防火林帶景觀樹種枯落物的高效降解真菌篩選及效果評估

徐明　王偉偉　李沛峰等

關鍵詞：防火林帶；枯枝落葉；高效降解菌；降解效果

中圖分類號：S762.3+3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1498（2023）01-0132-06

近年來，隨著林業生態建設的不斷發展，森林資源和蓄積量的不斷增加，森林防火面臨的形勢愈發嚴峻。江蘇蘇南丘陵山區名勝古跡眾多，人文活動頻繁，森林火災潛在隱患巨大。亟待構建彩色樹種防火林帶，可在有效阻減森林火災的同時，形成彩色景觀的防火林帶，對于實現我省丘陵山區防火樹種“珍貴化、彩色化、效益化”，保護森林生態環境，筑牢生態防火屏障，促進美化景觀、發展旅游和丘陵山區鄉村振興的意義重大。

防火林帶林下可燃物是影響林火發生與蔓延的重要因子。目前，美國、加拿大等國均研制出了加快可燃物的降解及循環技術。地球纖維素每年通過光合作用更新量為4.0×1010億噸，但其中只有極少部分為人們所利用。目前，降解纖維素的方法較多，有生物、化學等方法，但微生物降解是最為關注的。降解纖維素的微生物有真菌、細菌和放線菌等微生物；國內外主要的研究集中在木霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、漆斑霉屬等絲狀真菌上。目前主要是用真菌來發酵生產纖維素酶，國內外已經對這幾種菌進行比較透徹的研究，尤其是對木霉屬菌的研究，普遍認為它是纖維素酶的高產菌株。另外，綠色木霉（Trichoderma viride）和黑木霉（Aspergillus niger）被認為是產纖維素酶最穩定和無毒安全的菌種。康氏木霉（T.koningii）、擬廉氏木霉（T.pseudokoningii）也是目前較好的纖維素酶生產菌。因此，從自然界中分離生長快，產酶活力高的纖維素降解菌尤為重要。為了充分利用這些可再生資源，本研究立足于防火林帶景觀樹種，引進并篩選出一批木纖維素降解真菌，通過單因素和聯用試驗和優化，以期通過優化菌株及其聯用組合加快防火林帶景觀樹種的枯枝落的降解速度，達到進一步有效利用資源和減少森林火災的目的。

1材料與方法

1.1試驗區概況

試驗地點位于南京市南郊牛首山南的江蘇省林業科學研究院實驗林場（118°25′63″E，32°01′88″N）。該區屬北亞熱帶季風氣候，光熱條件兼有南北之長。年均氣溫15.4℃、年日照2116 h，全年無霜期229d，年降水量1000～1050 mm，秋冬降水量少，較為干燥，是林火高發期。南京市南郊常見鄉土木本植物品種有355余種。

1.2材料

1.2.1測試的防火樹種 木荷（Schima superba Gardn.et Champ.）、紅楠（Machilus thunbergii Sieb.et Zucc.）、檫樹 （Sassafras tsumu Hemsl.）、北美楓香（Liquidambar styraciflua L.）、紅果冬青（llex purpurea Hassk）、油樟（Cinnamomum

longipaniculatum（Gamble）N.Chao ex H.W.Li）、紅花深山含笑（Michelia maudiae Dunn）、楊梅（Myrica rubra （Lour.）S.et Zucc.）、桂花（Osmanthus fragrans （Thunb.）Lour.）、油茶（Camellia oleifera Abel.）、茶樹（Camellia sinensis （L.） O.Ktze）、紅葉石楠（Photinia×fraseri Dress）共12種景觀樹種。

1.2.2樣品采集 采樣時間為2021年4月8日；采樣地點為南京南郊丘陵山區院實驗林場；樣品采集地的立地條件要求基本一致。在林帶下層收集和修剪枯枝、落葉，裝入保鮮袋并帶回實驗室；枯枝落葉為實驗取樣選擇材料，落葉剪取落葉條，枯枝落葉剪成2～3 cm后烘干、粉碎處理后冷藏待用。

1.2.3選用菌種 綿皮臥孔菌（Postia placenta 5608） （Pp）、云芝（Polystictus versicolor 83971） （Pv）、黑曲霉（Aspergillus niger var.niger 86958） （An）、雷斯青霉 （Penicillium raistrickii 87589） （Pr）、繩狀青霉（Penicillium funiculosum 82491） （Pf）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum 51675）（Th）、木霉（Trichoderma atroviride 88573）（Ta）、木霉（Trichoderma citrinoviride 81905）（Tc）、木霉（Trichoderma erinaceum 51932）（Te）、康寧木霉（Trichoderma koningii 84489）（Tk₁）、康寧木霉（Trichoderma koningii 87659）（Tk₂）等菌種由中國微生物菌種保藏管理委員會林業微生物中心（cfcc）提供。

