TGF-β1干預構建的人支氣管上皮細胞上皮-間質轉化模型中lncRNA和miRNA表達及其意義

陳華培 楊召川 李蕾 曲政海

［摘要］ 目的 探討人轉化生長因子β1（TGF-β1）干預構建的人支氣管上皮細胞16HBE上皮-間質轉化（EMT）模型中lncRNA和miRNA的表達情況。方法 體外培養16HBE細胞，設立對照組和處理組。處理組以TGF-β1誘導細胞構建EMT細胞模型，對照組加入等量RPMI基礎培養液。分別于TGF-β1處理細胞后24、48、72 h使用倒置顯微鏡觀察兩組細胞形態及分布。當處理組細胞開始出現明顯梭形改變時，采用RNA分離、逆轉錄以及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測兩組細胞中lncRNA和miRNA相對表達量。結果經TGF-β1處理細胞48 h后，處理組細胞梭形改變明顯，細胞間隙增大，顯示EMT模型構建成功。同時在該時間點，兩組細胞中TBILA、NKILA、LNCRNA-ATB、HOTAIR、NEAT1、miR-125b-5p、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-141-3p、miR-200c-3p、miR-17-5p、miR-34a-5p的相對表達量比較差異均具有顯著意義（t=－16.353～6.460，P<0.05）。結論 TGF-β1干預能夠成功構建EMT細胞模型，該細胞模型中的細胞與正常細胞相比，多個lncRNA和miRNA表達具有顯著差異。上述基因可能參與了EMT或氣道重塑的形成和發展，或許為這些疾病的防治提供分子理論支持。

［關鍵詞］ RNA，長鏈非編碼；微RNAs；轉化生長因子β1；上皮-間質轉化；上皮細胞；氣道重塑；纖維化

［中圖分類號］ R329.25；R394? ? ［文獻標志碼］ A

［ABSTRACT］ Objective To investigate the expression of long non-coding RNAs （lncRNAs） and microRNAs （miRNAs） in the epithelial-mesenchymal transition （EMT） model of human bronchial epithelial cell line 16HBE induced by human transforming growth factor-β1 （TGF-β1）.? Methods 16HBE cells were cultured in vitro， and the experiment established control group and treatment group. The cells in the treatment group were induced by TGF-β1 to establish an EMT cell model， and those in the control group were added with an equal volume of RPMI basic culture medium. At 24， 48， and 72 h after TGF-β1 treatment， an inverted microscope was used to observe cell morphology and distribution. At the time point when the cells in the treatment group began to show obvious spindle-shaped changes， the methods of RNA separation， reverse transcription， and quantitative real-time PCR were used to measure the relative expression levels of lncRNAs and miRNAs in the two groups.? Results After 48 h of TGF-β1 treatment， the cells in the treatment group showed obvious spindle-shaped changes and an increase in intercellular space， suggesting that the EMT model was successfully established. At this time point， there were significant differences between the two groups in the relative expression levels of TBILA， NKILA， LNCRNA-ATB， HOTAIR， NEAT1， miR-125b-5p， miR-21-3p， miR-21-5p， miR-27a-3p， miR-27a-5p， miR-141-3p， miR-200c-3p， miR-17-5p， miR-34a-5p（t=-16.353-6.460，P<0.05）. Conclusion TGF-β1 intervention can successfully establish the EMT cell model， and the differentially expressed lncRNAs and miRNAs between this cell model and normal cells may be involved in the formation and development of EMT or airway remodeling， which might provide a theoretical basis for the prevention and treatment of such diseases.

［KEY WORDS］ RNA， long noncoding; MicroRNAs; Transforming growth factor beta1; Epithelial-mesenchymal transition; Epithelial cells; Airway remodeling; Fibrosis

上皮-間質轉化（EMT）是一種不具有遷移能力的上皮細胞在各種原因誘發下，失去上皮標志物、獲得間質表型并轉化為間質細胞，致細胞形態呈長梭形改變，并獲得遷移能力的過程。其在組織發育、疾病發生發展中發揮著重要作用[1]。轉化生長因子β（TGF-β）屬于相關生長因子超家族一員，相關信號通路在控制組織發育、增殖、分化、凋亡和穩態中發揮著關鍵性作用[2]。本課題組前期研究發現，經過TGF-β1處理后，人支氣管上皮細胞（16HBE）發生EMT，并參與哮喘氣道重塑和纖維化的過程[3-5]。

