦核心專利中披露的基因均來(lái)自細(xì)菌，而天豫興禾通過自優(yōu)育種獲得的抗草甘膦基因全部為植物內(nèi)源基因，未來(lái)具有較大的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

表2 抗草甘膦基因?qū)＠攸c(diǎn)申請(qǐng)機(jī)構(gòu)情況

五、自優(yōu)育種技術(shù)優(yōu)勢(shì)

自優(yōu)育種與傳統(tǒng)誘變育種相比：從對(duì)整個(gè)基因組隨機(jī)誘變到直接對(duì)標(biāo)靶基因精準(zhǔn)突變，從需要第二季進(jìn)行田間大規(guī)模目標(biāo)性狀篩選到在實(shí)驗(yàn)室48h 完成篩選，自優(yōu)育種大大縮短性狀選育周期，降低育種成本。

自優(yōu)育種與轉(zhuǎn)基因相比：從自然界挖掘符合目標(biāo)性狀的外源基因到目標(biāo)明確地創(chuàng)造作物內(nèi)源基因有益突變，降低了偶然性，大幅提高基因進(jìn)化效率，顯著降低育種成本，同時(shí)有效避開國(guó)外轉(zhuǎn)基因相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)技術(shù)壁壘。

自優(yōu)育種技術(shù)使用場(chǎng)景多樣，可與現(xiàn)有生物育種技術(shù)搭配應(yīng)用，“基因超進(jìn)化”獲得的作物內(nèi)源功能基因，不僅能通過自優(yōu)育種技術(shù)開發(fā)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，還可利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)造基因編輯產(chǎn)品，或利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。

六、自優(yōu)育種綜合效益分析和應(yīng)用前景

自優(yōu)育種抗除草劑作物的成功創(chuàng)制，不僅能顯著拓寬滅生性除草劑在作物中的使用范圍，還可以降低糧食生產(chǎn)成本。經(jīng)測(cè)算：每畝自優(yōu)育種抗除草劑水稻能節(jié)本增收100～200 元，包括除草成本、人工成本、田間管理成本的降低以及品質(zhì)收益提高等。在消滅抗性雜草的同時(shí)，還能解決農(nóng)藥殘留、食品安全和生態(tài)環(huán)境污染等諸多問題，有效促進(jìn)作物輕簡(jiǎn)化栽培快速發(fā)展。

下一步，天豫興禾將“基因超進(jìn)化”擴(kuò)展應(yīng)用于開發(fā)新的高光效基因、抗病害基因等。同時(shí)，自優(yōu)育種技術(shù)還擁有更廣闊的應(yīng)用范圍，不僅能用于主糧作物，還能用于其他經(jīng)濟(jì)作物。

天豫興禾作為一家專注于植物分子育種技術(shù)研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化的高科技企業(yè)，致力于為現(xiàn)代種業(yè)制造育種“芯片”，獨(dú)創(chuàng)的自優(yōu)育種技術(shù)在國(guó)內(nèi)外擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，是解決我國(guó)種業(yè)“卡脖子”難題的重要技術(shù)手段；自優(yōu)育種的商業(yè)化應(yīng)用，能有效推動(dòng)我國(guó)生物育種技術(shù)快速發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生物育種能力穩(wěn)步提升，實(shí)現(xiàn)生物育種產(chǎn)業(yè)繁榮穩(wěn)定。