慢病毒介導穩定表達Cas9 蛋白的雞成纖維細胞系構建及其活性驗證

李曉嬌，朱新宇，鄒 嫻，嚴 霞，何燕華，羅成龍

（1.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農業科學院動物科學研究所/畜禽育種國家重點實驗室/廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】基因編輯技術對高效獲得特定表型的畜禽新品種具有重要意義，而畜禽功能基因的挖掘和開發是選育新品種的重要手段。成簇的規律間隔短回文重復序列（CRISPR/Cas9）是當前應用最廣泛的基因編輯技術［1-2］。近年來，通過應用CRISPR/Cas9 技術對哺乳動物細胞、活體進行精確基因編輯和基因功能研究，顯著加快了生物學、醫學相關研究的效率。基于CRISPR/Cas9 的基因工程技術與細胞工程技術相結合，可以不斷挖掘動物的功能基因，豐富動物遺傳資源，推進動物育種進程。本研究建立穩定表達Cas9 蛋白的雞成纖維細胞系（DF-1）將有利于推進雞功能基因的挖掘工作，對加快明確雞育種進程的主效基因具有重要意義。【前人研究進展】CRISPR/Cas9 系統中sgRNA 引導Cas9 蛋白造 成DNA 雙鏈斷裂（Double-Strand Breakage，DSB），并誘導DNA 自我修復，包括同源重組修復（Homology Directed Repair，HDR）、非同源末端鏈接（Non-homologous End Joining，NHEJ）和單鏈退火（Single-stranded Annealing,SSA）3 種方式［3-4］。利用DNA 自我修復的特性，可在DSB時精確敲除、插入或替換特定的堿基。CRISPR/Cas9 技術具有高效、應用簡單且成本低的優點，因此在動物和植物的遺傳育種研究中發揮重要作用［5-7］。為了快速確認CRISPR/Cas9 系統的編輯能力，一般采用報告系統便于結果的觀察［8-9］。SSA 修復機制是一種重要的DNA 重組方式，雙鏈DNA 斷裂產生3'ss DNA 懸臂末端，當兩端存在同向的同源序列時，同源序列與懸臂末端通過堿基互補配對擬合在一起，再經過核酸內切酶切除多余的3'末端、聚合酶補齊雙鏈缺口、連接酶連接最終完成修復。近年來基于SSA 修復機制的報告系統相繼被報道［9-13］，其修復效率比NHEJ高10 倍［14］。Oishi 等［15］在禽細胞上利用SSA 報告載體判斷sgRNA 活性，針對卵清蛋白（OVA）和卵胞漿樣蛋白（OVM）分別設計4 條sgRNA，將Cas9 蛋白和sgRNA 共表達載體與SSA 報告載體共同轉染293T 細胞，快速篩選出活性最好的sgRNA 序列，在后續研究中用于產生基因編輯雞，且無出現脫靶效應。黃思嘉等［16］通過雙熒光報告載體試驗證明了成對敲除載體的工作效率遠高于單敲除載體，采用成對的AMHR2敲除載體共轉染DF-1 細胞，結果顯示AMHR2基因的突變率達到60%。【本研究切入點】應用SSA 報告系統是快速檢測sgRNA 活性的有效手段，而在雞細胞上利用SSA 報告載體檢測穩轉Cas9 細胞系活性還未見報道。獲得有穩定切割活性的穩轉Cas9蛋白細胞系非常重要，在穩轉細胞系中同時引入SSA 報告載體系統和sgRNA 表達載體，sgRNA 能快速引導Cas9 蛋白切割SSA 報告載體中的靶片段，從而快速判斷Cas9 核酸酶活性，得到具有活性的穩轉Cas9 蛋白的細胞系。【擬解決的關鍵問題】與哺乳動物細胞系相比，雞DF-1 細胞轉染效率較低，通過慢病毒感染DF-1 細胞篩選穩轉Cas9 的陽性細胞，并結合SSA 報告載體驗證其活性，可為后續在DF-1 細胞上開展高通量篩選以及功能基因驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DF-1、293T、DF-1-EGFP-Cas9 細胞和DH5α感受態細胞由廣東省農業科學院動物科學研究所保存；Lenti-Blast-Cas9、psPAX2、PMD2.G由華中農業大學動物科技學院贈送，pYP152、pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ由中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所贈送。轉染試劑LipofectamineTM3000、殺稻瘟菌素（Blasticidin，下文簡寫為Blast）、限制性內切酶BbsⅠ、Hind Ⅲ以及細胞培養用的基礎培養基DMEM、PBS 緩沖液和細胞培養胎牛血清（FBS）購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，慢病毒感染增強試劑聚凝胺Polybrene 購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；AG 高保真DNA 聚合酶購于湖南艾科瑞生物工程有限公司，In fusion 同源重組酶和DNA Ligation Mix 購于寶日醫生物技術（北京）有限公司，質粒中量提取試劑盒購于Omega Bio-tek廣州飛揚生物工程有限公司，血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒和瓊脂糖凝膠核酸純化回收試劑盒購于天根生化（北京）科技有限公司，LB 肉湯購于環凱微生物有限公司，氨芐青霉素購于北京索萊寶科技有限公司，Cas9 蛋白抗體購于艾博抗（上海）貿易有限公司，HRP 標記的山羊抗兔IgG 購于賽信通（上海）生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養 293T 細胞和DF-1 細胞均以含10% FBS 的DMEM 培養基為完全培養基，分別置于37 ℃、含5% CO2的培養箱和39 ℃、含5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2 Blast 工作濃度篩選 在6 孔板上接種DF-1 細胞，當細胞長至密度為80%～90%時加入含有Blast 的完全培養基（DMEM+10%FBS），將1 mg/mL 的Blast 溶液用不加抗生素的完全培養基分別稀釋為0、2、4、6、8、10 μg/mL，每天觀察細胞生長狀態，每隔48 h 更換1 次新鮮的篩選培養基。