1.3試驗方法

1.3.1落葉降解試驗 將11種菌株接種到液體PDA培養基中制備菌液，30℃、160r·min^-1搖床培養5d，在裝有1cm×5 cm的紅葉石楠等12種供試樹種的落葉條的赫奇遜氏無機鹽培養基（30mL）中接入1mL菌液，30℃、160r·min^-1搖床培養10 d；對照為無菌赫奇遜氏無機鹽培養基培養的落葉條。根據落葉的斷裂程度判斷降解效果（分五級指數）：0級為落葉邊緣膨脹；1級為落葉整齊膨脹并彎曲變形；2級為落葉膨脹加大并少量斷裂；3級為落葉1/2塊狀膨脹并斷裂；4級為整塊狀膨脹并斷裂。防火林帶景觀樹種落葉降解效果1%=（對照ID-處理ID），對照ID×100計算，ID為試驗防火林帶景觀樹種落葉降解指數。

1.3.2枯枝落葉失重試驗 ①不同菌株對枯枝落葉失重篩選試驗。接種11種菌株到液體發酵培養基中制備菌液，30℃、160r·min^-1搖床培養5d；將12種供試枯枝落葉在105℃烘至質量恒定，以烘干的1g供試枯枝落葉為唯一碳源配制液體發酵培養基，接入1mL菌液，30℃、160r·min^-1搖床培養10 d，將發酵液過濾并將殘留纖維素烘干稱量質量，用減重法計算出失重率；②單種和聯用混用組合菌株對枯枝落葉失重效果試驗。用從11種菌株中選出的3株強降解菌株，分別設1、2、3、1+2、2+3和1+3共6個單種和聯用混用組合菌株，對照為無菌赫奇遜氏無機鹽培養基培養的枯枝落葉，并將6個組合菌株接種到液體發酵培養基中制備菌液，30℃、160r·min^-1搖床培養5d；將選出的檫樹、紅葉石楠、木荷3抗火樹種的供試枯枝落葉在105℃烘至質量恒定，以烘干的1g供試枯枝落葉為唯一碳源配制液體發酵培養基，接人1mL菌液，30℃、160r·min^-1搖床培養10 d，將發酵液過濾并將殘留纖維素烘干稱量質量，用減重法計算出失重率。③菌株聯用混用與單用對枯枝落葉降解失重增效果1%=（混用失重率-單用失重率）／單用失重率）計算。

1.4數據統計分析

所有試驗數據均為重復3次的平均值，采用Duncan法作處理間差異多重比較。

2結果與分析

2.1不同菌株對防火林帶景觀樹種落葉的降解效果

通過對12種防火林帶景觀樹種落葉的降解實驗比較，研究11株菌株對落葉的降解能力。經為期10 d的落葉降解實驗發現：綿皮臥孔菌（Pp）對12種防火林帶景觀樹種落葉的降解能力最高，其降解率為44.62%±2.93%，康寧木霉（Tk₁）和云芝（Pv）對12種防火林帶景觀樹種落葉的降解能力次之，其降解率分別為43.88%±2.50%和43.44%±1.71%，試驗說明3株菌株對12種防火林帶景觀樹種落葉均有很強的降解效果，且降解能力明顯高于其他8株菌株（表1）。

2.2不同菌株對防火林帶景觀樹種枯枝落葉的降解失重效果

經為期10 d的枯枝落葉的降解失重實驗，結果表明，11株菌株對12種防火林帶景觀樹種枯枝落葉均有一些的降解失重效果；但康寧木霉（Tk₁）對12種防火林帶景觀樹種枯枝落葉的降解失重效果最高，其降解失重率為54.33%±2.79%；綿皮臥孔菌（Pp）和云芝（Pv）2株菌株次之，其對12種防火林帶景觀樹種枯枝落葉的降解失重率分別為53.22%±4.02%和53.91%±2.28%，說明3菌株對12種防火林帶景觀樹種枯枝落葉均有明顯的降解失重能力，其它8菌株的降解失重效果較差（表2）。

