甘蔗遺傳轉化與基因編輯技術研究進展

黃堂偉 許譽芝 黃振

摘 要：甘蔗遺傳背景復雜，采用常規育種方法進行甘蔗品種選育耗時較長，對親本的要求也較高，雜交后代分離嚴重，且會攜帶一些不需要的基因。利用基因工程可定向導入特定性狀的基因，從而培育具有高產量和高價值的作物。文章在系統描述各種遺傳轉化和轉基因技術的基礎上，分析農桿菌介導的遺傳轉化法、基因槍介導的遺傳轉化法、電穿孔轉化法和聚乙二醇（PEG）介導法，發現主要的使用方法為農桿菌轉化法和基因槍轉化法，電穿孔轉化法和PEG介導法存在干擾因素較多，其主要問題是轉化效率低、轉基因株系鑒定結果不明確，還需進一步完善。基因編輯技術主要是RNAi沉默法和CRISPR編輯法，但甘蔗基因組研究還未取得突破性進展，因此基因編輯仍以基因沉默法為主要手段，可供甘蔗育種中進行遺傳轉化和轉基因技術應用時借鑒。

關鍵詞：甘蔗；基因工程；CRISPR技術；分子標記；轉基因

中圖分類號：S566.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：2095-820X（2023）06-0027-07

收稿日期：2023-10-28

基金項目：廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（2023KY1233）；廣西農業職業技術大學校級科研項目（XKJ2316）

通訊作者：黃振（1994-），男，講師，主要從事甘蔗育種研究工作，E-mail：huangzhenhn@163.com

第一作者：黃堂偉（1988-），男，講師，主要從事作物栽培及育種研究工作，E-mail：huangtw@gxnzd.edu.cn

0 引言

甘蔗是全球第一大糖料作物，也是重要的能源作物，世界糖產量的75%來源于甘蔗，而我國85%以上的糖產量來源于甘蔗［1］，因此，保證糖料供應是保障國家蔗糖安全的重要舉措。甘蔗作為異源多倍體作物，遺傳背景復雜，生長周期較長，進行傳統育種困難較多，很難同時改變多種不良性狀［2］。目前我國登記的甘蔗品種較多，但商業化種植品種依然較單一，只有新臺糖（ROC）、桂糖和桂柳系列等［3］。甘蔗育種主要目標為高糖、高產、抗病、抗蟲、抗旱、宿根性長和適宜機械收割等，但通過常規育種很難達到目的。轉基因技術具有縮短育種時間、按需導入目的基因和避免常規育種出現大量基因重組所導致的復雜篩選過程等優勢［4］。通過轉基因育種技術，在重要糧食作物、經濟作物及園藝作物增產、抗逆和改善品質等方面已取得重大突破，培育了性狀優異的小麥［5，6］、玉米［7］和水稻［8］等作物新品種。由于甘蔗直接用于榨糖或制備能源燃料，沒有人類直接食用過程，所以轉基因甘蔗株系不會對人體造成負面影響。因此，在國際上轉基因甘蔗被認為是風險最低（I級）的轉基因作物，科研工作者已在不斷探索基因工程在甘蔗上的應用前景，發現其具有巨大應用潛力［9］。文章對植物的遺傳轉化方法和轉基因技術進行系統綜述，并討論目前適合于甘蔗轉基因育種的方案。在此基礎上闡述甘蔗通過轉基因技術育種存在的困難，分析甘蔗轉基因技術培育新品種的解決方案，針對存在的轉化效率低、轉基因株系鑒定結果不明確和愈傷組織培育易水漬化和褐化等問題，探討解決方法，旨在為甘蔗遺傳轉化和轉基因技術應用提供借鑒。

1 轉基因技術

1.1 農桿菌轉化法

農桿菌是一種土棲革蘭氏陰性細菌，具有將Ti質粒的一部分移動并整合到被感染植物細胞核中的天然能力［10］。利用農桿菌的這種能力，Fraley等［11］已通過其開發的缺乏腫瘤形成基因的改良農桿菌菌株，將目的基因轉移到植物中。利用該農桿菌進行遺傳轉化具有轉化效率較高、轉運的DNA片段經常作為單一拷貝集成并穩定遺傳給后代及設備成本低等優點［12，13］。此外，較少的基因整合至受體植物基因組可防止目標基因被沉默［14］。