1.2.3 穩轉Cas9 的DF-1 細胞構建 將293T細胞鋪板在10 cm 培養皿上，生長至密度為70%～80% 時轉染。按 照LipofectamineTM3000 轉染試劑說明書轉染慢病毒三質粒系統，轉染質粒的總量為24 μg，3 種質粒的比例為Lenti -Blast-Cas9 ∶psPAX2 ∶PMD2.G=3 ∶2 ∶1，轉染前更換新鮮的完全培養基，轉染6 h 后換液，并分別在轉染48、72 h 后收集慢病毒上清液，-80℃保存。之后將DF-1 細胞接種于6 孔板，生長至密度為40%左右用慢病毒感染細胞，慢病毒∶完全培養基=1 ∶1，加入終濃度為8 μg/mL 的Polybrene 進行培養，以不加入慢病毒為對照。感染24 h 后換為完全培養基，48 h 后加入最適工作濃度Blast 的完全培養基，隔天換液，直至對照處理細胞全部死亡。之后更換為含最適抗生素濃度1/2 的完全培養基繼續培養細胞。

1.2.4 單克隆細胞株的篩選 采用有限稀釋法篩選單克隆細胞株。用0.1%胰蛋白酶消化單層DF-1 細胞，制成細胞懸液，用完全培養基將細胞稀釋成1 000 cell/mL 后，取200 μL 細胞懸液加入96 孔板的A1 孔，其他孔加入100 μL 含2 μg/mL Blast 的篩選培養基，吸取100 μL A1 孔的細胞加至A2 孔，以此類推稀釋到A8 孔。再向A1～A8 孔各加入100 μL 培養基，混勻后分別取100 μL 加入B1～B8 孔，逐步稀釋至L1～L8 孔。觀察選擇只有單個細胞的孔，繼續培養2～3 周，當細胞長滿后在48 孔板擴大培養，依次傳代到12孔板、6 cm 皿、10 cm 皿并凍存細胞。

1.2.5 PCR 擴 增Cas9 核酸酶DNA 片段用SnapGene 軟件分析Lenti-Blast-Cas9 慢病毒載體圖譜和序列（圖1），針對載體中的Cas9 蛋白設計引物（Lenti Cas9-F：5'ATGGACAAGAAGTAC AGCATCGGC3'；Lenti Cas9-R：5'ACAGGTC GATCCGTGTCTCGTA3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。提取單克隆細胞株的基因組DNA，進行PCR 擴增Cas9 片段，PCR 反應體系參考AG 高保真DNA 聚合酶說明書，反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸4 min，共35個循環。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

