代謝相關脂肪性肝病患兒外周血黏膜相關恒定T淋巴細胞的頻率、表型及功能改變

姜濤 歐陽文獻 譚艷芳 康楨 李雙杰

摘要：目的 探討代謝相關脂肪性肝?。∕AFLD）患兒外周血黏膜相關恒定T（MAIT）淋巴細胞的變化及其臨床意義。方法 選取2022年3月—2022年5月在湖南省兒童醫院就診的18例MAFLD患兒（MAFLD組）及同期20例正常對照兒童（對照組），采集外周血，流式細胞儀檢測MAIT淋巴細胞（CD3+CD161+TCRVα7.2+細胞）及其不同MAIT淋巴細胞亞型（CD4+CD8-MAIT淋巴細胞、CD4-CD8-MAIT淋巴細胞、CD4-CD8+MAIT淋巴細胞和CD4+CD8+MAIT淋巴細胞）比例，表達PD-1、CD69、穿孔素、CD107α、CXCR3、CXCR6和CCR6的MAIT淋巴細胞比例，分析MAIT淋巴細胞頻率與肝臟炎癥、脂肪含量和纖維化程度的相關性。符合正態分布的計量資料兩組間比較采用t檢驗；非正態分布計量資料兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析法。結果 與對照組相比，MAFLD組中外周血MAIT淋巴細胞比例及表達PD-1、CD69、CD107α、CXCR3、CXCR6和CCR6的MAIT淋巴細胞比例均明顯升高（P值均＜0.05）；MAIT淋巴細胞亞型中CD4+CD8-MAIT淋巴細胞、CD4+CD8+MAIT淋巴細胞所占MAIT淋巴細胞比例明顯升高（P值均＜0.001），CD4-CD8+MAIT淋巴細胞所占MAIT淋巴細胞比例降低（P＜0.001）；CD4+CD8+MAIT淋巴細胞（r=-0.474，P=0.047）和CD107α陽性MAIT淋巴細胞比例（r=-0.550，P=0.018）與ALT呈負相關。結論 外周血MAIT淋巴細胞向肝臟趨化聚集，在兒童MAFLD肝臟炎癥中發揮保護作用。

關鍵詞：黏膜相關恒定T細胞； 代謝相關脂肪性肝?。?兒童

基金項目：湖南省衛生計生委科研課題（20200695）

Changes in the frequency， phenotype， and function of mucosal-associated invariant T lymphocytes in peripheral blood of children with metabolic associated fatty liver disease

JIANG Tao， OUYANG Wenxian， TAN Yanfang， KANG Zhen， LI Shuangjie. （Department of Hepatopathy Center， Hunan Childrens Hospital， Changsha 410007， China）

Corresponding author：

LI Shuangjie， lesjie62@vip.sina.com （ORCID：0000-0002-3792-6793）

Abstract：

Objective To investigate the change in mucosal-associated invariant T （MAIT） lymphocytes in peripheral blood of children with metabolic associated fatty liver disease （MAFLD） and its clinical significance. Methods A total of 18 children with MAFLD who attended Hunan Childrens Hospital from March to May， 2022， were enrolled as MAFLD group， and 20 normal children who attended the hospital during the same period of time were enrolled as control group. Peripheral blood samples were collected， and flow cytometry was used to measure the percentages of MAIT lymphocytes （CD3+CDl61+TCRVα7.2+ cells）， different MAIT lymphocyte subsets （CD4+CD8- MAIT cells， CD4-CD8- MAIT lymphocytes， CD4-CD8+ MAIT lymphocytes， and CD4+CD8+ MAIT lymphocytes）， and MAIT lymphocytes expressing PD-1， CD69， perforin， CD107α， CXCR3， CXCR6， and CCR6. The correlation of MAIT lymphocyte frequency with liver inflammation， fat content， and fibrosis degree was analyzed. The t-test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups， and the Mann-Whitney U test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between two groups. The Spearman correlation analysis was used for correlation analysis. Results Compared with the control group， the MAFLD group had significant increases in the percentage of MAIT lymphocytes in peripheral blood， the percentages of MAIT cells expressing PD-1， CD69， CD107α， CXCR3， CXCR6 and CCR6， and the percentages of CD4+CD8- MAIT cells and CD4+CD8+ MAIT lymphocytes among MAIT cell subsets （all P＜0.05）， as well as a significant reduction in the percentage of CD4-CD8+ MAIT cells among MAIT cell subsets （P＜0.001）. The percentages of CD4+CD8+ MAIT lymphocytes and CD107α-positive MAIT lymphocytes were negatively correlated with alanine aminotransferase （r=-0.474 and -0.550， P=0.047 and 0.018）. Conclusion The migration of peripheral blood MAIT lymphocytes to the liver plays a protective role against liver inflammation in children with MAFLD.