基因轉錄本不翻譯成蛋白質，但是可以直接作為結構分子、調節分子或者催化分子發揮作用，此類RNA稱為非編碼RNA（ncRNA）[6]。ncRNA（例如lncRNA和miRNA）在氣道重塑和氣道纖維化相關的EMT形成過程中作用的研究報道較少。本研究擬通過TGF-β1干預構建人16HBE EMT細胞模型，探討EMT細胞模型中lncRNA和miRNA相對表達量的變化，為氣道纖維化或氣道重塑防治方面的研究提供分子理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

人16HBE細胞（源自中國醫學科學院腫瘤細胞庫），特級胎牛血清、RPMI1640基礎培養基、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）（武漢普諾賽生命科技有限公司），TGF-β1蛋白（MedChemexpress生物科技公司，美國），RNA-easy Isolation Reagent（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒以及miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司），2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養和處理 16HBE細胞復蘇后，置于含體積分數0.10胎牛血清以及10 g/L青霉素-鏈霉素的RPMI1640生長培養基中，每2～3 d換液1次，待融合度達80%～90%時進行傳代。將細胞接種于6孔板中，每孔約30～50萬個細胞，每孔加入生長培養基2 mL，分為對照組和處理組，每組設3個復孔。接種當天，處理組每孔中加入TGF-β1，使其在培養基中濃度約為10 μg/L，而對照組中加入與處理組TGF-β1等體積的RPMI基礎培養基；分別于細胞處理24、48、72 h后使用倒置顯微鏡觀察兩組細胞形態及分布，當處理組細胞形態明顯梭形改變、細胞間隙增大時，表明EMT細胞模型已構建成功，記錄該時間點，以此作為后續實驗處理時間。

1.2.2 RNA分離、逆轉錄及RT-qPCR檢測 根據RNA-easy Isolation Reagent說明書，當EMT細胞模型構建成功時，分別分離并提取上述兩組細胞中總RNA，紫外可見分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。根據說明書，采用Evo M-MLV 反轉錄預混型試劑盒和miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒對分離RNA行反轉錄，兩種試劑反轉錄的cDNA分別進行下一步lncRNA或miRNA的RT-qPCR檢測。除了miRNA的下游引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司提供以外，lncRNA和miRNA的其他引物均由深圳華大基因股份有限公司進行合成（表1）。其中GAPDH作為lncRNA的內參基因，U6（湖南艾科瑞生物工程有限公司）作為miRNA的內參基因。再使用2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix對經反轉錄生成的cDNA進行RT-qPCR，獲得各組樣本擴增CT值，采用2－△△CT方法計算各基因的相對表達量。

2 結? 果

2.1 經過TGF-β1處理后兩組細胞不同時間點形態比較

倒置顯微鏡觀察結果顯示，對照組16HBE細胞第24、48、72小時時均為鵝卵石樣或鋪路石樣的單層細胞，細胞間連接緊密，聚集成團狀或島狀。處理組細胞在第24小時時形態和分布變化不明顯；而第48和72小時時呈長梭形，細胞與細胞間連接不緊密，間隙增大，細胞發生了EMT（圖1）。第48小時時EMT細胞模型已經構建成功。

2.2 兩組細胞中各lncRNA和miRNA相對表達量比較

兩組細胞處理48 h后進行RT-qPCR檢測，處理組中各lncRNA和miRNA的相對表達量與對照組比較，差異均具有顯著性（t=－16.353～6.460，P<0.05）。見表2。

3 討? 論

氣道纖維化和氣道重塑是不可逆的呼吸系統疾病，嚴重影響患者的生活質量，其預防和治療仍然是目前世界范圍內亟待解決的難題。ncRNA在氣道纖維化和氣道重塑中發揮著重要作用，參與疾病的發生和發展，但相關研究報道較少。本研究通過構建EMT細胞模型，模擬氣道纖維化，探討細胞中lncRNA和miRNA的表達情況，為氣道纖維化以及氣道重塑的預防或治療提供數據參考。