根癌農桿菌介導的遺傳轉化是雙子葉植物中常規的基因轉移方法。禾本科單子葉植物不是農桿菌的天然寄主，所以禾本科作物一直被認為是難以應用農桿菌介導轉化的物種。這是因為單子葉植物特別是草類，很少或不分泌酚類化合物［15］，且在細胞上缺乏依賴于根癌農桿菌的受體位點，降低了T-DNA啟動子在單子葉植物中的活性［16］。但農桿菌轉化單子葉植物已取得突破性進展，通過使用分生組織轉化［17，18］、添加信號分子、使用單子葉植物啟動子［19］和超強農桿菌菌株等，根癌農桿菌介導的單子葉植物轉化體系已經成熟［20］。禾本科植物水稻的農桿菌侵染轉化法已較成熟，與甘蔗遺傳轉化相關的研究也快速進展［21］。Arencibia等［21］在1998年建立了基礎性的農桿菌介導甘蔗遺傳轉化體系，為此后的研究提供了借鑒。Enríquez-Obregón等［22］采用農桿菌侵染甘蔗愈傷組織，獲得了抗除草劑的轉基因甘蔗植株。滕崢等［23］利用農桿菌介導法，將外源冷調節基因Cbcor15a導入甘蔗愈傷組織，建立了高效、快速的甘蔗遺傳轉化體系，為抗寒性甘蔗品種培育奠定了基礎。Matusuoka等［24］利用甘蔗品種的愈傷組織和細胞懸浮培養物進行遺傳轉化，其雙元載體pMLH7133-GUS含有新霉素磷酸轉移酶nptII基因、潮霉素磷酸轉移酶hpt基因和uidA基因，根癌農桿菌菌株為EHA101和LBA4404。李曉梅等［25］以川蔗23號甘蔗品種誘導的胚性愈傷組織為受體材料，首次利用較低濃度農桿菌侵染液（OD600≈0.1）和較短的侵染時間（1.5 min）成功實現了Bt（cry1Ab）基因在甘蔗上轉化。NPTII蛋白在胃腸道很容易降解，對人體不產生有害影響，1994年美國環境保護局確認其為安全蛋白，可用于商業用途［26］。通過農桿菌轉化系統和基因槍轉化系統可將NPTII基因為篩選標記基因的載體成功轉化至甘蔗品種Q117，為甘蔗轉基因方案提供借鑒［27，28］。

目前，農桿菌轉化法用于甘蔗遺傳轉化還存在愈傷組織分化效率較低導致轉化率較低、培養階段農桿菌在愈傷組織中很難被清除干凈導致污染嚴重、愈傷組織培養易發生水漬化和褐化及轉基因株系未能利用Southern blot技術鑒定等不足［29］。

1.2 基因槍法

20世紀80年代發展起來的基因槍介導的遺傳轉化技術，為植物基因工程提供了一種更簡便的方法［30］。利用基因槍轉化技術進行植物基因轉化較簡便，無明顯的宿主限制，幾乎適用于任何受體材料，且僅需進行簡單的組織培養，無需經過復雜的原生質體制備和培養階段。基因槍轉化技術對改善單子葉植物中具有較長生長時間物種的性狀更有效［31］。Bower和Birch［29］通過利用包被DNA的微粒高速轟擊胚胎愈傷組織，首次獲得轉基因甘蔗植株，還發現對愈傷組織的轟擊速度較對懸浮細胞更高。在單子葉植物啟動子Emu的作用下將NPTⅡ基因轉化到甘蔗中，通過ELISA和Southern blot可驗證轉化株系，如在1993年用基因槍將GUS基因導入甘蔗愈傷組織，并檢測到GUS基因的表達［32］；隨后，Franks和Birch［31］、Arvinth等［32］、Christy等［33］、Rathus和Birch［34］研究發現，GUS和GFP基因可作為報道基因廣泛用于檢測轉基因甘蔗。隨著對基因槍法的研究越來越深入，越來越多的轉基因甘蔗相繼出現。張樹珍和鄭學勤［35］通過基因槍法分別用植物表達載體pBT和pUBT轉化甘蔗，再生植株的Southern雜交結果表明海藻糖合酶基因已整合到甘蔗基因組中。