圖1 Lenti-Blast-Cas9 載體圖譜Fig.1 Lenti-Blast-Cas9 vector map

1.2.6 Western blot 驗 證Cas9 蛋白表達將陽性單克隆細胞在6 孔板中傳代，同時設置陰性和陽性對照，其中陰性對照為沒有做任何處理的DF-1 細胞，陽性對照為DF-1-EGFP-Cas9 細胞，培養48 h 后棄去培養基，用PBS 清洗2 次，然后分別在細胞中加入配制好的RIPA 蛋白裂解液，在冰上裂解20 min 后加入5×上樣緩沖液，在100 ℃金屬浴中變性10 min。之后用8% SDSPAGE 分離膠于90 V 下恒壓電泳2 h 分離蛋白樣品，300 mA 恒流轉膜2 h，室溫下用含5%BSA的TBST 封閉1 h，一抗在4℃下過夜孵育（一抗稀釋比例為1 ∶20 000），用1× TBST 洗膜3 次后在常溫下孵育二抗（二抗稀釋比例為1 ∶5 000），洗膜3 次后顯影觀察結果，用Image J軟件分析目的蛋白和內參蛋白灰度值，計算Cas9蛋白相對表達量，用GraphPad Prism 9 軟件繪制散點圖。

1.2.7 sgRNA 表達載體構建在 線（http://crispor.tefor.net/）設計靶向OVA基因的sgRNA序列，引物（OVAsgRNA top：5'caccGCCATGCCAAT GAGAACATCT3'，OVAsgRNA bottom：5'aaacAGA TGTTCTCATTGGCATGGC3'，小寫字母 為BbsⅠ粘性末端）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，純化方式為PAGE。用ddH2O 將引物稀釋到100 nmol/mL，在PCR 管中加入引物對各5 μL，在PCR 儀中退火形成寡聚核苷酸鏈，退火程序為95℃ 5 min、65℃ 1 h。sgRNA 表達載體以pYP152 為骨架，在U6 啟動子后帶有BbsⅠ酶切位點，用于插入sgRNA 序列。將pYP152 載體用BbsⅠ在37℃下酶切1 h，線性化后用5 μL DNA Ligation Mix 連接sgRNA 退火產物，反應條件為16℃ 1 h。將連接產物轉化DH5α、涂板，第2 天挑菌送出測序。

1.2.8 SSA 報告載體構建 SSA 修復機制可以快速靈敏地檢測穩轉Cas9 細胞株的切割活性，依賴于同源重組的SSA 修復機制如圖2 所示。

圖2 SSA 修復過程示意圖Fig.2 SSA repair process schematic diagram

SSA報告載體以pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ為骨架，用軟件snapGene 設計OVA靶片段引物，該片段需要包含OVAsgRNA 序列，并添加報告載體pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ 的酶切位點兩端15 bp 同源臂（OVASSA F：5'caggactcctccctgA TCCTTACATTTTCACTGTTCTGCTG3'，OVASSA R：5'ccttggtcaccttcaCCTCTGAGCTATGCAGTTTCC AA3'，小寫字母為Hind Ⅲ酶切位點兩端15 bp 同源臂）。PCR 擴增OVA靶片段，反應程序為：95℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35 個循環。對報告載體用Hind Ⅲ在37℃下酶切15 min，用天根DNA 回收試劑盒純化靶片段PCR 產物和報告載體酶切產物，之后用In fusion 酶連接，連接體系為：PCR純化產物200 ng、酶切產物50 ng、5× In-fusion HD Enzyme Premix 2 μL，補水至10 μL，在50℃下反應15 min，連接產物轉化DH5α 感受態細胞，涂板，第2 天挑選單克隆菌送出測序。

1.2.9 DF-1 穩轉Cas9 蛋白細胞培養與轉染 對穩轉Cas9 蛋白的DF-1 細胞用含2 μg/mL Blast 的篩選培養基在39℃下培養，細胞長滿后將細胞接種到24 孔板，當細胞密度達到70%～80%左右時進行轉染試驗，轉染試劑為LipfectamineTM3000，按照說明書操作，sgRNA 表達載體和SSA 報告載體比例為1 ∶1，總量為1 μg。設置DF-1 僅轉染pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ的陰性對照，DF-1 共轉Lenti -Blast-Cas9、pYP152-OVAsgRNA 以 及pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ的陽性，其他4 株單克隆細胞株共轉pYP152-OVAsgRNA 和pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ，轉染48 h 后在熒光顯微鏡下觀察熒光。

2 結果與分析

2.1 Blast 最佳工作濃度

用含有不同濃度Blast 的培養基培養DF-1 細胞，以培養7 d 后細胞全部死亡的Blast 濃度為DF-1 穩轉Cas9 細胞株篩選的最適工作濃度，結果（圖3）表明，Blast 濃度為4 μg/mL 時，培養7 d 后細胞全部死亡，因此，選擇4 μg/mL 為Blast的最適工作濃度。