Key words：

Mucosal-Associated Invariant T Cells； Metabolic associated Fatty Liver Disease； Child

Research funding：

Scientific Research Project of Health and Family Planning Commission of Hunan Province（20200695）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種常見的慢性肝病，包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相關肝纖維化和肝硬化［1］，部分患者甚至進展為肝癌，現在被稱為代謝相關脂肪性肝病 （metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）［2-3］，隨著肥胖發病率逐年增高和低齡化趨勢，NAFLD成為兒童慢性肝病的常見原因［4］，肝硬化的三大主要原因之一。目前MAFLD的發病機制仍不清楚，臨床上亦缺乏有效的藥物治療，因此MAFLD發病機制的研究是當前的熱點。

黏膜相關恒定T（mucosal associated invariant T，MAIT）淋巴細胞是一類新的天然免疫T淋巴細胞，是最豐富的TCRαβ+T淋巴細胞，以1類主要組織相容性復合體相關分子和不依賴MR1的方式快速激活 MAIT 淋巴細胞［5］，發揮生物學功能，釋放多種細胞因子，如IFNγ、TNFα、IL-17和溶細胞產物穿孔素及顆粒素分泌并脫顆粒（將CD107a暴露于細胞表面）等殺傷性細胞因子［6］，迅速誘導細胞溶解和靶細胞的死亡。國外相關報道［7-9］顯示MAIT淋巴細胞在成人MAFLD發病中起到減少肝臟炎癥及促肝纖維化作用，但在兒童MAFLD發病中作用的研究甚少。本研究通過分析MAFLD兒童外周血MAIT淋巴細胞的變化及其與臨床指標的相關性，探討MAIT淋巴細胞在兒童MAFLD發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2022年3月—2022年5月在本院肝病中心診治的18例MAFLD患兒（MAFLD組）的外周血標本，根據年齡匹配的20例正常兒童作為對照（對照組），其外周血標本采集于本院健康管理中心。

1.2 納入標準 MAFLD組納入標準：脂肪肝合并超重/肥胖、2型糖尿病和代謝功能障礙中至少一項特征［1-2］。同時排除合并甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒感染，自身免疫性肝病，人類免疫缺陷病毒等病毒感染。對照組納入標準：肝功能正常，無慢性疾病，近期無感染史等。

1.3 方法 人外周血免疫細胞的制備：留取MAFLD組和對照組兒童外周血3 mL，將PBS加入3 mL新鮮全血中，吸取稀釋后的外周血緩慢加到lymphoprep表面。全血在400×g室溫下離心20 min，收集第二層外周血免疫細胞并轉入含有PBS的離心管中，離心機800×g室溫下離心10 min。離心結束后去上清，再加入10 mL PBS，離心機400×g室溫下離心5 min，清洗外周血免疫細胞以徹底去除殘留的lymphoprep。

應用流式細胞儀檢測MAIT細胞，根據標準方案使用以下抗體：CD183（CXCR3）、CD279（PD-1）， CD186（CXCR6）、CD3、TCRVα7.2、CD8、CD69、CD161、CD107a、CD196 （CCR6）、CD4和穿孔素抗體進行染色，上流式細胞儀（三激光八色流式細胞分析儀，型號：FacsCantoll，產地：美國）進行分析。外周血中MAIT細胞定義為CD3+CD161+TCRVα7．2+細胞。

收集MAFLD組和對照組兒童血常規及肝功能結果，使用瞬時彈性成像檢測MAFLD組患兒的肝纖維化和脂肪含量，兒童MAFLD肝纖維化最佳臨界值為6.65 kPa［10］，區分有無脂肪變性的脂肪肝參數最佳臨界值為222.5 dB/m［11］。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用 Mann-Whitney U檢驗。MAFLD組患兒外周血MAIT淋巴細胞頻率與肝損傷、肝臟脂肪含量和纖維化相關性分析應用Spearman相關分析法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 MAFLD組18例患兒年齡波動在6.17～13.08歲，對照組20例兒童年齡波動在5.83～13.00歲。MAFLD組的中性粒細胞、ALT、AST水平高于對照組（P值均＜0.05）（表1）。MAFLD組患兒肝纖維化彈性值為5.55（4.18～7.13）kPa，脂肪肝參數為（253.85±16.40） dB/m。

2.2 兒童外周血MAIT淋巴細胞頻率比較 與對照組相比，MAFLD組患兒外周血MAIT淋巴細胞占CD3+T淋巴細胞的比例明顯升高（P＜0.001），CD4+CD8-MAIT淋巴細胞、CD4+CD8+MAIT淋巴細胞所占MAIT淋巴細胞比例明顯升高，CD4-CD8+MAIT淋巴細胞所占MAIT淋巴細胞比例降低（P值均＜0.001），CD4-CD8-MAIT淋巴細胞所占MAIT淋巴細胞比例無變化（P＞0.05）（表2）。2.3 外周血MAIT淋巴細胞表型和功能的差異 與對照組相比，MAFLD組患兒外周血表達PD-1、CD69、CD107α、CXCR3、CXCR6和CCR6的MAIT淋巴細胞比例均明顯升高（P值均＜0.05）（表3）。