在抗蟲方面，已報道的抗蟲基因有Cry1Ab基因、抑肽酶基因和Cry1Aa3基因［32，33，36］。Christy等［33］通過基因槍介導的轉化法將馬鈴薯蛋白酶抑制劑II和雪蓮凝集素基因轉入甘蔗，可得到抗螟蟲甘蔗。Arvinth等［37］應用共轉效率較高的3種載體，用基因槍將Cry1Ab基因轟入2個巴西甘蔗栽培品種，也獲得抗螟蟲的轉基因品種，隨后通過抗性篩選、PCR檢測分析、生物測定和ELISA測試，證實基因已經整合到甘蔗品種中。

應用基因槍法進行高效率遺傳轉化也存在不足，如需解決選擇哪個植物組織培養階段更合適問題，嵌合體多、外源基因插入拷貝數較多及所獲得轉基因株系遺傳穩定性較差問題，微彈對甘蔗原生質體傷害較大問題。因此，還需對基因槍的參數進行優化［34］。

1.3 電穿孔法

與應用基因槍法成本高和效率低及農桿菌轉化法對受體基因型依賴性強和新植株體易褐化相比，電穿孔法已廣泛應用于將外源大分子DNA（目的基因）轉入受體細胞中，具有操作簡單、快速和成本低等特點，常以原生質體為受體，所有細胞在轉化后處于相同生理狀態，方便觀察和比較［38］。Negrutiu等［39］研究表明，以電穿孔法對甘蔗的原生質體進行轉化可獲得再生甘蔗，為進一步完善制備甘蔗原生質體技術提供依據。Arencibia等［21］于1995年用電激法將攜帶CaMV35p-Gus-Nos基因的pBI121質粒導入商業品種POJ2878和J60-5的胚性愈傷組織，電激后6～8周，經GUS組織染色法和進行Southern雜交證實得到轉基因甘蔗。樂花花等［40］、薛飛等［41］研究指出，利用電穿孔法進行植物原生質體轉化，增加載體DNA濃度可提高基因轉移效率，但轉移效率受電場強度、脈沖持續時間、施加脈沖數量及電穿孔介質組成的影響。因此，進一步開展電穿孔技術研究對于甘蔗遺傳轉化可產生更大的促進作用。

1.4 聚乙二醇（PEG）介導法

PEG是植物遺傳轉化最常用的化學誘導劑。Chen等［42］利用PEG為轉化劑，將構建好的質粒轉化至甘蔗愈傷組織，并通過探針雜交獲得轉基因株系。雖然PEG介導法仍存在一些局限性，但優點在于原生質體可在不同植物種類中分離和大量轉化。此外，基于氯化鎂和PEG協同作用的電穿孔轉化原生質體記錄非常有效。

2 基因編輯新技術

2.1 CRISPR/Cas9系統的發現與機理

CRISPR/Cas系統發現于細菌和古生菌，最初是一段由長度為29 bp的重復片段和32～33 bp的非重復片段間隔相連的重復序列［43］，能為其自身提供一種獲得性免疫保護機制，把入侵的DNA整合到自身的DNA片段上，形成前體crRNA，并在tracrRNA協同幫助下最終形成成熟的crRNA；成熟的crRNA引導Cas蛋白復合物對入侵者進行定點切割從而抵御質粒DNA和外源病毒入侵。CRISPR/Cas9系統由Ⅱ型CRISPR系統改造而來，由Cas9蛋白和sgRNA組成，在sgRNA的引導下通過識別保守的間隔相鄰基序，Cas9蛋白可對目標DNA進行特異性剪切。目標DNA斷裂后，CRISPR/Cas9系統啟動修復機制，其中，細胞的非同源末端連接修復（NHEJ）機制重新連接斷裂處的基因組DNA，并引入插入或缺失突變；同源重組修復（HDR）機制需有其模板參與，在斷裂處插入或替換基因片段［44］。但CRISRP/Cas9系統也存在脫靶問題，對該技術的優化還需進一步探究。

2.2 CRISRP/Cas9系統在植物基因編輯中的應用

邢慧麗［45］通過優化條件建立了一套可高效應用于單子葉和雙子葉植物的CRISPR/Cas9基因組編輯方法，為植物基因功能研究提供了有用工具。Shan等［46］通過優化的化膿鏈球菌Cas9（SpCas9），在兩端附著核定位信號（NLS）并表達sgRNA轉錄物，設計了2個靶向水稻八氫番茄紅素脫氫酶基因OsPDS的不同DNA鏈sgRNA，SP1和SP2破壞水稻原生質體中的內源基因，從原生質體培養18 h開始，檢測到有效（15%）的定向誘變，通過PCR/限制性內切酶（PCR/RE）分析以檢測2個靶區域的突變，實現在水稻和小麥中進行定點修飾。Shan等［46］、Walt［47］利用根癌土壤桿菌介導的瞬時表達測定法（農桿菌浸潤法）在模式植物煙草中共表達具有真核細胞核定位信號和sgRNA的Cas9變體，指出在擬南芥和煙草中應用CRISPR/Cas9系統可進行基因修飾；Miao等［43］通過密碼子優化Cas9蛋白，在水稻中獲得含有分蘗夾角控制基因LAZY1和葉綠素合成基因CAO1的突變植株。