2.3強降解菌株及其聯用對防火林帶景觀樹種枯枝落葉降解失重效果

通過3強降解菌株單用及聯用對防火林帶3種景觀樹種的枯枝落葉降解失重實驗，研究它們對枯枝落葉的失重效果。10d的降解失重實驗表明，3種防火林帶景觀樹種的枯枝落葉降解失重效果明顯。①檫樹的枯枝落葉經Pp、Pv和Tk₁的單一菌株液處理，降解失重率分別為57.8%、53.8%和58.1%，經Pp+Pv、Pv+Tk₁和Pp+Tk₁聯用混合菌株處理，降解失重率分別為65.2%、63.9%和67.3%，試驗說明菌株混合聯用能明顯提高對檫樹枯枝落葉降解失重效果。②紅葉石楠的枯枝落葉經Pp、Pv和Tk₁的單一菌株液處理，降解失重率分別為54.9%、51.8%和54.7%，經Pp+Pv、Pv+Tk₁和Pp+Tki聯用混合菌株處理，降解失重率分別為62.4%、60.7%和63.563.5%.試驗也說明菌株混合聯用能明顯提高對紅葉石楠枯枝落葉降解失重效果。③木荷的枯枝落葉經Pp、Pv和Tk₁的單一菌株液處理，降解失重率分別為53.1%、52.0%和52.7%，經Pp+Pv、Pv+Tk₁和Pp+Tki聯用混合菌株處理，降解失重率分別為59.0%、56.3%和60.8%，試驗也說明菌株混合聯用能明顯提高對木荷枯枝落葉降解失重效果。強降解菌株及其聯用對三防火林帶景觀樹種枯枝落葉降解失重效果試驗也同樣說明，落葉樹種檫樹的降解失重率略高于常綠樹種紅葉石楠和木荷（圖1）。

3討論

林木腐朽真菌廣泛存在于各種枯死的樹干、倒木、枯枝落葉及人工木制品上，通過分泌產生各種生物酶，降解木材中的纖維素、半纖維素和木質素，在森林生態系統中起著關鍵作用，是生態系統分解者中的重要成員。但同時它們也能引起林木病害，造成林業生產上的損失；而通過選擇和優化菌株加快防火林帶景觀樹種枯枝落葉的降解，減少林地枯枝落葉載量，有利于預防森林火災的發生。不同菌株降解實驗表明綿皮臥孔菌（Pp）、康寧木霉（Tk₁）和云芝（Pv）對防火林帶景觀樹種落葉均有很強的降解效果，相對其它8菌株的降解效果略差一些，因此，研究發現強降解真菌和對其進一步優化組合非常必要。

森林土壤、林下枯落物和腐爛木材中具有豐富的微生物多樣性，其中很多類型的微生物可能降解植物主要部分并將營養成分釋放到環境中，從而參與養分循環。當Laccase和MnP分別單獨存在時，都不能有效的降解木質素，而2種同時存在則木質素得到了有效的降解，這表明2種酶在催化木質素生物降解反應中具有協同作用。本研究發現的3強降解菌株通過聯用也能明顯提高對檫樹、紅葉石楠和木荷枯枝落葉降解失重效果，說明協同作用的存在，且明顯高于Pp、Pv和Tk₁的單一菌株處理的降解效果；強降解菌株單用及聯用對落葉樹種檫樹的降解效果略高于常綠樹種紅葉石楠和木荷，這可能與常綠樹種革質層厚和葉面蠟質層厚有關。

平板對峙試驗表明，自主篩選復配的復合生防菌劑（Trichoderma viride.XP1， Bacillusamyloliquefaciens.XP2）對Foc具有顯著的抑菌效果。通過盆栽試驗探討復配復合生防菌劑防控香蕉枯萎病發生的效果，為其生物防治機制提供理論支撐。本研究發現的Pp+Pv、Pv+Tk₁和Pp+Tk₁3組混合聯用菌株能明顯提高對枯枝落葉的降解效果，也為研制復合生防菌劑打下了良好基礎。

4結論

通過11菌株對12種防火林帶景觀樹種枯枝落葉的降解實驗，篩選出綿皮臥孔菌（Pp）、康寧木霉（Tk₁）和云芝（Pv）3株強降解菌株；3菌株單用及其聯用對檫樹、紅葉石楠和木荷枯枝落葉降解失重率分別為54.3%±2.3%和62.1%±3.3%。篩選出的3菌株單用（Pp、Pv和Tk₁）及其聯用組合，Pp+Pv、Pv+Tk₁和Pp +Tk₁3組混合聯用菌株對枯枝落葉的降解效果明顯提高，廣大應用能為復合生防菌劑研發和大規模有效降解林間枯落物，減輕森林火災，其前景廣闊。