2.4 MAFLD組患兒外周血MAIT淋巴細胞頻率與肝臟炎癥、脂肪含量和纖維化程度的關系

CD4+CD8+MAIT淋巴細胞和CD107α陽性MAIT淋巴細胞比例與ALT呈負相關（P值均＜0.05）；MAIT淋巴細胞、CD4+CD8-MAIT淋巴細胞、CD4-CD8+MAIT淋巴細胞比例與ALT無相關性（P值均＞0.05）；MAIT淋巴細胞、CD4+CD8-MAIT淋巴細胞、CD4-CD8+MAIT淋巴細胞、CD4+CD8+MAIT淋巴細胞和CD107α陽性MAIT淋巴細胞比例與AST、瞬時彈性成像中脂肪肝參數以及彈性值均無相關性（P值均＞0.05）（表4）。

3 討論

MAIT 細胞與代謝功能障礙的發展有關，肥胖兒童外周血MAIT細胞頻率高于非肥胖兒童［12］，其頻率隨著肥胖人群年齡的增長而下降，糖尿病和肥胖成人外周血MAIT細胞頻率降低［13-15］，肥胖成人和兒童中的高IL-17+表型在胰島素抵抗發展中發揮著重要作用［12，16］。目前MAIT淋巴細胞在MAFLD發病中作用機制的研究主要集中在成人，研究發現，MAFLD患者中循環MAIT淋巴細胞頻率降低［7-9，17］，伴隨著CXCR6表達的增加，而肝臟中MAIT淋巴細胞數量則明顯增加，與MAFLD活動評分呈正相關［8］。本研究發現，MAFLD患兒外周血MAIT淋巴細胞頻率明顯升高的同時伴有趨化因子CCR6、CXCR6、CXCR3表達的增加，表明MAFLD患兒外周血MAIT淋巴細胞亦具有更強的遷移至肝臟的傾向［8］，MAFLD患者外周血MAIT淋巴細胞頻率的變化亦有著隨著年齡增長而有下降的趨勢，而這種下降的趨勢可能與其遷移至肝臟有關。MAIT淋巴細胞可分為DP（CD4+CD8+）MAIT淋巴細胞、CD4+CD8-（CD4+）MAIT淋巴細胞、CD4-CD8+（CD8+）MAIT淋巴細胞和CD4-CD8-（DN）MAIT淋巴細胞。本研究發現健康兒童中以CD4-CD8-MAIT淋巴細胞和CD8+MAIT淋巴細胞為主［18］，而MAFLD組患兒中以CD4-CD8-MAIT淋巴細胞和CD4+CD8+MAIT淋巴細胞為主，且與對照組相比，MAFLD組患兒CD4+MAIT淋巴細胞和CD4+CD8+MAIT淋巴細胞所占MAIT細胞比率升高，CD8+MAIT淋巴細胞所占MAIT淋巴細胞比率降低。

MAIT淋巴細胞在MAFLD中的作用為保護還是促進作用，與其所處疾病階段有關。MAFLD成人患者中，外周血MAIT淋巴細胞降低的同時伴隨著功能的改變，高表達CD69、PD-1及IL-4的產生增加，而IFNγ和TNFα的產生減少等。在蛋氨酸膽堿缺乏誘導的NASH模型中，MAIT細胞在肝臟中富集，并通過產生 IL-4和IL-10以及誘導抗炎M2巨噬細胞來保護肝臟炎癥［8］。隨著病情的進展，肝內MAIT淋巴細胞的頻率下降，在肝硬化和肝細胞癌的進展中起到促進作用［7，17，19］。本研究發現，MAFLD患兒外周血MAIT淋巴細胞水平明顯升高的同時，伴有CD69、PD-1及CD107表達的增加，提示MAIT淋巴細胞被激活并功能性耗竭的同時，伴隨著細胞毒性能力的增加。進一步研究顯示CD4+CD8+MAIT淋巴細胞、CD107陽性MAIT淋巴細胞比例與ALT水平呈負相關，說明MAFLD患兒外周血MAIT細胞在肝臟炎癥中具有保護作用，與文獻［8］報道一致。

綜上所述，MAIT淋巴細胞比例在MAFLD患兒外周血中明顯升高，并在肝臟炎癥中起著保護作用。本研究的局限性在于樣本量偏少，進展期肝纖維化患兒病例數少，未檢測肝臟組織MAIT淋巴細胞數量和其功能改變，MAIT淋巴細胞在兒童MAFLD發病中確切的免疫學機制及作用尚待進一步明確。

倫理學聲明：本研究方案于2020年4月30日經由湖南省兒童醫院倫理委員會審批，批號：HCHLL-2020-38，所納入患兒家屬均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：姜濤和譚艷芳負責課題設計，資料分析，撰寫論文；康楨參與收集數據，修改論文；歐陽文獻和李雙杰負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：

2022-10-21；錄用日期：2022-12-06

本文編輯：林姣