本研究中，TGF-β1處理16HBE 細胞48 h后，細胞形態呈長梭形，細胞與細胞間連接不再緊密，間隙增大，提示細胞已經發生了EMT，細胞模型構建成功。研究發現TGF-β對EMT有誘導或者促進作用，但相關機制研究較少。WANG等[7] 體外研究發現，TGF-β1可通過刺激人肺癌細胞抑制Src同源物2-b3 （SH2B3，又稱淋巴細胞接頭蛋白）的表達，激活JAK2/STAT3和SHP2/Grb2/PI3K/AKT信號通路級聯反應，促進人肺癌細胞EMT以及肺癌細胞擴散、轉移。PEZONE等[8]體外培養人正常乳腺上皮細胞（MCF10A）并通過共聚焦顯微鏡和質譜記錄分析發現，組蛋白溶酶特異性去甲基化酶1 （LSD1） 與TGF-β1誘導或抑制基因的啟動子結合后，可引發一系列DNA氧化反應，調控EMT基因的轉錄或抑制。DAVID等[9]發現調控因子Sox4可以使TGF-β誘導的EMT的胰腺導管腺癌細胞發生凋亡，而胃腸譜系主調控因子Klf5則具有拮抗Sox4凋亡作用，提示在胰腺導管腺癌細胞中EMT進程可能是受Sox4和Klf5同時調控。

本課題組前期實驗發現miR-448-5p在哮喘小鼠肺組織和TGF-β1干預后16HBE中的相對表達量均下調，同時在TGF-β1干預后的16HBE中過表達miR-448-5p可以抑制TGF-β1介導的EMT以及氣道纖維化[4]，提示ncRNA在氣道纖維化或氣道重塑中發揮作用。

本研究結果顯示，與對照組相比，處理組細胞中TBILA等lncRNA和miR-125b-5p等miRNA基因的相對表達量存在顯著差異，這些差異均發現與EMT進程的調控或組織纖維化的形成發展密切相關。如TBILA在非小細胞肺癌（NSCLC）患者腫瘤組織中以及TGF-β1處理的A549和H226細胞中表達上調，沉默或者過表達TBILA可以分別產生抑制或促進A549和H226細胞EMT作用[10]。NKILA在人肝癌組織和人肝癌細胞系中表達下調，在體外NKILA過表達則能夠顯著抑制肝癌細胞系細胞EMT[11]。體外研究結果顯示，HOTAIR在經過TGF-β1處理后的結腸癌細胞株HT-29及DLD1、乳腺上皮細胞MCF10a以及乳腺癌細胞株HCC1954中均表達上調，經siRNA干擾HOTAIR表達后，可改變TGF-β誘導的EMT進展過程[12]。LNCRNA-ATB在草酸鈣刺激人近端腎小管上皮（HK-2）細胞的EMT模型中表達上調，miR-200家族基因表達下調，干擾lncRNA-ATB表達或者轉染miR-200a模擬物均可緩解EMT進程和腎損傷程度[13]。在牛血清白蛋白（BSA）刺激的HK-2細胞和高脂飼料和鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠中NEAT1的表達均顯著上調，通過干擾或者過表達NEAT1可分別抑制或者促進BSA誘導HK-2細胞的纖維化和EMT[14]。另外，miR-125b在結直腸癌（CRC）原發灶和轉移灶中表達上調，而體外培養的CRC細胞過表達miR-125b可增強EMT的遷移能力，敲低miR-125b表達后，可以降低CRC細胞EMT的遷移和侵襲能力[15]。miR-21-5p、miR-34a-5p的表達水平在人CRC組織中較正常組織高，而miR-200c-3p的表達水平則較低，這些miRNA均與腫瘤組織的EMT相關[16]。miR-17-5p在有轉移的原發性人CRC組織中的表達量低于無轉移的原發性人CRC組織，過表達miR-17-5p后體外培養的CRC細胞EMT能力受到抑制，而抑制miR-17-5p的表達則增強了CRC細胞的EMT能力[17]。

LncRNA、miRNA及其下游基因之間還可互相調控，并形成復雜的調控網絡，參與蛋白質翻譯、合成的一系列過程，進而抑制或者促進細胞EMT以及組織纖維化。例如，lncRNA BBOX1-AS1在人NSCLC組織中，以及體外培養并經轉錄因子KLF5誘導的NSCLC細胞中均為高表達，BBOX1-AS1與miR-27a-5p競爭性結合，促進母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶表達，激活黏著斑激酶磷酸化，促進NSCLC細胞的EMT[18]。

綜上所述，本研究成功構建了EMT細胞模型，與正常細胞相比，該模型中多個lncRNA和miRNA表達具有顯著差異。這些基因間可能存在復雜的調控網絡，促進或抑制16HBE細胞EMT及其進程。后續應進行更深入的實驗研究，進一步明確各基因調控機制以及他們之間的調控關系，為氣道纖維化或氣道重塑防治方面的研究提供分子理論支持。

作者聲明：曲政海、楊召川、陳華培參與了研究設計；所有作者參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強）