2.3 CRISPR/Cas9在作物育種上的應用

王延鵬等［48］利用基因組編輯技術，首次在六倍體小麥中獲得對白粉病具有廣譜抗性的TaMLO基因3個拷貝同時突變的材料；Zhou等［49］利用CRISPR/Cas9系統敲除水稻溫敏型雄性不育TGMS基因，得到11個新的雄性不育品系，加快了不育系的培育過程，而且有利于雜種優勢利用；Shi等［50］在玉米中利用CRISPR/Cas9系統改造乙烯反應負調控因子ARGOS8基因的啟動子區域，獲得了新的抗旱玉米品種。美國農業部2016年4月的批文顯示，美國政府許可CRISPR基因組編輯的生物可直接用于種植和銷售，無需額外對CRISPR改造的農作物進行監管，為基因編輯技術用于農產品的商業生產帶來了光明前景［47］。CRISPR/Cas系統目前屬于新型定點編輯技術，對甘蔗轉基因育種進程的推動具有重要意義。

3 分子標記輔助育種

分子標記技術從20世紀70年代開始在植物形態學上應用，利用分子標記輔助選擇引起了植物育種家的重視，并已用于建立小麥、玉米和水稻等基因圖譜［51］，構建了18張關于甘蔗分子遺傳連鎖圖譜，使用標記數為1500～2000個［52］，使用的分子標記包括AFLP基因［53］、RFLP基因［54］、TRAP基因［55］、EST-SSR基因［55］和DART基因［56］等，但要想得到覆蓋整個甘蔗基因組的遺傳圖譜，需更多的單核苷酸多態性（SNP）標記。此外，通過QTL定位對甘蔗相關性狀進行研究，已獲得部分與抗病、抗逆、產量、糖分及農藝性狀相關的數量性狀座位（QTL）位點［57］。

4 結語

隨著育種技術和栽培方法的不斷完善，甘蔗的產量和蔗糖含量已得到大幅度提升。通過傳統育種、選種和利用基因編輯技術，已獲得高糖（F2KP）、抗病（SrMV-P1）、抗蟲（Cry1Ac）及抗旱、抗寒和易脫葉甘蔗優良品種［4］。目前，在甘蔗轉基因品種利用方面，CTB141175/01-A（CTC 20 BT）是由巴西甘蔗育種技術公司（Centro de Tecnologia Canavieira，CTC）研發、已通過巴西批準的商業化轉基因抗蟲甘蔗品種，也是世界上第一個獲得商業化生產許可的轉基因甘蔗品種；2013年由Persero公司（印度尼西亞）研發的轉基因抗旱甘蔗NXI-1T、NXI-4T和NXI-6T僅獲得印度尼西亞食用和環境安全證書而未實現商業化；Zhao等［58］通過轉基因技術構建了抗蚜蟲甘蔗株系；廣西大學甘蔗研究課題組通過基因槍介導的遺傳轉化技術，已初步獲得轉基因甘蔗株系，但基因槍介導法還需進一步優化以提高轉化效率［59］。由此可見，基因工程是快速實現作物性狀定向改變的有力工具，在提高作物遺傳潛力方面具有很大前景。根癌農桿菌雖然是最常用的基因傳遞系統，可使目的基因穩定轉化進入受體基因組，但試驗方案還需進一步優化。目前，農桿菌轉化法、基因槍介導的轉化法、電穿孔法、PEG介導法等轉基因方法已應用于轉化目的基因，新型基因定點編輯技術和分子標記技術已應用于甘蔗性狀選育，以及有分子生物學、生物信息學、遺傳學和新一代測序技術等作為甘蔗品種選育的支撐，相信異源多倍體甘蔗在基因組編輯及突破性新品種選育方面會取得新的突破。

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（責任編輯 陳 燕）