圖3 不同濃度Blast 培養DF-1 細胞7 d 后的細胞狀態（4×）Fig.3 Cell status of DF-1 cells after 7 days of culture with different concentrations of Blast (4×)

2.2 單克隆細胞株的篩選

利用含4 μg/mL Blast 的培養基培養7 d 后陰性對照細胞全部死亡，慢病毒感染組還有少量存活細胞，繼續培養3 d 后，換為含2 μg/mL Blast 的培養基維持篩選，再培養1 周后明顯觀察到慢病毒感染組形成多個單克隆細胞（圖4）。用有限稀釋法以10 個96 孔板將這些單克隆細胞進行稀釋，最終獲得27 株單克隆細胞株。

圖4 穩定表達Cas9 蛋白的DF-1 陽性細胞Fig.4 DF-1 positive cells of stably expressing Cas9 protein

2.3 單克隆細胞株Cas9 蛋白表達驗證

提取單克隆細胞株的DNA，PCR 擴增Cas9核酸酶DNA 片段，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，單克隆細胞株在4 140 bp 處均有明顯的目的條帶，而陰性的DF-1 細胞未檢測到任何條帶（圖5A）。提取細胞總蛋白，Western blot 結果表明，挑選的DF-1 穩轉株均表達Cas9 蛋白，且DF-1細胞不表達（圖5B）。用Image J 分析灰度值后，計算目的蛋白與內參蛋白的比值并做歸一化處理，使用GraphPad Prism 9 得到穩轉Cas9 蛋白細胞系的Cas9 蛋白表達量散點圖（圖5C），這些穩轉株的Cas9 表達水平均不一致，選擇其中幾株表達較高的細胞株擴大培養，用于后續的SSA 修復活性檢測。

圖5 單克隆細胞株Cas9 蛋白表達驗證Fig.5 Validation of Cas9 protein expression in a monoclonal cell line

2.4 sgRNA 表達載體與SSA 報告載體的構建

為了構建sgRNA 表達載體，用BbsⅠ酶切pYP152 線性化載體（圖6A），與退火的OVAsgRNA 序列相連，轉化感受態DH5α 后在氨芐抗性固體培養基上培養，挑取單克隆菌落，由天一輝遠生物科技有限公司測序，結果顯示OVAsgRNA 序列插入pYP152 載體的位置、方向和序列均正確，成功構建OVAsgRNA 表達載體。PCR擴增OVA靶片段，瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶正確，切膠，用試劑盒回收DNA 片段（圖6C），與線性化的pCMV-mCherry-SSA-Hind Ⅲ載體連接，轉化后挑取單克隆菌落，菌液測序結果與克隆載體進行比對，結果（圖6D）顯示有408 bp 插入，該OVA靶片段包含正確的sgRNA 序列和對應的PAM 位點，成功構建SSA 報告載體。所構建的pYP152-OVAsgRNA 表達載體和pCMV-OVASSA-mCherry-Hind Ⅲ報告載體用于后續共轉檢測穩轉Cas9 蛋白細胞的切割活性。

圖6 sgRNA 表達載體和SSA 報告載體構建結果Fig.6 Construction results of sgRNA expression vector and SSA reporter vector

2.5 基于SSA 報告載體檢測穩轉細胞株活性

將構建好的sgRNA 表達載體和SSA 報告載體共轉穩定表達Cas9 蛋白的DF-1 細胞系，轉染48 h 后通過熒光顯微鏡觀察每株細胞的SSA 修復情況。由圖7 可見，單轉報告載體的細胞不表達紅色熒光，說明SSA 報告載體在插入一段外源序列后不表達紅色熒光，而瞬時轉染慢病毒載體Lenti-Blast-Cas9、sgRNA 表達載體、SSA 報告載體以及其他DF-1 穩轉株均有不同程度的紅色熒光，表明篩選到的穩轉Cas9 蛋白的DF-1 細胞系均可表達Cas9 蛋白，且在sgRNA 的引導下發揮切割DNA 的作用，并誘發細胞的SSA 修復機制，恢復紅色熒光。

圖7 穩定表達Cas9 蛋白細胞株轉染結果(10×) Fig.7 Transfection results of cell lines of stably expressing Cas9 protein (10×)

3 討論

慢病毒屬于逆轉錄病毒，可以感染處于分裂期和非分裂期的多種類型細胞，常被用于攜帶大片段的外源基因，在逆轉錄酶的作用下高效整合到目的細胞基因組中［17］，構成穩定表達外源基因的細胞系。DF-1 細胞作為大多數禽類病毒易感細胞，常被用于研究禽病產生經過和發病機制［18］。本研究使用慢病毒載體Lenti-Blast-Cas9 與其他兩個慢病毒輔助質粒，在293T 細胞中轉染包裝產生Cas9慢病毒，該慢病毒載體攜帶Blast抗性標簽，感染DF-1 細胞后篩選出具有Blast 抗性的穩定表達Cas9 蛋白的細胞，結合SSA 報告載體證明該細胞具有產生DSB 的能力，表明成功構建了穩定表達Cas9 蛋白的DF-1 細胞，這為今后研究雞的功能基因以及構建雞全基因組CRISPR/Cas9 敲除細胞庫奠定基礎。

近年來，基于報告系統檢測基因編輯系統中核酸酶、sgRNA 活性的方式逐漸興起。報告系統通常包括報告細胞和報告載體，其工作原理是利用基因編輯系統在報告基因編碼區引起DSB，之后通過NHEJ、HDR 或SSA 修復抑制或者恢復報告基因表達，報告基因可選抗生素抗性基因、熒光蛋白等，可以直觀、快速并靈敏地觀察結果［14,19］。SSA 修復由同源重組介導且不需要額外引入模板鏈，在DSB 位點存在重復序列時，雙鏈斷裂的末端會暴露單鏈DNA，這些單鏈DNA 上的反向重復序列會通過互補配對形成環狀DNA 結構，再由內切酶和DNA 聚合酶發揮作用使DNA雙鏈斷裂得到修復［20-21］，從而恢復SSA 載體中報告基因的表達［22］。本研究篩選到Blast 陽性單克隆細胞后，為了快速檢測穩轉Cas9 蛋白細胞的活性，采用SSA 報告系統，實驗流程簡單，只需將已確定有活性的OVAsgRNA 序列和構建含有OVA靶片段的SSA 報告載體共轉染穩定表達Cas9蛋白的細胞，48 h 后即可直接觀察到mCherry 恢復表達的情況，SSA 報告載體系統應用于檢測核酸酶活性，避免了復雜的實驗過程，從而節約時間和成本。

通過基因敲除或插入研究基因功能是必不可少的生物技術手段。CRISPR/Cas9 系統適用于編輯任何細胞類型的基因，目前在人和小鼠方面已經建立了較為成熟的應用體系［23-25］，采用CRISPR/Cas9 系統研究豬的功能基因（如CD163、MSTN等）也已經有突破性進展［26-29］，相關功能基因的敲除均產生了具有特定表型的豬。近年也有利用CRISPR/Cas9 技術進行雞已知功能基因的研究，研究表明，W38純合敲除雞可以抵抗禽白血病侵襲［30］；DMRT1的敲除證明該基因與雞睪丸發育至關重要［31-32］。目前已知的雞生長性能、器官發育以及抗病性等相關功能基因還較少。CRISPR/Cas9 系統在禽類研究方面的應用近幾年才開始，且面臨sgRNA 脫靶、編輯效率低以及CRISPR 遞送方式困難等問題［33］。本研究結果表明，SSA 報告載體系統在檢測Cas9核酸酶活性方面發揮重要作用。在應用CRISPR/Cas9 進行基因編輯時，往往需要設計多條sgRNA進行驗證，最終選擇1 條活性最高的sgRNA 進行后續研究［34］，因此后續可以利用SSA 報告載體系統并結合穩轉Cas9 蛋白的DF-1 細胞來快速篩選切割效率高的sgRNA。本研究中穩轉Cas9 蛋白的DF-1 細胞不僅可以用于功能基因驗證，還可用于高通量篩選功能基因。

4 結論

本研究利用慢病毒載體系統獲得長期穩定表達Cas9 蛋白的雞DF-1 細胞系。鑒于SSA 報告載體系統的高效性，本研究構建了SSA 報告載體，結合CRISPR/Cas9 系統的作用快速檢測穩轉細胞的修復活性。SSA 報告系統結果顯示，上述建立的穩定表達Cas9 蛋白的DF-1 細胞具有不同水平的SSA 修復能力，表明本研究得到了穩定表達Cas9 蛋白且具有Cas9 核酸酶活性的DF-1 細胞系，可為后續在雞細胞水平上進行功能基因篩選及鑒定等相關研究奠定基礎。